從“扶正祛邪”角度探討升陽益胃湯加減方治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的效應(yīng)機制※

呂小燕,張瑜,尚可,杜慧娟,馮五金

（山西省中醫(yī)藥研究院,山西 太原 030024）

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)因腹痛、黏液膿血便等癥狀反復(fù)發(fā)作被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一,其發(fā)病機制與在腸黏膜屏障受損基礎(chǔ)上的腸道免疫失衡有關(guān)[1]。目前西醫(yī)治療UC的關(guān)注點仍以5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑等逐漸升階梯的祛邪抗炎治療方案為主,忽略修復(fù)損傷腸黏膜屏障功能的重要性。結(jié)合目前臨床治療中患者存在病情反復(fù)、療效不穩(wěn)定、潛在感染等正氣虧虛的特征,筆者認為可從中醫(yī)“扶正祛邪”角度出發(fā)治療UC,修復(fù)損傷的腸黏膜屏障,調(diào)節(jié)菌群失調(diào)狀態(tài)等,以恢復(fù)UC患者的腸道免疫平衡。

升陽益胃湯加減方是在李東垣升陽益胃湯益氣健脾、祛濕的基礎(chǔ)上,結(jié)合UC久病及腎,久病入絡(luò)、多瘀等病機特點,加仙茅、淫羊藿、丹參、秦皮、厚樸等補腎活血、燥濕止痢中藥組成,具有益氣健脾、祛濕止痢、扶正祛邪的功效。本研究從中醫(yī)“扶正祛邪”角度觀察升陽益胃湯加減方對UC大鼠腸黏膜屏障蛋白閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)、occludin及炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達的影響。

1 材料

1.1 藥物與試劑 ①升陽益胃湯加減方煎劑組成:黃芪30 g,半夏9 g,黨參片15 g,炙甘草5 g,羌活、獨活、防風(fēng)、炒白芍各15 g,麩炒白術(shù)30 g,陳皮15 g,茯苓30 g,柴胡9 g,澤瀉15 g,黃連片3 g,仙茅9 g,淫羊藿9 g,厚樸15 g,秦皮15 g,丹參15 g。由山西省中醫(yī)藥研究院東山科教院區(qū)實驗室提供并熬制成水煎劑,按標(biāo)準(zhǔn)成人劑量與大鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25,計算大鼠的給藥劑量,含生藥量為31.73 g/kg。②美沙拉秦腸溶片(Losan Pharma Gmb H,國藥準(zhǔn)字H20171358,0.5 g/袋),含藥量為0.34 g/kg,至研磨機中研磨成細微粉末,加100°C 蒸餾水制成混懸液,現(xiàn)用現(xiàn)配。③IL-6抗體(批號:GR3337471-16)、occludin 抗體(批號:GR3452603-3)、TNF-α 抗體(批號:GR3405981-5)、ZO-1抗體(批號:GR3354270-17)均購自Abcam 公司。④葡聚糖硫酸鈉(DSS)(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12469988)。⑤10%水合氯醛溶液、中性福爾馬林溶液由山西省中醫(yī)藥研究院東山科教院區(qū)實驗室提供。⑥Contour Elite三維光學(xué)顯微鏡購有美國布魯克公司。

1.2 實驗動物與分組 SPF級SD大鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量190～210 g,由山西省中醫(yī)藥研究院東山科教院區(qū)實驗室提供(實驗動物合格證號:110324210102969274,倫理編號:SZYLY2021KY-0329)。40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后標(biāo)號、稱重,隨機均分為模型組、正常組、中藥組和西藥組,每組10只。

2 方法

2.1 模型制備及給藥方法 模型組、中藥及西藥組大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)誘導(dǎo)建立UC大鼠模型:上午按1 m L/100 g體質(zhì)量予5%DSS溶液灌胃,同時予5%DSS溶液自由飲,連續(xù)7 d建立UC大鼠模型(根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,隨機抽取5只大鼠,予上述方法造模,7 d后處死2只大鼠,觀察結(jié)腸黏膜組織充血、水腫、潰瘍等情況,確定造模成功)。中藥組大鼠每日下午按1 m L/100 g體質(zhì)量給予升陽益胃湯加減方煎劑灌胃,西藥組給予美沙拉秦腸溶片粉末溶液灌胃,正常組大鼠按1 m L/100 g給予純凈水灌胃及自由飲,各組大鼠連續(xù)灌胃7 d。

