桃褐腐病抗性鑒定技術(shù)與應(yīng)用

薛璐 楊英軍 李勇

摘 要：桃褐腐病是果樹上的常見病害，給桃樹生產(chǎn)造成巨大損失。發(fā)掘抗褐腐病種質(zhì)資源，培育抗病品種在桃生產(chǎn)中具有重要意義。研究建立了桃褐腐病離體鑒定技術(shù)規(guī)程，包含菌種獲得、菌種鑒定、人工接種、抗性鑒定等主要技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)，并應(yīng)用于105份桃種質(zhì)資源的抗褐腐病鑒定，發(fā)現(xiàn)褐腐病抗性呈現(xiàn)正態(tài)分布，抗性較強(qiáng)的有11份種質(zhì)。

關(guān)鍵詞：桃褐腐??；抗性；種質(zhì)資源；鑒定技術(shù)

作為桃樹上常見的重要病害，桃褐腐病從果實幼果至成熟期間均有可能發(fā)生，其對果實的危害最為嚴(yán)重。成熟期和貯藏期的果實受害最為嚴(yán)重，此外貯藏期爛果還會導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。選取殺菌劑防治果樹褐腐病在果樹生產(chǎn)中是最高效的方法，因其低毒害、高效率的特點(diǎn)而得到大眾認(rèn)可。但隨著時間的推移，在實踐中也暴露出一些缺點(diǎn)，其作用的機(jī)制專一，長期使用殺菌劑會使田間植物的病原菌產(chǎn)生抗性，并且對田間環(huán)境也會產(chǎn)生影響。因此，篩選抗褐腐病桃種質(zhì)、培育抗褐腐病桃新品種是桃育種過程中的重要突破點(diǎn)。

1987年，巴西最早開始人工接種并篩選抗性種質(zhì)，Bolinha[1]為第一個篩選出具有桃褐腐病抗性的品種。之后巴西利用具有褐腐病抗性來源的Conserva 672、Bolinha等材料作為親本培育了3個雜交組合，篩選了12株對褐腐病抗性表現(xiàn)較強(qiáng)的單株[2]。2022年，沈志軍等[3]利用616份桃資源進(jìn)行褐腐病抗性鑒定，篩選出10份抗侵染能力較強(qiáng)的種質(zhì)資源。用抗性材料作為育種親本是培育抗褐腐病品種的有效辦法。筆者在本研究中針對國家園藝種質(zhì)資源庫鄭州桃圃的優(yōu)勢菌株，參考前人鑒定流程并作出修改，形成桃種質(zhì)資源的鑒定技術(shù)，有效推進(jìn)桃褐腐病抗性育種的進(jìn)程。

1 桃褐腐病病原菌的分離與鑒定

1.1 材料

于國家桃種質(zhì)資源庫鄭州桃圃采集具有桃褐腐病典型特征的病果。

1.2 褐腐病病原菌分離鑒定

1.2.1 病原菌的分離與純化 在桃園中尋找?guī)в泻指√卣鞯奶覙悠?，放置在取樣袋中，帶到分子實驗室做病原菌的分離工作。方法如下：從褐腐病病果中挑取霉菌孢子，選取單孢分離法[4]分離病原菌。使用滅過菌的針頭從果實發(fā)病部位邊緣挑取較新鮮的分生孢子堆，并將其接種于PDA培養(yǎng)基（配方：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15～20克，水1000毫升，自然pH值。培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃ 30分鐘高壓蒸汽滅菌）上，于22 ℃全黑暗霉菌培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。待褐腐病原菌菌落生長出菌絲，于菌絲外緣位置取少量，接種至新的培養(yǎng)基。經(jīng)過3代的分離和純化，獲得褐腐病病原菌株。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 分離與純化后的病原菌株接入PDA培養(yǎng)基，在全暗霉菌培養(yǎng)箱放置5天，觀察其形態(tài)，并利用顯微鏡查看分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)。菌落在培養(yǎng)基上的特征為：菌落邊緣相對整齊，顏色呈現(xiàn)灰黃色（圖1-A）；菌落的背面邊緣為淺灰色，中間為深色（圖1-B）；圖中的分生孢子梗呈現(xiàn)串珠狀，為不分枝或呈現(xiàn)二叉狀分枝，且為銳角（圖1-C）；分生孢子為無色單孢，為卵圓形（圖1-D）。根據(jù)魏景超[5]的《真菌鑒定手冊》和Lane[6]的褐腐病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒別方法，把測定菌株鑒定為Monilinia fructicola。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將菌株在PDA平板上活化5天，用滅過菌的槍頭刮下菌絲，置入2毫升離心管中，加入小鋼珠，在液氮中速凍后用磨樣機(jī)研磨。使用真菌DNA提取試劑盒（OMEGA試劑盒）提取病原菌基因組，并將DNA儲存于-20 ℃冰箱備用。采用真菌rDNA ITS通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）進(jìn)行菌株ITS序列測定，擴(kuò)增使用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25微升）如下：2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus） 12.5微升，DNA模板1微升，引物1（F）0.5微升，引物2（R）0.5微升，ddH2O 10.5微升。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃3分鐘，95 ℃15秒，58 ℃20秒，72 ℃ 60秒，共30個循環(huán)；72 ℃5分鐘。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，觀察到明亮目的條帶后，將產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的序列與NCBI中已知基因序列進(jìn)行BLST同源性檢索，并下載與測定菌株相似度超過99%的部分桃褐腐病病原菌株的基因序列。采取最大似然法和鄰接法，用MEGA10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)測序得到大小約500 bp的ITS片段序列，基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，筆者在本研究中鑒定的桃褐腐病病原菌菌株與Monilinia fructicola（GenBank 登錄號為 MZ047241.1）聚在一個分支上，二者相似度高達(dá)99%，因此測定菌株被鑒定為Monilinia fructicola（圖2）。

