β-環(huán)糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹堿膠束在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

彭于之 ，姜良竹 ，徐傳錫 ，王志強，孫勇兵*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330004

2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004

伊立替康是喜樹堿類拓撲異構(gòu)酶I 抑制劑[1]，用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、胰腺癌等的臨床治療。伊立替康本質(zhì)上是一種前藥，需要在羧酸酯酶作用下轉(zhuǎn)化為活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN38）才能發(fā)揮療效[2]。然而，僅有2%～8%的伊立替康可轉(zhuǎn)化為活性的SN38。SN38 在多種腫瘤細胞株上表現(xiàn)出比伊立替康高10～1 000 倍的抗腫瘤活性[3-5]。直接用SN38 作為抗癌藥物無需體內(nèi)酯酶的激活，可以克服伊立替康的代謝激活缺陷。目前開發(fā)SN38靶向給藥系統(tǒng)已成為大型制藥企業(yè)競相開展的重要課題。浙江海正藥業(yè)開發(fā)的SN38 膠束制劑PEGSN38 已經(jīng)進入了I 期臨床[6-7]；日本化藥株式會社開發(fā)的載SN38 膠束制劑NK012 已經(jīng)進入II 期臨床，而且被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)作為治療非小細胞肺癌的治療藥物[8-9]。SN38 脂質(zhì)體的研究也是一個熱門[10-11]。在前期研究中，本課題組以β-環(huán)糊精-聚乙二醇作為親水端，通過酯鍵將SN38 的20位羥基與β-環(huán)糊精-聚乙二醇相連，構(gòu)建了兩親性聚合物β-環(huán)糊精-聚乙二醇-7-乙基-10-羥基喜樹堿膠束（β-CD-PEG-SN38），該聚合物能在水性介質(zhì)中自組裝成100 nm 左右的膠束。為了更好地了解β-CDPEG-SN38 在體內(nèi)的動態(tài)行為，開展其的藥動學(xué)研究是非常有必要的。本研究建立了HPLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中游離型和鍵合型SN38，考察了β-CD-PEG-SN38 膠束在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)，以期為新藥開發(fā)提供更多的支持。

1 儀器和材料

Nexera LC-40 超高效液相系統(tǒng)（配備自動進樣器和二元泵，日本Shimadzu 公司），API4500 三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司），ST8R 超高速離心機（美國Thermo Fisher 公司）。

SN38 原料藥[質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 99.8%，批號20221005，凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司]，鹽酸小檗堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.5%，批號20221021，江西本草天工科技有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級，美國Fisher Scientific 公司），甲酸（色譜級，上海麥克林公司），純凈水（自制），其余試劑均為分析純。

β-CD-PEG-SN38 膠束由江西中醫(yī)藥大學(xué)自制，HPLC 法測得SN38 的載藥量為11.2%。SD 大鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號SYXK（贛）2022-0002。藥動學(xué)實驗得到江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：月旭Welch C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為水（含0.1%的甲酸溶液，A）-乙腈（含0.1%的甲酸溶液，B），梯度洗脫（洗脫程序為0～0.4 min，5% B；0.4～4.5 min，5%～80% B；4.51～6.0 min，80%～5% B）；柱溫是40 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量是1 μL。

質(zhì)譜條件：ESI 源，正離子檢測，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式掃描；離子通道：393.1→349.1（SN38），336.1→320.0（內(nèi)標(biāo)小檗堿）。源電壓為5 500 V，Gas1（N2）為60 psi（1 psi＝6 895 Pa），Gas2（N2）為60 psi，離子源溫度是600 ℃；Curtain gas（N2）為40 psi，CAD Gas（N2）為9 psi。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量控制（QC）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取SN38 對照品適量，用70%甲醇溶液制備272.0 μg/mL 儲備液，然后用70%甲醇溶液依次稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，SN38 的質(zhì)量濃度分別為68.0、340.0、680.0、1 360.0、2 720.0、5 440.0、13 600.0、27 200.0、43 520.0、54 400.0 ng/mL。按照同樣的方式制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度（136.0、27 200.0、43 520.0 ng/mL）的QC 標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有溶液置于冰箱（4 ℃）保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取小檗堿對照品適量，用70%甲醇溶液制備400 μg/mL 儲備液，然后用70%甲醇溶液稀釋制備250 ng/mL 內(nèi)標(biāo)溶液，置于冰箱（4 ℃）保存。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和QC 血漿樣品的制備 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和QC 工作溶液10 μL，置于具塞玻璃試管中，用氮氣吹干，加入空白血漿200 μL，配制SN38 質(zhì)量濃度在3.4～2 720.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，同時制備SN38 低、中、高質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿QC 樣品。

