殼寡糖的制備、純化及應(yīng)用研究進展

郭漢忠，李永莎，李永成,2，夏光華,2，張雪瑩,2,*

（1.南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心，海洋食品精深加工?？谑兄攸c實驗室，國家對蝦加工技術(shù)研發(fā)分中心（海南），海南大學食品科學與工程學院，海南?？?570228；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連理工大學，遼寧大連 116034）

幾丁質(zhì)（Chitin，CI）又名甲殼素，是一種天然多糖，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，是世界上僅次于纖維素的第二豐富的多糖[1-2]，廣泛存在真菌和藻類的細胞壁以及節(jié)肢動物（如昆蟲、蝦和蟹）的外殼中[3]。CI 經(jīng)脫乙?；饔煤蟮玫綒ぞ厶牵–hitosan，CS）（圖1），由于質(zhì)子化作用，CS 可以溶于酸性介質(zhì)，如稀乙酸和甲酸[4-5]。但是，CI 和CS 的分子量和聚合度（Degree of Polymerization，DP）較高，結(jié)構(gòu)致密，水溶性差，因而限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。殼寡糖（Chitooligosaccharide，COS）是CI 或CS 通過酶法或化學法降解后獲得的GlcNAc 和D-葡萄糖胺（D-glucosamine，GlcN）的同源或異源低聚物，DP 為2～20。COS 是目前已知的少數(shù)堿性寡糖之一，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[6-8]，在食品、醫(yī)療保健和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價值。基于此，將CI 轉(zhuǎn)化為溶解度高、生物活性廣泛的COS 更有利于推動其在商業(yè)中的應(yīng)用[4,9-10]。

圖1 幾丁質(zhì)和殼聚糖的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of chitin and chitosan

COS 的制備方法包括物理法、傳統(tǒng)化學法、電化學法、酶法以及化學-酶法。傳統(tǒng)化學法利用酸或堿脫去CI 的乙?；岣叩孜锏娜芙舛龋S后發(fā)生解聚作用生成水溶性的COS。該法操作簡單，更容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。COS 的生物功能與其DP 和乙酰化程度（Degree of Acetylation，DA）密切相關(guān)。然而，化學反應(yīng)條件劇烈，很難獲得具有特定DP 和DA 的COS 產(chǎn)物。因此，研究者將目光轉(zhuǎn)向了反應(yīng)過程溫和、可控、對環(huán)境更加友好的酶法。近些年來，酶法水解CI 制備COS 一直是研究的熱點。為了解決CI 結(jié)晶度高、酶法水解效率低的問題，更多的反應(yīng)工程策略被提出，如多酶聯(lián)合法以及化學-酶法。同時，為了進一步獲得高純度、高品質(zhì)的COS以滿足生物醫(yī)學和食品加工業(yè)的需求，研究者們探索了不同的分離純化方法，如超濾法、色譜法和活性炭吸附法等。因此，本文對近些年COS 的制備和純化方法進行了總結(jié)，同時對COS 的應(yīng)用研究進展進行了綜述，以期為高品質(zhì)COS 的制備以及應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供理論基礎(chǔ)。

1 殼寡糖的制備

1.1 酶解法

酶法是一種反應(yīng)條件較為溫和的方法，通常在常溫、常壓和中性pH 環(huán)境下催化反應(yīng)的進行，很少使用對環(huán)境有害的試劑，生成的產(chǎn)物供人們使用安全，因而產(chǎn)物可被用于農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)和生物醫(yī)學等多個領(lǐng)域[11]。與此同時，隨著遺傳學、蛋白質(zhì)工程和生物信息學等生物技術(shù)的發(fā)展，酶在許多工業(yè)過程中的應(yīng)用開啟了新時代。在過去的幾十年里，酶法降解CI 和CS 已被認為是一種十分具有發(fā)展前景的方法。目前，用于水解CI 和CS 的酶分為專一性酶和非專一性酶。專一性酶包括幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶等，而非專一性酶包括纖維素酶、溶菌酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶和胃蛋白酶等。

1.1.1 幾丁質(zhì)酶 幾丁質(zhì)酶是專一性降解CI 生成N-乙酰殼寡糖或單糖的一類酶的總稱，由多種微生物（包括病毒、細菌和真菌）、昆蟲或高等動植物合成[11-12]。根據(jù)水解作用模式，可以將幾丁質(zhì)酶分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）、外切幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.29）和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52）。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在多糖鏈內(nèi)部隨機水解CI 的糖苷鍵，生成GlcNAc 或其可溶性低聚物。外切幾丁質(zhì)酶在CI 的還原端或非還原端水解多糖鏈生成（GlcNAc）2，而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可以將（GlcNAc）2水解為GlcNAc 或從N-乙酰殼寡糖的非還原端釋放GlcNAc[13]（圖2）。