2.2 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察 實驗期滿后,各組大鼠禁食不禁水12 h,后用10%水合氯醛按0.35 m L/100 g行腹腔注射麻醉后,取出結(jié)腸,縱向切開腸腔,用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物,肉眼觀察其結(jié)腸黏膜變化,然后采用中性福爾馬林固定,繼續(xù)予以水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋,冰凍切片機做連續(xù)冠狀切片,片厚50μm,取部分切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織細胞的病理改變,按表1進行評分。

表1 光鏡下病理形態(tài)評定表

2.3 ZO-1、occludin及IL-6、TNF-α指標(biāo)測定 在室溫下取出冰凍石蠟切片,進行脫蠟水合,采用枸櫞酸溶液進行抗原修復(fù);H2O2孵育后,加入山羊血清封閉,清洗后加入按說明書比例稀釋的IL-6、occludin、TNF-α、ZO-1一抗,4 ℃孵育;次日加入二抗,室溫孵育,采用DAB法顯色,再進行沖洗,蘇木精復(fù)染,封片,在顯微鏡下觀察不同部位ZO-1、Occludin、IL-6、TNF-α表達情況并攝片。參照《免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)共識》中評分標(biāo)準(zhǔn)對各指標(biāo)進行評分,根據(jù)陽性細胞染色程度及著色細胞百分率進行計分:0分為不著色,1分為淺棕色,2分為深棕色;著色細胞＜5%計0分,5%～25%計1分,26%～50%計2分,＞50%計3分。兩個分值相加,0～1分為(-),2分為弱陽性(+),3分為陽性(++),4～6分為強陽性(+++)[2]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察 正常組大鼠大便成形、色黃,皮毛濃密、光潔,體態(tài)正常,食欲可,體質(zhì)量逐日增加。模型組大鼠在造模第4日出現(xiàn)少許黏液便;造模第6日食欲減退,進食量減少,后逐漸出現(xiàn)精神不振、乏力、喜靜少動、懸空拉尾抗力減弱、自發(fā)活動數(shù)降低、皮毛粗糙;造模第16日出現(xiàn)血便。西藥及中藥組大鼠狀態(tài)較正常組稍差,較模型組好。造模結(jié)束后,模型組有1只大鼠死亡,西藥組有1只大鼠死亡,中藥組有2只大鼠死亡,正常組均存活。

3.2 對結(jié)腸組織形態(tài)的影響 正常組結(jié)腸黏膜上皮組織整齊,細胞排列密集,可見杯狀隱窩,無炎癥細胞浸潤,未見糜爛、潰瘍。模型組結(jié)腸黏膜上皮缺損,基本無結(jié)構(gòu)完整的隱窩,黏膜及黏膜下層見大量炎癥細胞浸潤。中藥組結(jié)腸黏膜上皮部分中斷,與模型組相比缺損面積小,部分隱窩結(jié)構(gòu)破壞,可見少許炎癥細胞浸潤。西藥組結(jié)腸黏膜組織變化接近中藥組。見圖1(見本期第129頁)。

圖1 4組大鼠結(jié)腸黏膜病理蘇木精-伊紅染色圖片比較(×100)

3.3 對結(jié)腸組織病理評分的影響 與正常組相比,模型組病理學(xué)評分顯著升高(P＜0.01);與模型組相比,中藥、西藥組病理評分均顯著下降(P＜0.01)。見表2。

表2 4組大鼠結(jié)腸組織病理評分比較

3.4 對occludin、ZO-1蛋白表達的影響 與正常組相比,模型組腸黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表達顯著下降;與模型組相比,中藥、西藥組腸黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表達增加,但低于正常組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2、3(見本期第129頁)及表3。

