酶解糖化滇黃精多糖的結(jié)構(gòu)表征及其免疫活性

黃俊源，袁晚晴，蘇藝，楊淑婷，黎攀，陳建萍，杜冰＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，中國(guó)香港 999077）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl,et Hemsl,P.kingianum）是百合科黃精屬植物，主要分布在我國(guó)云南[1]，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且具有傳統(tǒng)的藥食同源用途而備受青睞[2]。多糖是黃精中的主要活性成分之一，其免疫調(diào)節(jié)、防止氧化損傷、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松和抗炎等功能已得到廣泛的研究[3]。

隨著現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)健康愈發(fā)關(guān)注，消費(fèi)者和行業(yè)都在尋找自然、安全的免疫調(diào)節(jié)材料[4]。多糖被認(rèn)為在人體內(nèi)和體外具有增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)作用，并逐漸成為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的一種重要角色[5]。研究表明，黃精多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞具有促增殖作用并對(duì)細(xì)胞分泌一氧化氮（NO）有明顯的促進(jìn)作用[6]，具有成為免疫調(diào)節(jié)劑的潛力[7]。然而，黃精多糖的結(jié)構(gòu)特征與免疫活性密切相關(guān)，包括單糖組成比例、官能團(tuán)類(lèi)型和糖苷鍵連接方式等，而不同的加工、炮制和提取方式則會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)特征產(chǎn)生顯著的影響[8,9]。酶解糖化是食品加工的一項(xiàng)常用的技術(shù)，通過(guò)酶的催化作用將復(fù)雜的碳水化合物分解成簡(jiǎn)單的單糖，例如葡萄糖和果糖等[10]，還能給微生物發(fā)酵提供大量所需的糖類(lèi)物質(zhì)，促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行。課題組前期發(fā)明了一種新的黃精酶解糖化工藝[11]，但該新工藝下的黃精多糖結(jié)構(gòu)仍鮮有報(bào)道。本研究旨在分析酶解糖化黃精多糖（Enzymatic SaccharifyP.kingianumPolysaccharide，SPKP）結(jié)構(gòu)特征，并通過(guò)對(duì)免疫活性的研究對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮滇黃精購(gòu)于云南省普洱市，經(jīng)香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院首席講師陳建萍博士鑒定為4 年生百合花滇黃精的干燥根莖，多糖含量占28.2%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版的要求。α-淀粉酶（耐高溫POWERLIQ 型）A30278G190，杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司；高效糖化專用酶SGA 2.0 S 型，山東隆科特酶制劑有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich；RAW264.7 細(xì)胞從中山大學(xué)藥學(xué)院獲??；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），Gibco公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒CCK8，SEVEN公司；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

光柵型酶標(biāo)儀VersaMax，美國(guó)Melecular Devices公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)Evolution 300，賽默飛世爾科技有限公司；冷凍干燥機(jī)ALPHA 2-4 LDplus，德國(guó)Christ 公司；傅立葉變換紅外光譜儀Vertex 70，德國(guó)布魯克公司；掃描式電子顯微鏡EVO MA 15，德國(guó)ZEISS 公司；離子色譜儀ICS5000，ThermoFisher 公司；氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀6890-5973，Agilent Technologies 有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解糖化黃精多糖制備

將鮮黃精塊莖去除須根后清洗去皮，稱取200 g按料液比1:2 加水混合，加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.5%的CaCl2溶液，添加50 μLα-淀粉酶后于85 ℃下水浴加熱1 h。然后用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值至5.0，待酶解液降至60 ℃左右添加50 μL 糖化酶，于60 ℃水浴加熱1 h 后立即在100 ℃水浴加熱5 min（滅酶）。抽濾后取濾液，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，即得酶解糖化液。加入體積為上述濃縮液4 倍的無(wú)水乙醇，搖勻，4 ℃冷藏，靜置過(guò)夜，取出，以4 000 r/min 速度離心20 min，棄去上清液。得到的沉淀加蒸餾水溶解。將所得溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行低溫減壓蒸餾，除去乙醇，得粗多糖溶液[12]。

采用Sevage 試劑脫蛋白（Sevage 試劑V三氯甲烷:V正丁醇=4:1），按照多糖溶液：Sevage 試劑的體積比為4:1 加入50 mL 離心管進(jìn)行混合，在振蕩器中機(jī)械振蕩20 min（300 次/min），隨后將混合液以4 000 r/min 速度離心5 min，靜置，棄去下層有機(jī)層和中間的蛋白層，重復(fù)操作6 次以上直至蛋白除盡。最后合并所得的上清液，55 ℃低溫減壓蒸餾除去氯仿和正丁醇[13,14]。將規(guī)格為1 000 u 的透析袋煮開(kāi)3～4 min，隨后將透析袋一端扎好后，倒入適量濃縮后的多糖溶液，在4 ℃下用三級(jí)水逆流透析，每隔6 h 換一次三級(jí)水，直到所測(cè)透析液的電導(dǎo)率接近三級(jí)水的電導(dǎo)率（≤1.5 μs/cm）[15]，得到多糖樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及多糖、還原糖含量測(cè)定