圖2 幾丁質(zhì)降解酶降解幾丁質(zhì)的示意圖[14]Fig.2 Schematic diagram of chitin degraded by chitinolytic enzymes[14]

在自然界中，CI 資源十分豐富，在CI 降解微生物的作用下將其轉(zhuǎn)化為可被利用的碳源和氮源以維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。因而，研究者們一直致力于從富含幾丁質(zhì)的環(huán)境中分離、純化幾丁質(zhì)降解微生物，進而獲得幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶或溶解性多糖單加氧酶等參與幾丁質(zhì)降解的酶系。Le 等[15]從鹽蝦樣品中篩選到了能夠降解幾丁質(zhì)的微生物Salinivibriosp.BAO-1801，并從其發(fā)酵液中純化到了幾丁質(zhì)酶BAO-1801。該幾丁質(zhì)酶水解膠體幾丁質(zhì)后生成的主要產(chǎn)物為（GlcNAc）2，反應(yīng)8 h 后產(chǎn)率為71.5%。Wang 等[16]從蝦殼廢棄物中篩選到了能夠產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的菌株Trichoderma gamsiiR1，當以純化的幾丁質(zhì)酶水解膠體幾丁質(zhì)時，生成的產(chǎn)物為GlcNAc、（GlcNAc）2和（GlcNAc）3，產(chǎn)率分別為1.73、11.62和1.92 mg/mL。Fu 等[17]從海洋沉積物中分離到了一株海洋細菌Exiguobacterium antarcticumDW2，該菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶EaChi39 能夠?qū)⒛z體幾丁質(zhì)水解為GlcNAc、（GlcNAc）2和（GlcNAc）3，產(chǎn)率分別為9.9、14.8 和5.0 mg/mL。

為了解決野生酶產(chǎn)量低、分離純化過程復雜等問題，可以借助基因工程技術(shù)對幾丁質(zhì)酶基因進行異源表達。Thomas 等[18]在Escherichia coliM15 中克隆表達了Vibrio campbellii幾丁質(zhì)酶基因，得到的重組幾丁質(zhì)酶VhChiA 能夠以魷魚軟骨、蝦殼和蟹殼來源的膠體幾丁質(zhì)作為底物，主要產(chǎn)物均是（GlcNAc）2，產(chǎn)率分別為0.60、0.85 和0.34 mmol/L。Gao 等[19]在E.coliBL21 克隆、表達了來自Streptomyces albolongusATCC 27414 的幾丁質(zhì)酶基因，獲得的重組幾丁質(zhì)酶SaChiA4 能夠?qū)⒛z體幾丁質(zhì)水解為GlcNAc 和（GlcNAc）2，產(chǎn)率分別為0.87 和2.17 mg/mL。大多數(shù)能夠分解CI 的微生物細胞內(nèi)含有多個幾丁質(zhì)降解酶，而幾丁質(zhì)的高效降解可能是由這些酶聯(lián)合作用完成[20]。Suzuki 等[21]報道了來自Serratia marcescens2170 的三個重組幾丁質(zhì)酶Chi A、Chi B 和Chi C1，當Chi A 與Chi B 或Chi A與Chi C1 共同作用降解CI 粉末時，（GlcNAc）1-3的總產(chǎn)量分別提高了80%和45%，而當三種幾丁質(zhì)酶同時作用于幾丁質(zhì)粉末時，（GlcNAc）1-3的總產(chǎn)量約提高了100%。因此，多種幾丁質(zhì)酶聯(lián)合使用是實現(xiàn)幾丁質(zhì)高效降解的有效手段，并且已在多篇報道中被證實[22-24]。