2.3.2 血漿樣品的制備 將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液、20 μL 水，渦旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，渦旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液，即得游離型SN38 測定的血漿樣品溶液。將40 μL 血漿樣品置于1.5 mL 離心管中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 μL，23 ℃孵育10 min，然后加入1 mol/L 鹽酸溶液10 μL，再加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液，渦旋2 min，加入330 μL 甲醇溶液，渦旋5 min，于4 ℃、10 000 r/min 離心8 min，取上清液，即得SN38 總質(zhì)量濃度（鍵合型和游離型之和）測定的血漿樣品溶液。質(zhì)量濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點的樣品用空白血漿稀釋10 倍后測定。

2.4 方法學(xué)試驗

2.4.1 方法選擇性 取6 個不同來源的大鼠空白血漿40 μL，除不加入內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液（補加70%甲醇10 μL），其余按照2.3.2 項下方法操作，得空白血漿樣品；取含SN38 6.8 ng/mL 的低質(zhì)量濃度QC樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿工作溶液，其余按照2.3.2 項下方法操作，得低質(zhì)量濃度QC 樣品；取受試大鼠給藥后的血漿40 μL，按照2.3.2 項下方法操作，得大鼠給藥樣品。取各樣品進樣測定，色譜圖見圖1。可以看出SN38 的保留時間為3.923 min，內(nèi)標(biāo)物小檗堿的保留時間為3.805 min，血漿中的內(nèi)源性成分不干擾SN38、小檗堿的測定。

圖1 空白血漿（A）、QC 樣品（B）和大鼠給藥樣品（C）的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank plasma (A),QC sample (B),and sample from rat (C)

2.4.2 線性回歸曲線方程 取標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液，按2.3.2 項下方法操作，每個質(zhì)量濃度進行雙樣本分析，分別以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，以加權(quán)（y＝1/x2）最小二乘法進行線性回歸，得典型的線性回歸曲線方程y＝4.356×10-4x＋2.43×10-4，r＝0.992 3，結(jié)果表明SN38 的血漿質(zhì)量濃度在3.4～2 720.0 ng/mL 線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度試驗 精確配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品，各5 份，按2.3.2項下方法操作，測定藥物質(zhì)量濃度，同一個質(zhì)量濃度樣品每隔1 h 測定1 次，共3 次，進行日內(nèi)精密度計算；每隔1 d 測定1 次，共3 次，進行日間精密度計算，結(jié)果見表1。在3 種質(zhì)量濃度下，日內(nèi)精密度小于6.5%，日間精密度小于6.3%。

表1 精密度試驗結(jié)果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

表1 精密度試驗結(jié)果（,n=5）Table 1 Results of precision test (,n=5)

分別配制6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 血漿樣品，各5 份，按2.3.2 項下方法操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算質(zhì)量濃度和準(zhǔn)確度，見表2。根據(jù)藥物臨床前藥動學(xué)指導(dǎo)原則，準(zhǔn)確度應(yīng)在85%～115%，RSD 值應(yīng)小于15%，3 種質(zhì)量濃度下準(zhǔn)確度均符合要求。

表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

表2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果（,n=5）Table 2 Results of accuracy test (,n=5)