以葡萄糖為基準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法，在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]并測(cè)定多糖含量。

以葡萄糖為基準(zhǔn)，采用DNS 法，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]并測(cè)定還原糖含量。

1.3.3 分子量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]對(duì)SPKP 的分子量分布采用高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 傅里葉變換紅外（Fourier Transform Infrared，F(xiàn)T-IR）光譜

參考文獻(xiàn)[18]的方法，利用傅里葉變換紅外儀測(cè)定兩組黃精多糖的紅外光譜。

1.3.5 單糖組成測(cè)定

參考文獻(xiàn)[19]的方法，進(jìn)行單糖組成測(cè)定。

1.3.6 一級(jí)分支結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)測(cè)定一級(jí)分支結(jié)構(gòu)[20]。

1.3.7 甲基化分析

參考文獻(xiàn)[19]的方法，對(duì)多糖進(jìn)行甲基化分析。

1.3.8 三股螺旋結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的方法，采用剛果紅實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三股螺旋結(jié)構(gòu)測(cè)定。

1.3.9 掃描電子顯微鏡測(cè)定

將多糖樣品置于樣品臺(tái)上，并使用掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）進(jìn)行測(cè)定。將導(dǎo)電膜粘附在樣品架上，然后將少量多糖樣品均勻地灑在表面上并通過(guò)二次電子信號(hào)成像進(jìn)行觀察[21]。

1.3.10 免疫活性測(cè)定

1.3.10.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7 加入DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%青霉素-鏈霉素雙抗）中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)進(jìn)行傳代[22]，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.10.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定

RAW264.7 細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)，接種密度為每孔1×104個(gè)。24 h 貼壁后分別加入25、50、100和200 μg/mL 的SPKP，每組樣品設(shè)置6 個(gè)平行。在37 ℃下孵育24 h 后每孔加入10 μL CCK8 試劑，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。各處理組與空白對(duì)照組吸光度的比值×100%即為細(xì)胞存活率。

1.3.10.3 RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力和NO 濃度測(cè)定

參考文獻(xiàn)[23]的方法，測(cè)定RAW264.7 的吞噬能力以及NO 含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 軟件處理數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定6 次，結(jié)果以x-±s 表示；采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析、Duncan 多重范圍檢驗(yàn)差異顯著性分析；使用Origin 2023 軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖基本成分及分子量分析

多糖的基本成分和分子量結(jié)果見(jiàn)表1，通過(guò)苯酚硫酸法繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.005 4X+0.001 5，R2為0.999 5 有較好的擬程度。測(cè)出SPKP 多糖量為94.05%。通過(guò)DNS 法繪制的標(biāo)注曲線為Y=0.431 4X-0.011 3，R2為0.998 6。為測(cè)得還原糖含量為4.1%。結(jié)合前期鑒定結(jié)果與Liang 等[24]和Wang 等[25]的研究可知，黃精的多糖含量豐富，容易提取且在醇沉、脫蛋白和透析之后就有極高含糖量，因此本論文將該SPKP 樣品直接用于后續(xù)結(jié)構(gòu)分析和活性實(shí)驗(yàn)。

表1 SPKP基本成分及分子量Table 1 Basic composition and molecular weight of SPKP

多糖的分子量與其生物活性密切相關(guān)[26]，SPKP的HPGPC 色譜圖見(jiàn)圖1。SPKP 的分子量分布范圍較窄，且分子量普遍不高。分子量分布結(jié)果顯示，SPKP 含有一類(lèi)組分，數(shù)均分子量Mn為3 156 u，重均分子量Mw為3 820 u，多分散性為1.21。

圖1 SPKP的分子量圖譜Fig.1 Molecular weight profile of polysaccharides of saccharify P.kingianum polysaccharide

2.2 傅立葉變換紅外分析

如圖2 所示，F(xiàn)T-IR 光譜顯示出4 000～400 cm-1范圍內(nèi)多糖的典型吸收峰。SPKP 在3 369 cm-1處是-OH的特征吸收峰，2 937 cm-1處的特征吸收峰為C-H 鍵，在1 016～1 147 cm-1范圍內(nèi)則為吡喃糖單位特征峰，與萬(wàn)曉瑩[6]的研究結(jié)果相近。931 cm-1處是吡喃糖形式的甘露糖和葡萄糖中β主導(dǎo)構(gòu)型的代表[27]，基于此可以推測(cè)SPKP 中含有較多的甘露糖或葡萄糖。