圖2 4組大鼠結(jié)腸黏膜蛋白occludin的表達(×100)

圖3 4組大鼠結(jié)腸黏膜蛋白閉鎖小帶蛋白1的表達(×100)

表3 4組大鼠結(jié)腸黏膜屏障蛋白occludin、閉鎖小帶蛋白1表達水平比較

3.5 對TNF-α、IL-6表達的影響 與正常組相比,模型組大鼠腸黏膜炎癥因子TNF-α、IL-6表達均顯著增加;與模型組相比,中藥、西藥組大鼠腸黏膜TNF-α、IL-6表達均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖4、5(見本期第129頁)及表4。

圖4 4組大鼠結(jié)腸黏膜腫瘤壞死因子α的表達(×100)

圖5 4組大鼠結(jié)腸黏膜白細胞介素-6的表達(×100)

表4 4組大鼠結(jié)腸黏膜白細胞介素-6、腫瘤壞死因子α表達比較

4 討論

UC是一種侵及結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎性疾病,以反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便,伴腹痛、里急后重為主要臨床表現(xiàn)。目前西醫(yī)治療UC 以美沙拉秦制劑抗炎為主,雖短期療效較好,但存在肝腎功能損害、病情反復(fù)等弊端[3]。在患者對美沙拉嗪制劑治療不應(yīng)答或病情加重、反復(fù)等情況下,采用激素、生物制劑等治療,雖能取得一定的治療效果,但有療效不穩(wěn)定、發(fā)生感染、免疫抑制等問題[4-6]。UC 的發(fā)病機制目前雖尚未闡明,但近年研究表明遺傳、環(huán)境、心理、感染等多重致病因素致腸黏膜免疫失衡是該病發(fā)生的主要病理機制,在腸黏膜免疫失衡的病理基礎(chǔ)上,腸黏膜屏障受損致腸上皮細胞間通透性增加是啟動UC、主導(dǎo)UC進展的重要因素[7]。扶正祛邪修復(fù)損傷的腸黏膜屏障,恢復(fù)腸道免疫平衡是UC治療的重點。

occludin及ZO-1蛋白是腸黏膜屏障的重要組成部分,分屬于腸黏膜屏障緊密連接跨膜蛋白和連接跨膜蛋白及細胞骨架間的連接復(fù)合物蛋白,是腸黏膜屏障功能受損的重要檢測指標(biāo)。研究表明,UC患者受損的腸黏膜屏障致腸上皮細胞間通透性增加,可使細菌、病毒等進入腸黏膜,激活以TNF-α為主的腸黏膜炎性反應(yīng),TNF-α進一步刺激單核巨噬細胞和中性粒細胞,合成IL-6,進一步加重腸黏膜組織損傷,形成結(jié)腸黏膜及黏膜下層持續(xù)性或間斷性炎癥[8]。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)“久痢”“腸澼”等范疇?！稘冃越Y(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見(2017年)》指出脾氣虧虛是UC 發(fā)生的基本病機[9]。在脾虛基礎(chǔ)上,濕、熱、瘀等病理因素互結(jié)致“內(nèi)瘍”是UC發(fā)病的主要病機。升陽益胃湯加減方是在李東垣升陽益胃湯益氣健脾、祛濕的基礎(chǔ)上,結(jié)合“脾病及腎、濕困脾土”的中醫(yī)理論及UC久病入絡(luò)、多瘀的病機特點,加仙茅、淫羊藿、丹參、秦皮、厚樸,具有益氣健脾、活血祛濕解毒的功效,符合中醫(yī)扶正祛邪的組方特點。本研究結(jié)果表明,升陽益胃湯加減方可顯著降低UC 大鼠腸黏膜TNF-α、IL-6表達,升高腸黏膜屏障蛋白occludin、ZO-1表達,表明修復(fù)損傷的腸黏膜屏障、祛濕消滯、扶正祛邪可能是該方治療UC的主要效應(yīng)機制。本研究為中醫(yī)藥防治UC的效應(yīng)機制提供了研究依據(jù)。