塞來昔布關(guān)鍵中間體HPLC 含量測(cè)定方法的建立

劉曉蓮

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司，河北 衡水 053400）

0 引 言

塞來昔布（Celecoxib），化學(xué)名4-[5- （4- 甲基苯基） -3- （三氟甲基） 吡挫-1- 基]苯磺酰胺，是臨床中常用的新一代環(huán)氧化酶-2（COX-2） 的特異性抑制劑，由美國(guó)西爾藥廠研制開發(fā)，可通過抑制環(huán)氧化酶-2 阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生，屬于非甾體抗炎藥，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可顯著減少胃腸道不良反應(yīng)，用于治療各類急、慢性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎性疾病。無論對(duì)于急性創(chuàng)傷外傷導(dǎo)致的急性疼痛，還是外科手術(shù)后的止痛，都是理想的鎮(zhèn)痛藥物。

目前關(guān)于塞來昔布合成的文獻(xiàn)和專利已有不少，在塞來昔布的合成工藝中，一般以對(duì)甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯經(jīng)Claisen 縮合反應(yīng)制得中間體，然后與對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽反應(yīng)制得塞來昔布，因此對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質(zhì)量檢測(cè)對(duì)塞來昔布的合成來說有著至關(guān)重要的作用。但目前關(guān)于中間體的液相色譜檢測(cè)方法的報(bào)道較少。本研究建立了對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量的高效液相色譜（HPLC） 測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

圖1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

2 主要儀器與試劑

UltiMate 3000 型高效液相色譜，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司；PURELAB flex 型超純水儀，購(gòu)自威立雅水處理技術(shù)（上海） 有限公司；BSA224S 型電子分析天平，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品，購(gòu)自河北蒲葵生物醫(yī)藥科技有限公司；對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品，河北冀衡藥業(yè)股份有限公司自制；辛烷磺酸鈉，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氟乙酸，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；色譜純乙腈，購(gòu)自美國(guó)迪馬科技有限公司；水為超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agllent ZORBAX SB-C18 柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流動(dòng)相：緩沖液（1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 ml 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，用三氟乙酸調(diào)pH 值至2.5）：乙腈=88：12；

進(jìn)樣量：20 μL；

檢測(cè)波長(zhǎng)：233 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：25℃。

3.2 溶液配置

供試品溶液制備方法：精密稱取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽自制樣品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解，并加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得。對(duì)照品溶液制備方法：精密稱取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品10.0 mg，置25.0 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解，并加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

按照2.2 項(xiàng)下制備方法配制6 份供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。系統(tǒng)適用性結(jié)果見表1。

表1 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定HPLC 方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 System suitability test results for determination of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride content by HPLC method

由表1 可得，對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定的保留時(shí)間的RSD＜2%，峰面積的RSD＜2%，拖尾因子為1.1，理論塔板數(shù)均在，10 000 以上表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性范圍對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的工作濃度是0.4 mg/mL，其線性測(cè)量范圍為0.2 ～0.6 mg/mL，相當(dāng)于工作濃度的50%～150%水平。取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品約100 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，當(dāng)做線性貯備溶液（2.0 mg/mL）。依次精密量取對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相制成對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量分別為0.2、0.32、0.4、0.48和0.6 mg/mL 濃度的對(duì)照品溶液，依照2.1 項(xiàng)色譜條件，各個(gè)濃度進(jìn)樣2 次，進(jìn)行檢測(cè)分析，分析后記錄色譜圖。

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽線性測(cè)定結(jié)果Table 2 Linearity determination results of 4-Hydrazinobenzene- 1-sulfonamide hydrochloride

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。

圖2 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve determination of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride

由表2 可見，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程：y=0.241 6x- 1.113 7，R2=0.999 6。結(jié)果表明對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積與其濃度呈較好的線性關(guān)系，可用來進(jìn)行對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定。

3.4.2 專屬性試驗(yàn)

以2.1 項(xiàng)溶液的配制方法分別配制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽供試品溶液、對(duì)照品溶液。分別量取空白溶劑、供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析，并記錄色譜圖。

