蟾酥誘發(fā)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

卞泗善,蘇慶紅,秦 燕,滕加文,趙新芝

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014;2. 山東第一醫(yī)科大學(xué),山東 濟(jì)南 250000;3. 濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,山東 濟(jì)南 271100;4. 山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟(jì)南 250014)

骨肉瘤是臨床常見的骨惡性腫瘤,惡性增殖的肉瘤細(xì)胞可產(chǎn)生腫瘤性骨樣組織或不成熟骨,甚至腫瘤可穿過骨骺侵犯關(guān)節(jié),預(yù)后多較差。目前關(guān)于骨肉瘤發(fā)生及進(jìn)展的具體機(jī)制尚不十分清楚,西醫(yī)主要采用手術(shù)、化療、放療相結(jié)合的綜合療法治療,其中約有30%的患者對(duì)化療藥物不敏感[1],截肢治療后的3～5年存活率僅為5%～20%[2],而且放化療過程中存在著嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、心肌損害等不良反應(yīng)。目前中藥治療骨肉瘤的臨床效果得到廣泛認(rèn)可,主要體現(xiàn)在控制病情、提高免疫、增效減毒、控制術(shù)后復(fù)發(fā)等方面。蟾酥具有解毒去積的功效,其有效成分具有廣譜抗癌活性[3-4]。既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),蟾酥可以調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡、遷移及侵襲[5-6],但作用機(jī)制有待明確?；诖?本研究探討了不同濃度的蟾酥對(duì)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,鼠齡6～8周,體重(20±3)g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK[魯]20190003。小鼠飼養(yǎng)在山東中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,每籠4～6只,使用SPF級(jí)墊料(山東中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),每2 d更換1次墊料;保持環(huán)境溫度(21±1)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,明暗時(shí)間為12/12,自由獲取飲用水(自來水沸騰后常溫冷卻水)和標(biāo)準(zhǔn)飼料(11.5%的脂肪、20.8%的蛋白質(zhì)和67.7%的碳水化合物,魯抗,濟(jì)寧) ,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物處置符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、藥物及主要試劑和儀器 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司);蟾酥水溶液(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供,貨號(hào):20170601;1 g蟾酥里含蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量是6.8%,即為0.068 g);特級(jí)胎牛血清(以色列BI公司); CCK-8溶液(南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司,批號(hào):A311-02-AA);結(jié)晶紫染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):G1014);膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司,批號(hào):A211-02),胰酶細(xì)胞消化液(春仕生物科技有限公司,批號(hào):BL512A);整合素α4(Integrin α4,武漢三鷹生物有限公司,批號(hào):19676-1-AP,1∶200);抗狂犬病IgG Fab2 Alexa Fluor?488分子探針(美國(guó)CST公司,批號(hào):4412S,1∶100);堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):P0321S);鈣鹽染色液(改良茜素紅S法)(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):G3280);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司);顯微鏡(日本尼康公司);Transwell 小室(美國(guó)康寧公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);研究級(jí)正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3含藥血清制備方法 將30只C57 BL/ 6J小鼠隨機(jī)分為3組,每組10只。蟾酥低劑量組給予100 μg/mL濃度蟾酥水溶液灌胃,蟾酥高劑量組給予200 μg/mL濃度蟾酥水溶液灌胃,空白組給予生理鹽水灌胃,灌胃量均為6 mL/kg,2次/d,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃2 h后,腹主動(dòng)脈采血,無菌分離血清,滅活后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4MG-63細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將細(xì)胞小心從-80 ℃冰箱取出,放入37 ℃水浴鍋中,使細(xì)胞在1～2 min內(nèi)完全解凍后轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,4～5 h后換液,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,封好口后,室溫1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養(yǎng)基重懸,轉(zhuǎn)移至2-3皿100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將MG-63細(xì)胞按3×103個(gè)/孔接種于96孔板上,每孔加入200 μL培養(yǎng)液,接種后8 h細(xì)胞完全貼壁,將培養(yǎng)液換成不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。然后2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應(yīng)濃度的蟾酥含藥血清,對(duì)照組加入等體積PBS。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,于檢測(cè)板的所有復(fù)孔預(yù)留100 μL的培養(yǎng)液,每孔直接加入10μL的CCK-8,放回培養(yǎng)箱中原條件孵育4 h。之后棄去上清,每孔加入100 μL 10%的 SDS,37 ℃過夜培養(yǎng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm處吸光度,記錄各組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2細(xì)胞凋亡情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、離心和重懸后,以每孔(15～20)×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板。實(shí)驗(yàn)分3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應(yīng)濃度的蟾酥含藥血清,對(duì)照組加入等體積PBS,待處理結(jié)束后收集細(xì)胞,將細(xì)胞懸液收集至EP管中,1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養(yǎng)基重懸,轉(zhuǎn)移至2-3皿100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。離心5 min,棄上清。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次,1 000 r/min離心5 min。加入4～6 mL培養(yǎng)基重懸,轉(zhuǎn)移至2-3皿100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,離心5 min。加入300 μL 1×Bind buffer重懸(Bind buffer 現(xiàn)用現(xiàn)配),加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI,避光室溫孵育15 min。每管加入500～600 μL Bind buffer重懸,在1 h內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.5.3細(xì)胞分化情況 以PNPP法檢測(cè)細(xì)胞中ALP活性。細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種于24孔板,24 h細(xì)胞周期同步后更換新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應(yīng)濃度的蟾酥含藥血清,對(duì)照組加入等體積PBS,每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每3 d換液1次,并補(bǔ)加刺激,繼續(xù)培養(yǎng)9 d后,吸棄培養(yǎng)液,加入1% TritonX-100溶液200 μL,置4 ℃冰箱中放置1 h以裂解細(xì)胞,離心取上清,按ALP檢測(cè)試劑盒及蛋白定量檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定ALP活性和蛋白含量,以IU/g蛋白質(zhì)表示ALP活性,結(jié)果與對(duì)照組比較。