1.1.2 殼聚糖酶 CI 降解的另一種途徑是將其去乙?；癁镃S，之后在殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）的作用下轉(zhuǎn)化為COS。殼聚糖酶是一種糖苷水解酶，能夠水解部分乙?；疌S 中的β-1,4-糖苷鍵[25-26]。根據(jù)其對CS 鏈中四種結(jié)構(gòu)單元即GlcNAc-GlcN（A-D）、GlcN-GlcNAc（D-A）、GlcN-GlcN（D-D）和GlcNAc-GlcNAc（A-A）的水解特異性，可分為四種類型（CLASS Ⅰ-Ⅳ）（表1）[27]。而根據(jù)對底物的水解作用位點，殼聚糖酶又可分為內(nèi)切殼聚糖酶和外切殼聚糖酶兩種類型。內(nèi)切殼聚糖酶的酶解產(chǎn)物主要為二聚體到六聚體，而外切殼聚糖酶的酶解產(chǎn)物只有單糖[28]。Doan 等[29]從Paenibacillussp.TKU047 的發(fā)酵液中純化到了內(nèi)切殼聚糖酶TKU047，隨后該課題組以粗酶液酶解脫乙酰度為98%的殼聚糖，產(chǎn)物為DP 2～9 的COS，產(chǎn)率為68.44%。趙華等[30]通過硫酸銨沉淀分離純化Bacillus cereus發(fā)酵上清液中的殼聚糖酶，利用響應(yīng)面法獲得了最佳酶解條件，最終COS 的產(chǎn)物濃度可達到35.73 μmol/mL。羅灑等[31]克隆、表達了來自Bacillus amyloliquefaciensECU08的內(nèi)切殼聚糖酶，該酶酶解脫乙酰度為87.53%的CS 后主要產(chǎn)生DP 為2～3 的COS，并且在30 L 規(guī)模的擴大試驗研究中總產(chǎn)物的生產(chǎn)收率和原料收率分別為75.8%和85.1%。物料衡算和經(jīng)濟核算表明，該工藝收益較高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

表1 四種不同裂解結(jié)構(gòu)單元的殼聚糖酶Table 1 Chitosanase with four different cleavage structural units

1.1.3 溶解性多糖單加氧酶 在自然界中，除了幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶等糖苷水解酶外，溶解性多糖單加氧酶（EC 1.14.99.54，Lytic Polysaccharide Monooxygenase，LPMO）也是參與幾丁質(zhì)降解的關(guān)鍵酶之一。LPMO 是一種銅依賴性酶[32]，銅離子結(jié)合在特殊的組氨酸支架中，使LPMO 具有顯著的氧化能力，在電子供體（如抗壞血酸）存在的情況下，可以催化多糖結(jié)晶區(qū)域的糖苷鍵氧化裂解，使氧化位點附近區(qū)域的結(jié)晶度降低，并且產(chǎn)生新的鏈端供糖苷水解酶識別，進而提高水解效率（圖2）[14,33-34]。LPMO 與水解酶協(xié)同作用，在結(jié)晶性多糖如纖維素和CI 的生物轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮了重要作用。Zhang 等[35]將來源于Bacillus amyloliquefaciens的BtLPMO10A 和BtLPMO10B 分別與S.marcescens來源的幾丁質(zhì)酶SmChiB 協(xié)同作用降解α-幾丁質(zhì)，與SmChiB 單獨酶解組相比，（GlcNAc）2的產(chǎn)量由0.21 mg/mL 分別提高至1.35和1.17 mg/mL。Vaaje-Kolstad 等[36]克隆、表達了來源于Lactococcus lactisssp.lactisIL1403 的幾丁質(zhì)酶LlChi18A 和LPMO（LlCBP33A），并用于降解α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)。以α-幾丁質(zhì)作為底物，相同反應(yīng)時間下，僅以LlChi18A 作為催化劑時（GlcNAc）2的產(chǎn)率約為130 μmol/L，在LlCBP33A的協(xié)同作用下（GlcNAc）2的產(chǎn)率提高至大約165 μmol/L。以β-幾丁質(zhì)作為底物，僅以LlChi18A作為催化劑反應(yīng)350 h 后（GlcNAc）2的產(chǎn)率約為160 μmol/L，但是在LlCBP33A 的協(xié)同作用下僅需50 h 即可達到相當?shù)漠a(chǎn)率。之后，該課題組克隆、表達了來源于Enterococcus faecalisV583 的幾丁質(zhì)酶EfChi18A 和LPMO（EfCBM33A）降解α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)。僅以EfChi18A 作為催化劑時（GlcNAc）2的產(chǎn)率分別約為60 和300 μmol/L，在EfCBM33A的協(xié)同作用下（GlcNAc）2的產(chǎn)率分別提高至大約85 和1050 μmol/L[37]。LPMO 在與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用降解CI 方面展現(xiàn)了優(yōu)越的催化性能，從其被發(fā)現(xiàn)能夠氧化裂解結(jié)晶多糖后一直是研究的熱點，并且從工業(yè)和科學的角度來說都具有重要的研究意義。然而，LPMO 在催化反應(yīng)過程中需要加入電子供體，在工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用中額外添加電子供體生產(chǎn)成本較高。因此，尋找價格低廉的電子供體，構(gòu)建高效降解幾丁質(zhì)的生物催化體系，并揭示其協(xié)同作用機制是未來研究的重要方向。