稀釋劑色譜圖如圖3 所示。

圖3 稀釋劑色譜圖Fig.3 Diluent chromatogram

供試品溶液色譜圖如圖4 所示。

圖4 供試品溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of the test solution

對(duì)照品溶液色譜圖如圖5 所示。由以上色譜圖可知，空白溶劑對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測(cè)無干擾，該方法的專屬性良好。

圖5 對(duì)照品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of reference solution

3.4.3 檢測(cè)限和定量限

用流動(dòng)相配制系列濃度對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣；記錄色譜圖和S/N，進(jìn)行檢測(cè)限、定量限的測(cè)試，S/N=3 對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，S/N=10 對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。結(jié)果表明對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的檢測(cè)限為0.167μg/mL；DPDMP 的定量限為0.501 μg/mL。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

溶液的穩(wěn)定性研究用來證明根據(jù)相應(yīng)方法制備溶液在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。按照2.2 項(xiàng)下制備供試品溶液，儲(chǔ)存在室溫條件下，于適宜時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)樣。考察各時(shí)間點(diǎn)下供試品溶液中對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積變化情況，按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)分析，并記錄其峰面積。

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定溶液穩(wěn)定性結(jié)果見表3。

表3 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定溶液穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Solution stability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表3 可見，對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的峰面積RSD為0.35%，＜2.0%，結(jié)果表明該溶液穩(wěn)定性良好。

3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按照2.2 項(xiàng)方法配制6 份供試品溶液，以2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)試分析，記錄峰面積。同樣，根據(jù)對(duì)照品溶液的制備方法配制相應(yīng)的對(duì)照品溶液，進(jìn)行檢測(cè)分析，并記錄峰面積。

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定重復(fù)性結(jié)果見表4。

表4 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量測(cè)定重復(fù)性結(jié)果Table 4 Repeatability results for determination of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride content

由表4 可見，平均峰面積為95.252，RSD 為0.29%。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽峰面積的RSD＜2.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

取9 份已知準(zhǔn)確含量的供試品溶液，分別加入塞來昔布關(guān)鍵中間體對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的對(duì)照品，按照2.2 項(xiàng)樣品制備方法和2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積。

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Recovery test results of 4-Hydrazinobenzene-1- sulfonamide hydrochloride

由表5 可見，對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的加樣平均回收率為99.77%，RSD 為0.40%。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度較好。

3.5 樣品含量測(cè)定

取3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品，按照2.2 項(xiàng)制備方法配制供試品溶液。并按照2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表6。結(jié)果表明，采用HPLC 法，測(cè)定對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的含量，操作簡(jiǎn)單，專屬性良好。對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽三批樣品的含量均＞99.0%。

表6 3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of 4-Hydrazinobenzene-1-sulfonamide hydrochloride samples in 3 batches

3 批自制對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽樣品含量測(cè)定結(jié)果見表6。

4 結(jié) 語

對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽作為肼的有機(jī)衍生物，是塞來昔布合成工藝中的關(guān)鍵中間體，其含量對(duì)于制備塞來昔布的工藝而言，是十分重要的質(zhì)量研究?jī)?nèi)容。本試驗(yàn)根據(jù)高效液相色譜法測(cè)得的相關(guān)數(shù)據(jù)，建立了一套對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的高效液相色譜檢測(cè)方法，用于控制關(guān)鍵中間體的質(zhì)量，即采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：緩沖液（1.65 g 庚烷磺酸鈉置于1 000 mL 容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，用三氟乙酸調(diào)pH 值至2.5）∶乙腈=88∶12；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm；柱溫為25 ℃。

經(jīng)過試驗(yàn)證明該方法可以直接用于檢測(cè)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽含量。本試驗(yàn)開發(fā)的方法通過系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和方法學(xué)考察，表明該方法具有分析時(shí)間短、方法穩(wěn)定準(zhǔn)確、專屬性、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽的質(zhì)量研究。目前針對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽多為合成工藝的研究，而本試驗(yàn)僅完成了含量測(cè)定方法的確定。下一步需要對(duì)對(duì)肼基苯磺酰胺鹽酸鹽進(jìn)行更多的質(zhì)量研究，如性狀、鑒別（色譜法和光譜法）、有關(guān)物質(zhì)及穩(wěn)定性研究等，為塞來昔布及其制劑的質(zhì)量控制提供更多參考依據(jù)。