圖2 SPKP多糖的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of SPKP

2.3 單糖組成

如圖3 所示為標(biāo)準(zhǔn)樣品離子色譜圖，橫坐標(biāo)為檢測(cè)的保留時(shí)間（Time，min）。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積，可知SPKP 由5 種單糖組成的雜多糖，單糖組成及摩爾比為：阿拉伯糖 : 半乳糖 : 葡萄糖 : 甘露糖 : 果糖=0.032:0.117:0.419:0.048:0.383，含有較多的葡萄糖，這與2.2 中推測(cè)的結(jié)果一致。Li等[28]研究的滇黃精多糖的單糖組成為甘露糖 : 葡萄糖 : 半乳糖 : 葡萄糖醛酸=1:7.22:0.16:0.05:0.02（摩爾比），與本研究結(jié)果有一定區(qū)別，且不含果糖，這可能是因?yàn)樵诒竟に囅碌狞S精多糖在α-淀粉酶和糖化酶的作用下進(jìn)一步導(dǎo)致糖苷鍵斷裂進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)換成了葡萄糖或果糖，從而導(dǎo)致SPKP 的單糖組成以葡萄糖和果糖占比為主。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物和SPKP多糖的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of standard monosaccharide mixtures and SPKP

2.4 一級(jí)分支結(jié)構(gòu)分析

多糖分子中含有許多羥基（-OH）官能團(tuán)，其中的部分羥基能夠與碘化鉀反應(yīng)，形成一種藍(lán)黑色的多糖-碘絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)量多糖-碘絡(luò)合物的吸光度，從而可以判斷多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)SPKP和碘-碘化鉀試劑混合后在300～700 nm 范圍內(nèi)的掃描光譜進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果如圖4 所示。由圖可知，SPKP與碘-碘化鉀試劑的反應(yīng)液在350 nm 波長(zhǎng)附近處均有強(qiáng)吸收峰；在550 nm 處無(wú)吸收峰，這表明SPKP 可能存在復(fù)雜的鏈狀結(jié)構(gòu)，其側(cè)鏈較長(zhǎng)、支鏈較多，與王飛鳳[30]研究的未酶解糖化的黃精多糖結(jié)果相近。

2.5 甲基化結(jié)果分析

將多糖進(jìn)行甲基化和衍生化后得到糖精乙酸酯衍生物再通過(guò)GC-MS 從而確定其糖苷鍵的連接方式[31,32]。圖5 為SPKP 的甲基化GC-MS 圖，從單糖組成結(jié)果可知SPKP 含有果糖，由于果糖為酮糖，在還原過(guò)程中會(huì)異構(gòu)化成甘露糖和葡萄糖，得到的甲基糖苷異構(gòu)化成呋喃環(huán)的甘露糖苷和葡萄糖苷。因此，將Manf-(2 →、Glcf-(2 →、→1)-Manf-(2 →和→1)-Glcf-(2 →的糖苷鍵整合得到Fruf-(2 →和→1)-Fruf-(2 →，結(jié)果如表2 所示。結(jié)合表2和2.3 單糖組成的結(jié)果可知，SPKP 中的單糖以葡萄糖為主，所以其主要的糖苷鍵連接方式為為→4)-Glcp-(1 →（占47.1%）。根據(jù)DB（分支度）=（末端殘基+分支殘基）/（末端殘基+分支殘基+線性殘基）計(jì)算SPKP 的分支度（DB）值分別為34.1%，結(jié)果表明SPKP 存在復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)，與2.4中推測(cè)的結(jié)果一致。

圖5 SPKP甲基化結(jié)果Fig.5 Methylation results of SPKP

表2 SPKP甲基化結(jié)果Table 2 Methylation results of polysaccharides from SPKP

2.6 三股螺旋結(jié)構(gòu)分析

剛果紅是一種生物染色劑，它能夠與多糖中的單股螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合成復(fù)合物，使反應(yīng)溶液的最大吸收波長(zhǎng)隨著單股螺旋結(jié)構(gòu)濃度的升高而變大。在一定的堿性體系中，多糖中的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚，使單股螺旋結(jié)構(gòu)的濃度增大，反應(yīng)溶液的最大吸收波長(zhǎng)也會(huì)發(fā)生變化[33]。對(duì)于SPKP，圖6 顯示它在NaOH濃度分別為0.2～0.3 mol/L 范圍時(shí)，表現(xiàn)出紫外最大吸收光的增加，且發(fā)生了明顯紅移，表明樣品與剛果紅發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)。但隨著濃度的繼續(xù)增加，在強(qiáng)堿條件下多糖螺旋結(jié)構(gòu)可能解體成無(wú)規(guī)則的單股線團(tuán)，不能與剛果紅反應(yīng)生成絡(luò)合物，多糖最大吸光值相應(yīng)減少，由此推測(cè)SPKP 存在三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of the Congo red experiment