2.4.4 方法提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、1 360.0、2 176.0 ng/mL 的QC 血漿樣品。取血漿樣品40 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)小檗堿溶液，其余按2.3.2 項下方法操作，測得峰面積A1；另取空白血漿40 μL，先經(jīng)甲醇沉淀后，加入QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備未經(jīng)提取的QC 樣品，測得峰面積A2；取混合后的QC 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL，除以水代替空白基質(zhì)外，其余按2.3.2 項下操作，制備無基質(zhì)的QC 樣品，測得峰面積A3。以提取后的樣品峰面積A1除以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2計算待測物SN38 和內(nèi)標(biāo)小檗堿的回收率。以未經(jīng)提取的樣品峰面積A2除以無基質(zhì)樣品峰面積A3分別計算待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。SN38 的提取回收率在88.5%～95.7%，基質(zhì)效應(yīng)在96.4%～103.2%。內(nèi)標(biāo)小檗堿的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別是92.1%、98.3%。

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

表3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果（,n=5）Table 3 Result of extraction and matrix effect (,n=5)

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 配制SN38 質(zhì)量濃度分別是6.8、2 176.0 ng/mL 的血漿樣品，考察樣品室溫放置2 h、3 個凍融循環(huán)（-20～23 ℃）、4 ℃放置24 h、長期放置30 d（-20 ℃）的穩(wěn)定性，以及處理后的樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（,n=5）Table 4 Result of stability (,n=5)

2.5 藥動學(xué)研究

取SD 大鼠12 只，實驗前禁食給水過夜，隨機分成2 組。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液，劑量以SN38 計為6 mg/kg，給藥后觀察大鼠的腹瀉情況，同時用乙醚麻醉大鼠，在5、15、30、45 min 以及1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h 眼眶取血0.2 mL。在4 ℃、2 000 r/min 條件下離心10 min，分離血漿，并于-20 ℃冰箱中保存待測。

將同一份血漿分為兩份，各40 μL，按照2.3.2項下方法處理，其中1 份用來測定血漿中游離型的SN38 質(zhì)量濃度，另1 份用來測定血漿中SN38 總質(zhì)量濃度（鍵合型和游離型之和），其中血漿中SN38的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型的SN38 質(zhì)量濃度。

利用Das 軟件計算β-CD-PEG-SN38 膠束溶液中SN38 的藥動學(xué)參數(shù)。平均血藥濃度-時間曲線見圖2，主要藥動學(xué)參數(shù)見表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用Das 軟件處理藥動學(xué)數(shù)據(jù)，三室模型能最佳的進行藥動學(xué)數(shù)據(jù)的擬合。大鼠iv β-CD-PEG-SN38 膠束溶液后，游離型SN38 和鍵合型SN38 的AUC 分別是1 490.7、5 060.3 ng/(mL·h)，在大鼠血漿中占主導(dǎo)的是鍵合型的SN38。

表5 藥動學(xué)參數(shù)（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

表5 藥動學(xué)參數(shù)（）Table 5 Pharmacokinetics parameters ()

圖2 大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時間曲線（,n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of SN38 in rats (,n=6)

3 討論

本研究建立了測定血漿中SN38 質(zhì)量濃度的HPLC-MS/MS 方法，通過堿性水解的方法將鍵合型的SN38 從β-CD-PEG-SN38 膠束上斷裂出來，血漿中SN38 的總質(zhì)量濃度減去游離型的SN38 質(zhì)量濃度就是鍵合型SN38 的質(zhì)量濃度。利用沉淀蛋白法處理樣品，操作簡單；方法的基質(zhì)效應(yīng)很低，適合高通量的藥物測定。

聚合物膠束制備工藝簡單，膠束能以一個完整的形式達到腫瘤部位，實現(xiàn)腫瘤靶向性。兩親性聚合物膠束的藥動學(xué)研究是一個具有挑戰(zhàn)性的難題。從本研究結(jié)果可以看出，鍵合型SN38 質(zhì)量濃度顯著高于游離SN38 的質(zhì)量濃度，說明膠束在血漿中具有較好的穩(wěn)定性，SN38 會更多地以膠束的形式靶向腫瘤部位。鍵合型SN38 的表觀分布容積大，說明膠束在組織中尤其是腫瘤組織中分布較多[7]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突