1.1.4 非專一性酶 除了上述特異性酶類外，還有一些非特異性酶類對CI 和CS 也展現(xiàn)了較高的水解活性。黃曉月等[38]以被廣泛用于食品工業(yè)的木瓜蛋白酶作為催化劑水解CS，通過單因素及響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化工藝條件最終獲得DP 為6～10 的COS，產(chǎn)率為45.07%。Dong 等[39]對比研究了纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、溶菌酶、木聚糖酶和β-糖苷酶對CS 的水解活性，其中纖維素酶和木瓜蛋白酶展現(xiàn)了較高的水解活力。隨后，該課題組構(gòu)建了包括纖維素酶、木瓜蛋白酶和殼聚糖酶的聯(lián)合酶系統(tǒng)水解CS，制備的COS DP 為6～8，目標產(chǎn)物的產(chǎn)率為79.84%。另有報道采用α-淀粉酶水解經(jīng)H2O2預處理后的CS 制備出DP 為2～8 的COS，在最適反應(yīng)條件下，COS 的產(chǎn)量約為1.05 mmol/g[40]。

1.2 物理法

用于制備COS 的物理法包括紫外輻射、超聲破碎和微波處理等。Xing 等[41]采用微波輻射法（80 ℃，800 W，輻射時間25 min）制備的COS 聚合度為2～6，并且具有免疫調(diào)節(jié)活性。Wu 等[42]利用渦輪空化裝置進行旋流空化降解CS，反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后CS 的結(jié)晶度降低了83.65%，溶解性得到極大的增強。Margoutidis 等[43]利用球磨機使CI 的結(jié)晶度降低50%，并且添加天然粘土高嶺石可以使CI 的溶解度增加1 倍，獲得的產(chǎn)物為GlcNAc 和（GlcNAc）2。物理法操作相對簡單，但是獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量較低，且降解程度有限，進而限制了其大規(guī)模生產(chǎn)，無法產(chǎn)生較大的社會經(jīng)濟效益[44-46]。

1.3 化學法

目前，用于水解CS 制備COS 的化學試劑有酸（如鹽酸、亞硝酸和磷酸）和氧化還原劑（如過氧化氫、臭氧和次氯酸）[47-49]。酸性溶液中的氫離子能夠與CS 分子中的游離氨基結(jié)合，使得CS 的分子間氫鍵斷裂，從而獲得DP 不等的COS[50]。如季者等[51]研究了鹽酸對CS 的降解作用，在60 ℃下、以9 mol/L 的鹽酸降解CS 后獲得的主要產(chǎn)物為殼五糖和殼六糖，其總產(chǎn)量為16.2%。氧化劑在水溶液中形成的游離自由基可以斷裂CS 的糖苷鍵，進而形成DP 不等的COS[50]。如焦富穎[52]利用H2O2降解CS 制備COS，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，即0.5wt%殼聚糖，8vol% H2O2，反應(yīng)時間5 h，反應(yīng)溫度50 ℃，產(chǎn)物的分子量在2000 Da 左右，收率為85%?；瘜W法制備COS 操作簡單，但是降解產(chǎn)物的DP 范圍分布廣泛，產(chǎn)量低。使用酸性溶液制備COS 時，生成的產(chǎn)物安全性低，生成的二級產(chǎn)物難以分離，殘留酸和由此產(chǎn)生的有毒廢棄物后續(xù)處理復雜，易造成環(huán)境污染[53]。使用氧化劑降解CS 時，若氧化劑濃度或反應(yīng)溫度過高，會導致CS 水解過度，產(chǎn)物的氨基損失較多，顏色也會由于褐變而加深，使得品質(zhì)下降。因此，CS 經(jīng)氧化劑部分降解后，需結(jié)合后續(xù)的分離純化過程以得到高品質(zhì)的COS。

此外，電化學法也被報道用于制備COS。通常來講，電極材料基本分為兩種類型，一種為活性電極（如Ti/TiO2-RuO2電極），另一種為非活性電極（如Ti/Sb-SnO2電極）[54]。Cai 等[55]利用Ti/TiO2-RuO2電極降解CS，CS 的分子量隨著電流密度的增加而降低。當電流密度增大至160 mA/cm2時，處理1 h后CS 的黏均分子量由491 kDa 降低至33 kDa。之后，該課題組分別利用Ti/Sb-SnO2和Ti/TiO2-RuO2電極降解CS，在60 mA/cm2的電流密度條件下處理1 h 后，CS 的黏均分子量由479 kDa 分別降低至46 kDa 和158 kDa[54]。電化學法操作簡單，無污染，具有潛在的應(yīng)用價值。但是，該方法存在電極壽命短、易失效等問題。因此，開發(fā)出具有更高電流效率和更低成本的制備裝置是該領(lǐng)域未來研究的重點。