2 桃褐腐病抗性鑒定技術(shù)

2.1 病菌的培養(yǎng)

純化后的病菌使用濾紙片保存在超低溫冰箱，接種前20天使用PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)。用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的擴(kuò)繁，菌塊接種完成后，將其放到22 ℃的全暗霉菌培養(yǎng)箱，5天后備用?？剐澡b定參考前人的方法[7-8]，并作調(diào)整。挑取菌株的少量新鮮分生孢子的菌塊，用無菌水（含0.01%吐溫20）沖洗菌塊，用高級擦鏡紙進(jìn)行過濾，最大限度地減少菌絲碎片，從而得到分生孢子懸浮液。用顯微鏡與血球計數(shù)板觀察分生孢子狀態(tài)，并將分生孢子懸浮液的濃度調(diào)整為2×105個/毫升，用于桃果實接種。

2.2 果實采收與篩選

采收成熟度為八成，每份種質(zhì)采20～25個果實。采收后立即運(yùn)回控溫實驗室（24±1 ℃），平衡果實溫度4小時以上，選擇無病蟲害、無損傷，并且成熟度一致的桃果實，用于褐腐病抗性接種鑒定。采收桃果實需避開雨天。

2.3 接種鑒定

準(zhǔn)備透明塑料筐3個（尺寸為380毫米×250毫米×200毫米），底部鋪雙層吸水紙，倒入100毫升無菌水潤濕吸水紙，均勻放入18個培養(yǎng)皿（每個塑料筐可放6個培養(yǎng)皿），每個培養(yǎng)皿內(nèi)放1個墊圈，再放18個桃果實（12個用于接種，6個作為對照）。用小量程的移液槍吸10微升分生孢子懸浮液，滴向桃果實的側(cè)面中央部位，對照組則滴加等量無菌水。接種后的果實置于透明塑料筐中，蓋上筐蓋，保持濕度90%～95%。在（24±1）℃、光暗交替（光照12小時和黑暗12小時）的環(huán)境中培養(yǎng)，每天調(diào)查并記錄病果數(shù)量和病斑直徑。參考許志剛[9]的方法，將桃發(fā)病情況分為9級（表1），依據(jù)病果數(shù)計算各種質(zhì)接種褐腐病后的病情指數(shù)，病情指數(shù)=100×∑（各級發(fā)病果數(shù)×病級）/（果實總數(shù)×最高發(fā)病級數(shù)）。

3 桃褐腐病抗性鑒定技術(shù)應(yīng)用

根據(jù)上述桃果實褐腐病抗性鑒定技術(shù)，鑒定了105份桃種質(zhì)。由圖3可知，依托褐腐病抗性調(diào)查計算出的病情指數(shù)基本呈現(xiàn)正態(tài)分布?？共∨c感病品種的鑒定結(jié)果圖舉例如下（圖4），如圖所示，在第7天時，感病種質(zhì)有2/3的果實被大面積侵染，而抗病種質(zhì)未發(fā)現(xiàn)被侵染。

褐腐病樣本的調(diào)查統(tǒng)計如表2所示，結(jié)合105份桃種質(zhì)資源病情指數(shù)的聚類分析，將桃種質(zhì)對褐腐病病原菌的抗性劃分為5類：高抗HR、抗病R、中抗M、感病S、高感HS。

4 討論與結(jié)論

桃褐腐病為桃果實中的常見病害，會出現(xiàn)于桃生長發(fā)育的各個階段，對果實的影響最為嚴(yán)重，研究桃種質(zhì)對褐腐病的抗病感病情況尤為重要。目前對桃褐腐病離體接種的系統(tǒng)研究較少，本研究結(jié)合了前人研究方法，并將其完善。從105份桃資源中篩選的高抗種質(zhì)可作為抗性育種的親本，進(jìn)而加速桃褐腐病抗性育種進(jìn)程。

通過調(diào)查105份桃褐腐病樣本的抗病感病情況，發(fā)現(xiàn)對褐腐病抗性表現(xiàn)較強(qiáng)的有11份種質(zhì)，占測定種質(zhì)資源的10.5%。桃褐腐病鑒定技術(shù)為桃褐腐病抗性育種奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] FELICIANO A， FELICIANO A J， OGAWA J M. Monilinia fructicola resistance in the peach cv. Bolinha[J].Phytopathology， 1987， 77： 776-780

[2] SANTOS J， RASEIRA M C B， ZANANDREA I. Resistance to brown rot in peach plants[J]. Bragantia， 2012， 71（2）： 219-225.

[3] 沈志軍，田雨，蔡志翔，等.基于國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃的桃褐腐病抗性評價[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（15）：3018-3063.

[4] 紀(jì)兆林， 張建軍， 徐敬友， 等. 抗腐霉利的灰葡萄孢菌株特性及其競爭能力[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2007，（2）： 65-68.

[5] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1979.

[6] LANE C R. A synoptic key for differentiation of Monilinia fructicola， M. fructigena and M. laxa， based on examination of cultural characters[J]. EPPO Bulletin， 2002， 32（3）： 489-493.

[7] MARTINEZ-GARCIA P J， PARFITT D E， BOSTOCK R M， et al. Application of genomic and quantitative genetic tools to identify candidate resistance genes for brown rot resistance in peach[J]. PLoS One， 2013， 8 （11）： e78634.

[8] OBI V I， BARRIUSO J J， MORENO M A， et al. Optimizing protocols to evaluate brown rot （Monilinia laxa） susceptibility in peach and nectarine fruits[J]. Australasian Plant Pathology， 2017， 46（2）： 183-189.

[9] 許志剛．普通植物病理學(xué)[M].４版.北京：高等教育出版社，2009．