1.5.4細(xì)胞成骨情況 將MG-63細(xì)胞消化下來,鋪板于24孔板中,每孔加入500 μL 10%FBS培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至融合度70%～80%時(shí),按照“1.5.1”分組處理細(xì)胞48 h,棄掉原有培養(yǎng)基,加入4%成骨分化誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)成骨分化21d,棄掉成骨分化培養(yǎng)基,分別加1 mL PBS潤(rùn)洗小室2～3次,加500 μL 4%多聚甲醛室溫避光固定細(xì)胞30 min,回收多余的多聚甲醛,分別加1 mL PBS潤(rùn)洗小室2～3次,晾干小室。加入300 μL茜素紅,室溫孵育30 min,棄掉茜素紅,分別加1 mL PBS潤(rùn)洗小室2～3次,晾干小室于顯微鏡下拍照保存。

1.5.5細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移情況 取預(yù)冷24 h的Transwell培養(yǎng)板,將30 μL MatrigelTM人工基質(zhì)膠(無血清培養(yǎng)基按1∶3配置)鋪在Transwell裝置的上室并靜置3 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞2×105個(gè)/mL,置于上室的膠層上。在24孔板下室加入10%胎牛血清+RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL。提前用無血清培養(yǎng)基、2.5%蟾酥含藥血清、5%蟾酥含藥血清提前處理MG-63細(xì)胞24 h。于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h,然后用PBS液沖洗膠層,室溫下用95%甲醇固定15 min,用結(jié)晶紫染色15 min。 高倍鏡(200×)下隨機(jī)對(duì)5個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)計(jì)數(shù),取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6細(xì)胞中Integrin α 4表達(dá)情況 采用流式細(xì)胞儀技術(shù)定量檢測(cè):重懸貼壁培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞,400目篩網(wǎng)去除細(xì)胞團(tuán)塊后均分成3組,2.5%蟾酥含藥血清組和5%蟾酥含藥血清組分別加入相應(yīng)濃度的蟾酥含藥血清,對(duì)照組加入等體積PBS,每組做3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。以P4G9和陰性對(duì)照CBL600(1∶300)為一抗,羊抗鼠熒光素交聯(lián)IgG(1∶1000)為二抗。冰上常規(guī)細(xì)胞免疫染色標(biāo)記30 min,1 g/mL碘化丙啶對(duì)抗染色15 min,上機(jī)檢測(cè)Integrin α4表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖情況 不同濃度蟾酥含藥血清組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率均明顯低于同期對(duì)照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率均明顯低于同期2.5%蟾酥含藥血清組(P均<0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖情況比較

2.2各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡情況 對(duì)照組、2.5%蟾酥含藥血清組、5%蟾酥含藥血清組細(xì)胞凋亡率分別為(4.95±0.21)%、(8.23±0.28)%、(14.65±0.25)%,不同濃度蟾酥含藥血清組細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組細(xì)胞凋亡率明顯高于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。見圖1。