1.4 化學-酶法

單一法制備COS 會存在一定的不足，如酶解法無法高效水解CI 致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，多數(shù)情況下需要將CI 制備成膠體CI。通過化學法預處理CI 能夠提高酶解效率，起到“1+1＞2”的效果。鄭必勝等[56]在60 ℃下用過氧化氫（4%，w/v）、乙酸（4%，w/v）預處理脫乙酰度為96.7%的CS，使得CS 的表面結(jié)構(gòu)被破壞，孔隙增多，獲得DP＜10 的COS，產(chǎn)率約為62%。Sivaramakrishna 等[57-58]利用氫氧化鉀（11.2%～20%）水溶液或氫氧化鉀（11.2%～20%）-尿素（4%）水溶液預處理CI，結(jié)果表明CI 經(jīng)預處理后酶解效率顯著提高，COS 產(chǎn)率約為70%。

上述用于預處理CI 的化學試劑為強酸或強堿試劑，反應(yīng)條件苛刻，對環(huán)境不友好。為了滿足綠色化工的生產(chǎn)理念，亟需綠色、溫和的溶劑來替代上述化學試劑。離子液體（Ionic liquids，ILs）是一種在室溫下以液體形式存在的離子化合物，具有熔點低、穩(wěn)定性高、無揮發(fā)性、可回收等特點，因而對環(huán)境的化學污染較小。ILs 能夠溶解天然聚合物，如CI[59]或纖維素[60]。幾丁質(zhì)經(jīng)ILs 預處理并再生后，氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重排，表面結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)晶度降低[23,61]。因此，研究者們構(gòu)建了基于ILs 和幾丁質(zhì)酶的化學-酶法降解幾丁質(zhì)制備單糖和寡糖（表2）。盡管ILs 被稱為“綠色溶劑”，但是其對水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響還有待評估[62]。

表2 ILs-酶法制備COSTable 2 Preparation of COS by ILs-enzymatic process

2 殼寡糖的純化

通過酶法、化學法或協(xié)同法降解CI 或CS 后獲得的產(chǎn)物通常為單體、低聚物或同分異構(gòu)體的混合物，產(chǎn)物的分子量和DP 分布較寬。為了更好地揭示COS 的構(gòu)效關(guān)系以及滿足生物醫(yī)學和食品加工業(yè)對其純度和質(zhì)量的要求，選擇合適的方法從混合物中分離和鑒定所需要的COS 至關(guān)重要。由于COS分子中含有較多的氨基和羥基，并且存在較強的分子間或分子內(nèi)作用力，因而增加了分離純化的難度。

2.1 超濾法

利用膜生物反應(yīng)器超濾提純COS 是較為常見的方法，具有操作簡便、綠色環(huán)保、成本低等優(yōu)點。影響COS 回收率的因素包括膜的類型、操作溫度、進料溶液的pH 和溶液的濃度[65]。Yu 等[66]采用截留分子量為3 kDa 的超濾膜制備膜生物反應(yīng)器，當停留時間為50 min 時，高DP 的COS（DP≥5）產(chǎn)物純度約為28%，當停留時間為100 min 時，高DP 的COS（DP≥5）產(chǎn)物純度約為48%。Aider 等[67]利用電滲析和超濾聯(lián)合法分離純化DP 為2～4 的COS混合物，研究發(fā)現(xiàn)二聚體在不同的pH 下均能達到最佳純化效果，其次是三聚體，最后是四聚體。根據(jù)處理時間的不同，在pH6 的條件下可以將二聚體和三聚體分離出來，或者在pH7 條件下僅將二聚體分離出來。仲偉偉等[68]選用截留分子量為10 kDa 的卷式超濾膜對COS 粗品進行超濾，超濾所得樣品純度為78.58%。吳健鋒[69]在35 ℃下采用2.5 kDa 的超濾膜截留DP 為2～6 的COS，最終目標產(chǎn)物的純度高達93.88%。膜生物反應(yīng)器易于操作，通過截留分子大小的方式可以有效地提高產(chǎn)物純度，更好地達到分離純化的目的。