2.7 SEM 分析

SEM 技術(shù)通常用于觀察多糖的表面形態(tài)。如圖7 所示，SPKP 的表面較光滑，有鼓起部分，凹凸不平，與Liu 等[34]的未酶解糖化的黃精多糖結(jié)構(gòu)相比，無(wú)明顯結(jié)構(gòu)特征，方晨璐等[35]發(fā)現(xiàn)酶的種類(lèi)、單一與復(fù)合作用都會(huì)影響到分子表面形態(tài)。SPKP可能其表面結(jié)構(gòu)可能受到了酶解條件的影響。綜上，不同的炮制方法是影響其表面形態(tài)的關(guān)鍵因素。

圖7 黃精多糖樣品的掃描電鏡圖Fig.7 SEM result of the SPKP

2.8 SPKP 對(duì)RAW264.7 免疫細(xì)胞活性影響

如圖8a 所示，與空白對(duì)照組相比SPKP 能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)（P＜0.05），SPKP 在100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力最高，達(dá)到153.77%，在200 μg/mL 處均有一定程度下降但仍保持較高的細(xì)胞存活率，說(shuō)明在一個(gè)較廣的給藥范圍內(nèi)，SPKP 仍未見(jiàn)對(duì)細(xì)胞存活造成明顯影響，說(shuō)明本文研究的兩種多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞有較優(yōu)的安全性。

圖8 不同濃度的多糖對(duì)細(xì)胞增殖（a）、吞噬能力（b）、和NO（c）的影響Fig.8 Effect of the polysaccharide on the viability (a),phagocytosis (b),production of NO (c) of RAW264.7 cells with different concentrations.

以吞噬形式存在的細(xì)胞外物質(zhì)是巨噬細(xì)胞效應(yīng)或活動(dòng)的關(guān)鍵指標(biāo)；一氧化氮（NO）作為一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活后，會(huì)產(chǎn)生NO，并與超氧陰離子自由基反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝基陰離子，以幫助機(jī)體對(duì)抗外來(lái)抗原，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[23]。由圖8b、c可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，SPKP 的吞噬率和NO 水平達(dá)到最優(yōu)效果，分別為239.24%和22.95 μmol/L，但隨著質(zhì)量濃度的提高，其效果均有所降低。然而，與正常組相比，SPKP 在各濃度下均能刺激細(xì)胞的吞噬活性（P＜0.05）和促進(jìn)NO 水平（P＜0.05）。綜上所述，本研究中SPKP 具有效果較好的吞噬能力和NO 分泌能力。

2.9 SPKP 對(duì)免疫活性的構(gòu)效關(guān)系分析

多糖的免疫活性與其分子量、單糖組成、化學(xué)官能團(tuán)等結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。通常，多糖的分子量是影響其在水溶液中構(gòu)型和形態(tài)的主要因素之一，低分子量多糖可以穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而直接刺激啟動(dòng)免疫應(yīng)答[36]，因此，低分子量SPKP 可能通過(guò)直接刺激途徑激活RAW264.7 細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并分泌NO。有關(guān)研究[37,38]發(fā)現(xiàn)，含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等的多糖能更好的被巨噬細(xì)胞受體識(shí)別，發(fā)揮免疫活性，而Fu 等[39]也發(fā)現(xiàn)以（1 → 4）糖苷鍵連接甘露糖（Manp）和葡萄糖（Glcp）為主的多糖，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。單糖組成和甲基化的結(jié)果表明SPKP 中葡萄糖和甘露糖的占比較高且主要糖苷鍵連接類(lèi)型為→4)-Glcp-(1 →，這可能是SPKP 具有較好免疫功效的原因之一；同時(shí)三股螺旋構(gòu)象因其豐富的游離羥基和疏水空腔也被認(rèn)為擁有與巨噬細(xì)胞受體相互作用的可能。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了酶解糖化后的滇黃精多糖的結(jié)構(gòu)與免疫活性，提取到了一種具有復(fù)雜分支和三股螺旋結(jié)構(gòu)的葡聚糖SPKP，其單糖組成主要為甘露糖和葡萄糖，→4)-Glcp-(1 →糖苷鍵為主要的連接方式。RAW264.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)出SPKP 有較好明顯的免疫功效。這些結(jié)果豐富了新炮制方法下黃精多糖結(jié)構(gòu)研究的知識(shí)，為黃精新炮制工藝的研究提供了參考。然而，對(duì)于新炮制方法下的黃精多糖，我們?nèi)孕柽M(jìn)一步探索其結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系以更好地了解其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。