圖1 對(duì)照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡情況

2.3各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞分化和成骨能力比較 對(duì)照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組ALP活性分別為(110.32±2.21)IU/g、(132.18±3.51)IU/g、(167.65±5.11)IU/g,不同濃度蟾酥含藥血清組ALP活性均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組明顯高于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。茜素紅染色顯示,與對(duì)照組相比,不同濃度含藥血清組有橘紅色結(jié)節(jié)、邊界清楚細(xì)胞增多,見圖2。

圖2 對(duì)照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞茜素紅染色情況(×100)

2.4各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移情況比較 對(duì)照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組侵襲性細(xì)胞數(shù)量分別為(230.21±14.25)個(gè)/mL、(192.54±16.51)個(gè)/mL、(137.78±15.26)個(gè)/mL,轉(zhuǎn)移性細(xì)胞數(shù)量分別為(320.56±15.05)個(gè)/mL、(272.62±14.78)個(gè)/mL、(201.63±15.32)個(gè)/mL,不同濃度蟾酥含藥血清組侵襲性細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞數(shù)量均明顯少于對(duì)照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組均明顯少于2.5%蟾酥含藥血清組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 對(duì)照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移情況(×200)

2.5各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中Integrin α4表達(dá)情況 對(duì)照組、2.5%蟾酥含藥血清組、 5%蟾酥含藥血清組細(xì)胞中Integrin α4表達(dá)占比分別為(53.23±4.23)%、(43.19±3.76)%、(26.45±3.07)%,不同濃度蟾酥含藥血清組Integrin α4表達(dá)占比均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05),且5%蟾酥含藥血清組明顯低于2.5%蟾酥含藥血清組(P<0.05)。見圖4。

圖4 對(duì)照組和不同濃度蟾酥含藥血清組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中Integrin α4表達(dá)情況

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,新型輔助化療療法的出現(xiàn),骨肉瘤患者的5年總生存率有明顯提高,但耐藥性和不良反應(yīng)明顯使骨肉瘤的治療仍處于困境,例如甲氨蝶呤、順鉑等藥物帶來較好臨床效果的同時(shí),其耐藥性及所帶來的消化系統(tǒng)功能紊亂、免疫失衡,大大降低了患者的生活質(zhì)量。中藥可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮協(xié)同作用,可用于各個(gè)時(shí)期骨肉瘤的治療,而且這些優(yōu)勢(shì)隨著研究的不斷深入逐漸顯露出來。腫瘤藥物的耐藥性是腫瘤患者化療失敗的主要原因,探索腫瘤藥物的多藥耐藥的機(jī)制,尋找低毒有效、逆轉(zhuǎn)耐藥的中藥已然成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

骨肉瘤具有復(fù)雜的核型畸變,如染色體重排、易位、擴(kuò)增和缺失等[7]。骨肉瘤細(xì)胞是一類具有多種成骨細(xì)胞表型特征的特殊腫瘤細(xì)胞,是成骨細(xì)胞分化為成熟骨細(xì)胞階段的過渡中間體[8],具有無限增殖、可發(fā)生上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤細(xì)胞增殖受到各種分子信號(hào)調(diào)控,其中癌基因c-Myc是一種可使細(xì)胞無限增殖的關(guān)鍵基因[10],還可以誘導(dǎo)人成骨肉瘤細(xì)胞的分化[11]。整合素是細(xì)胞膜上的跨膜黏附蛋白,與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中Integrin α4可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移[12]。

蟾酥具有明顯抗腫瘤作用,其單體化合物如脂蟾毒配基、華蟾毒素、蟾毒靈、遠(yuǎn)華嶋毒靈、蟾毒它靈、沙蟾毒精、華蟾毒它靈等對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用[13-15]。牛天力[16]研究報(bào)道,華蟾酥毒基能在體外明顯抑制多西他賽耐藥的人激素非依賴性前列腺癌PC3細(xì)胞生長(zhǎng),并有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果。趙迪等[6]實(shí)驗(yàn)研究顯示,華蟾素毒基與順鉑聯(lián)用可更有效抑制人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度的蟾酥均可以促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡,改善細(xì)胞分化和成骨功能,抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移,下調(diào)Integrin α4表達(dá),這種作用尤以5%濃度最為明顯,提示蟾酥可以通過下調(diào)MG-63細(xì)胞中的Integrin α4表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。但蟾酥有效成分頗為復(fù)雜,其所帶有的毒性也大大限制了其臨床應(yīng)用,故尋找中藥提純方法,使抗腫瘤活性成分與毒性成分高度分離是今后的課題研究方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。