2.2 色譜法

色譜法純化COS 包括離子交換色譜（Ion Exchange，IEC）法、薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）法和高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法等。IEC 法是利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離的方法，一般選擇離子交換樹脂作為固定相。Wei[70]及Li 等[71]利用CM-葡聚糖凝膠C-25 柱對不同DA 的殼六糖成功進行了分離純化，可得到純度高達93%的殼六糖。TLC 法是利用各組分對同一吸附劑吸附能力不同，在流動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）不斷發(fā)生吸附—解吸過程中將各組分分離。該法以相對較低的成本，基于DP 對低聚物混合物進行分析。Chen 等[72]在硅膠板上以甲醛:甲醇:25%氨水:水=5:10:1.5:1（v/v/v/v）混合試劑作為展開劑成功分離出GlcN，Le 等[15]以正丁醇:乙酸:水=2:1:1（v/v/v）混合試劑作為展開劑在硅膠板上成功分離出DP 為1～6 的COS。除此之外，已被報道用于分離COS 的展開劑還有正丁醇:甲醇:25%氨水:水=5:4:2:1（v/v/v）[56]、正丙醇:水:28%氨水=70:15:15（v/v/v）[73]和正丁醇:水:乙酸:氨=10:5:5:1（v/v/v/v）等[74]。相較于TLC 法，HPLC 法可以結(jié)合質(zhì)譜法基于DP 和DA 進行精確分析。由于含有乙酰氨基，GlcNAc 在204 nm 處有最大紫外吸收。因此，配備紫外檢測器的HPLC 只能檢測到部分乙?；蛲耆阴；腃OS。除了紫外檢測器外，也可以配備示差折光檢測器對COS 進行分析。嚴佳佳等[75]利用色譜柱SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離純化到了酶解產(chǎn)物中的GlcN 和GlcNAc，Li 等[63]利用色譜柱Sugar Pak I（6.5×300 mm）對酶解產(chǎn)物中的GlcNAc 和（GlcNAc）2進行分離純化。此外，Aminex HPX-87H（300×7.8 mm）[23]、Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6×250 mm）[68]和Shodex Asahipak NH2P-50E（4.6×250 mm）[7]等色譜柱均被用于COS 的分離純化。

2.3 其他分離純化方法

活性炭因結(jié)構(gòu)疏松多孔、表面積大而具有較強的吸附性，同時由于成本較低而被廣泛應(yīng)用。Yu等[76]通過間歇模式實驗，探究了活性炭對COS 吸附效率的影響因素。結(jié)果表明，活性炭顆粒越小對COS 的吸附能力越強，pH 為8～9 時吸附量最大，在接觸時間小于60 min 時隨著接觸時間的延長吸附量增大，而后達到吸附平衡狀態(tài)，溫度對活性炭吸附COS 的能力無顯著影響。毛細管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）法也用于分離純化COS，僅需要少量的溶質(zhì)和溶劑，分離時間短，分辨率高。然而，復雜的衍生化過程以及昂貴材料的使用使得該法經(jīng)濟成本較高[77]。此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)是分析生物分子，如脂類、糖類、多肽和其他有機大分子的最合適的技術(shù)。但是，該方法不適合檢測分子量低于500 Da 的樣品[78]。

3 殼寡糖的應(yīng)用

3.1 殼寡糖在食品加工貯藏領(lǐng)域的應(yīng)用

COS 具有廣泛的抗菌活性，可以抑制多種致病菌和腐敗微生物的生長[79-80]，因而已被用于食品防腐和果蔬保鮮。在釀酒過程中加入500 mg/L 的COS（平均分子量＜2000 Da，DP 2～10）可以抑制腐敗微生物的生長，但是對釀酒酵母的生長無影響[81]。向生牛乳中添加0.24% COS 并置于4 ℃下保存12 d，與未添加COS 的對照組相比，其嗜熱菌和嗜冷菌至少降低3 個數(shù)量級[82]。在面包中加入1%的COS，面包中食源性病原菌及根霉菌的生長均受到抑制[83]。COS 還具有良好的成膜特性，以濃度為1.5 g/100 mL的COS（分子量700 Da 左右）溶液對鮮切蘋果進行涂膜處理，菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌和大腸菌群數(shù)明顯低于對照組。COS 涂膜處理還能調(diào)控抑制鮮切蘋果呼吸強度的增強，保持可溶性固形物和可滴定酸含量的穩(wěn)定，防止失重率增加，減緩軟化[84]。

COS 具有抗氧化活性，可以改善食品品質(zhì)，延長食品的貨架期。向低筋小麥粉中加入1%的COS后，不僅能夠改善餅干制品的組織結(jié)構(gòu)，使酥性餅干斷面結(jié)構(gòu)氣孔細密均勻，同時降低餅干的硬度和咀嚼性，提高餅干的酥松度，改善口感滋味。與此同時，COS 的加入使得餅干樣品的酸價、過氧化值和TBA 值降低，有效延緩了儲藏期餅干的氧化酸敗，延長了酥性餅干的保質(zhì)期[85]。以4 mg/mL 的COS 溶液（DP 2～4）對湘派休閑豆干進行涂膜處理，能夠有效延緩樣品在常溫貯藏過程中微生物的生長繁殖及品質(zhì)劣變，使樣品貨架期延長20 d 以上[86]。此外，COS 對食物在預處理過程中引起的多不飽和脂肪酸氧化有抑制作用，進而延長食物的貨架期[87]。

COS 可以改善貯藏過程中果皮活性氧的代謝情況，進而降低果皮褐變發(fā)病率。劉麗丹等[88]用0.5%的COS 溶液浸泡枇杷果實，使果實在冷藏期間保持較高的可溶性固形物、還原型抗壞血酸及還原糖含量，同時多酚氧化酶活性受到一定抑制，枇杷果實失重率、褐變指數(shù)和腐爛指數(shù)均明顯降低。趙韓棟等[89]用0.5%的COS（平均分子量1500～2000 Da，脫乙酰度95%）水溶液對皇冠梨進行貯前浸泡處理，在低溫貯藏過程中，果皮中多酚氧化酶、脂氧合酶活性的上升，過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性維持在較高水平，果皮中總酚、抗壞血酸維持在較高水平，過氧化氫和丙二醛的積累減少，果實褐變發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)分別下降了89%和32%。段樹華等[90]用濃度為1%的COS 溶液浸泡處理甜櫻桃，使得低溫貯藏過程中果實的可滴定酸、維生素C、總酚的含量下降，多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性升高，丙二醛含量降低，膜脂質(zhì)過氧化水平降低，有效防止了甜櫻桃果實在貯藏期的的衰老褐變，保持了果實的風味品質(zhì)。

COS 具有良好的吸濕性、持水性和熱穩(wěn)定性，并且能夠防止淀粉老化。制作海綿蛋糕時，向低筋小麥粉中加入1wt%的COS（分子質(zhì)量＜3000 Da）有助于增加面糊的黏彈性以及降低面糊密度，可使蛋糕成品表面色澤均勻、組織細膩、有彈性、氣孔均勻、滋味與口感良好[91]。制作擠壓面粉制品時，向小麥粉中加入3.2wt%的COS（純度＞80%）可顯著增強面團的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)，減緩淀粉的降解過程，面制品的含水率、膨脹率及吸油率增加，硬度降低，品質(zhì)得到提升[92]。

3.2 殼寡糖在醫(yī)療保健領(lǐng)域的應(yīng)用

COS 具有多種生物活性，被腸上皮細胞吸收后可以到達身體的各個部位，進而發(fā)揮其生理功能[93]。王勝田等[94]研制了一種含COS、銀杏葉提取物、丹參提取物及淀粉的COS 膠囊，具有輔助降血脂作用，并且對化學性肝損傷有輔助保護功能。郝桂娟等[95]研究發(fā)現(xiàn)，COS-Zn2+配合物對氧化衰老模型小鼠的機體臟器恢復有一定的幫助作用，能夠顯著提高機體血清、腎臟和肝臟中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性和總抗氧化能力，展現(xiàn)了較好的抗衰老及增強機體免疫功能作用。蘇政權(quán)等[96]研制了一種COS 腸溶膠囊，內(nèi)容物包括腸溶輔料、殼寡糖和釋放調(diào)節(jié)劑，三者的質(zhì)量比為（3～5）:1:1。在COS 的干預下，小鼠腸道菌群能減少高脂高糖飲食中膳食脂肪的攝入，從而實現(xiàn)抗肥胖的效果；血糖水平也顯著降低，即該COS 腸溶膠囊表現(xiàn)出良好的輔助調(diào)節(jié)血糖作用。COS（分子量約為2000 Da）可以打開小腸微絨毛上皮細胞間的緊密連接，從而提高腸道的通透性?；诖?，COS 可作為BCSⅢ類藥物的口服吸收促進劑[97]。

COS 已被批準為“新食品原料”[98]，因此，諸多含有COS 成分的功能性食品已被開發(fā)，以期使得飲食干預成為治療某些疾病的有效手段。莊林等[99]研究發(fā)現(xiàn)以COS、海洋魚低聚肽、櫻桃粉、茯苓粉為主要成分的復合固體飲料能夠通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群組成和短鏈脂肪酸水平改善高尿酸血癥。姜雅杰等[100]研究了含有COS、白蕓豆提取物、水蘇糖、葡聚糖及亞麻籽油的復合固體飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明該復合固體飲料可以促進腸道內(nèi)有益菌的生長與定植，降低條件致病菌的相對豐度，在提高腸道免疫力同時具有輔助治療Ⅱ型糖尿病的功效。喻凱[101]研發(fā)了一種能夠增強腸胃功能及免疫力的幾丁寡糖食品，其配方主要包含幾丁寡糖、膳食纖維及益生菌類。王孝文等[102]開發(fā)了一種以COS、滸苔多糖、藥用淀粉、硬脂酸鎂為主要原料的保健食品，該產(chǎn)品有益于提高機體免疫力，增強免疫功能?？傊?，COS 呈現(xiàn)出的多元化功能使其在保健品的開發(fā)中具有很高的應(yīng)用價值。

3.3 殼寡糖在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

在農(nóng)田中施加一定量的COS 不僅可以起到抗病毒、抑菌的功效，還能在一定程度上調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。在抗煙草花葉病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，COS 可以提高葉片中多種防御酶的活性，不僅可以有效減少煙葉感染煙草花葉病毒的枯斑數(shù)，也可以降低已染病毒煙草中葉綠素的下降幅度[103]。高雨萌[104]等探究了COS（平均分子量3000 Da，脫乙酰度為90%）對花椒干腐病的防治效果，發(fā)現(xiàn)濃度為0.5 mg/mL 的COS 溶液對花椒盆栽苗干腐病的防治效果可達到65.02%。COS 在低溫下可以使水稻的相對電導率顯著降低，降低丙二醛對水稻的危害，進而減少低溫對水稻幼苗的傷害。COS 也可以提高幼苗的抗旱能力，對提高作物的耐鹽能力有一定的效果[105]。金國強等[106]分別用分子量為1500 和2500 Da 的COS溶液對宮川溫州蜜柑進行1000 倍樹冠葉面噴霧處理后，果實中可溶性固形物含量升高，可滴定酸濃度降低，果實的品質(zhì)得到了改善。黃雪燕等[107]分別用分子量為1000 和2000 Da 的COS 溶液對溫嶺高橙進行200、500 和1000 倍的葉片噴霧和根部澆灌處理，收獲的單果質(zhì)量均高于對照組。此外，COS 在防治果蔬的采后病害[108]、誘導植物先天免疫[109]、增強植物生理反應(yīng)[110]等方面的應(yīng)用也被廣泛報道。

4 結(jié)論

CI 在自然界中含量豐富，生物相容性好，無毒性作用，降解后獲得的COS 分子量低，溶解度高，具有多種生物活性。迄今為止，盡管關(guān)于COS 的制備、純化和應(yīng)用研究已取得了巨大進展，但是仍存在一定的不足。對于如何綠色、大規(guī)模地獲取高純度的COS 仍是當下面臨的主要挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)化學法較易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是由于反應(yīng)過程不可控制而無法保持產(chǎn)物品質(zhì)的穩(wěn)定性，進而限制了其在下游特定領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，反應(yīng)過程中使用的化學試劑對環(huán)境有害。酶法反應(yīng)過程溫和，反應(yīng)過程可控，尤其是采用基因工程技術(shù)對酶進行改造以及采用協(xié)同催化體系（如多酶聯(lián)合法或化學-酶法等）后，CI 的降解效率顯著提高。因此，優(yōu)質(zhì)酶種的挖掘、制備工藝的優(yōu)化仍是未來努力的方向。物理法和電化學法的出現(xiàn)也為COS 的制備提供了新的技術(shù)路徑，值得進一步探索。在COS 的高效制備過程中，可能存在目標產(chǎn)物純度低、雜質(zhì)過多等問題，因此如何選擇合適的分離純化方法、并以較低的經(jīng)濟成本建立大規(guī)模的純化體系仍需繼續(xù)深入研究。此外，COS 在食品加工貯藏領(lǐng)域、醫(yī)療保健領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用已被廣泛報道，但是對于COS 生物活性背后的作用機制仍不明確。因此，對于COS 的構(gòu)效關(guān)系仍需不斷探索，這對于實現(xiàn)其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

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