血栓心脈寧片通過(guò)調(diào)控TGF-β1和Runx2表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化的研究

張 晶,鄧毅凡,張釗源,劉 娟,朱米雪,余吉玲,何勝虎,周 瑋

(1. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院,江蘇 揚(yáng)州 225001;2. 大連醫(yī)科大學(xué)揚(yáng)州臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225001;3. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 揚(yáng)州 225001)

冠狀動(dòng)脈疾病是全球范圍內(nèi)致死和致殘的主要原因之一,冠狀動(dòng)脈鈣化是一類嚴(yán)重的冠狀動(dòng)脈疾病,其改變了冠狀動(dòng)脈機(jī)械性質(zhì),增加斑塊和血管破裂的風(fēng)險(xiǎn),造成血栓形成、外周血管堵塞及心肌缺血甚至梗死等臨床不良事件的發(fā)生[1]。冠狀動(dòng)脈鈣化形成過(guò)程包括血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖及其轉(zhuǎn)化為成骨特性的細(xì)胞表型[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族主要成員之一,可以通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞及損傷血管的血管平滑肌細(xì)胞增生,促進(jìn)血管重構(gòu),導(dǎo)致新生血管內(nèi)膜增生等一系列病理過(guò)程。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)屬于Runt家族成員,對(duì)成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要,并參與了血管平滑肌細(xì)胞的鈣化過(guò)程[3]。血栓心脈寧片是基于《黃帝內(nèi)經(jīng)》的氣血理論辨證組方而成,可擴(kuò)張血管、溶解血栓、改善血液循環(huán)[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)血栓心脈寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶標(biāo)基因有2 201個(gè),有78條通路顯著富集,其中對(duì)TGF-β1通路作用明顯[5]。β-磷酸甘油(β-GP)是一種堿性磷酸酶的作用底物,分解后能產(chǎn)生超生理劑量無(wú)機(jī)磷酸鹽導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣沉積,繼而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化,是目前鈣化模型構(gòu)建的最常用試劑[6]。本研究以β-GP誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞鈣化模型,探討了血栓心脈寧片是否可通過(guò)調(diào)控TGF-β1和Runx2表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化,以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞及藥物 大鼠血管平滑肌細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈(zèng);血栓心脈寧片(吉林華康藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030145)。

1.2主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司,CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本銅仁有限公司,堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒、鈣含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物公司,TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司,GAPDH購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore 公司,ECL顯影試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,Runx2購(gòu)自美國(guó)CST 公司,β-GP、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3主要儀器 Tecan M2000多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Tecan公司,ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 取大鼠血管平滑肌細(xì)胞,使用完全培養(yǎng)基于37 ℃、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用0.25%胰酶消化傳代,取10代以內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組:陰性組僅加入DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);鈣化組加入終濃度為10 μmol/L的β-GP作用24 h誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化;血栓心脈寧低、中、高劑量組先分別加入125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L的血栓心脈寧片培養(yǎng)24 h后再給予終濃度為10 μmol/L的β-GP作用24 h。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1細(xì)胞活力 取上述各組細(xì)胞,1×105個(gè)/孔接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑,避光孵育2 h,酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)時(shí)待測(cè)樣品OD值,計(jì)算每組3個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.5.2細(xì)胞中鈣含量 取上述各組細(xì)胞,2×106個(gè)/孔接種到6孔板中,用PBS清洗細(xì)胞3次,加入1 mL 0.6 mol/L HCl,置于4 ℃進(jìn)行細(xì)胞脫鈣,24 h后收集細(xì)胞上清液作為待測(cè)樣品。按照說(shuō)明書(shū)配制鈣標(biāo)準(zhǔn)液和鈣測(cè)定工作液,向250 μL鈣測(cè)定工作液中依次加入10 μL待測(cè)樣品、10 μL鈣標(biāo)準(zhǔn)液和10 μL去離子水,充分混勻后靜置10 min,轉(zhuǎn)移至96孔板中,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定610 nm波長(zhǎng)時(shí)待測(cè)樣品OD值,計(jì)算細(xì)胞中鈣含量。

1.5.3細(xì)胞中ALP活性 取上述各組細(xì)胞,2×106個(gè)/孔接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板3次。向待測(cè)細(xì)胞中加入200 μL細(xì)胞裂解液(0.1 mol/L NaOH+0.1% SDS),4 ℃孵育30 min,使細(xì)胞充分裂解。收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物,12 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞上清液。向96孔板的孔中分別加入30 μL滅菌超純水(陰性組)、30 μL酚標(biāo)準(zhǔn)液(標(biāo)準(zhǔn)組)和30 μL待測(cè)細(xì)胞上清液(待測(cè)組)。向各組孔中依次加入50 μL緩沖液和50 μL基質(zhì)液,37 ℃孵育20 min后加入150 μL顯色劑,充分混勻。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm時(shí)待測(cè)樣品OD值;并測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量。ALP計(jì)算公式:(待測(cè)組OD值-陰性組OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)組OD值-空白組OD值)×0.02 mg/mL(酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度)/待測(cè)樣品(細(xì)胞)蛋白濃度。

1.5.4細(xì)胞中TGF-β1含量 嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作,分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔。每孔分別加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品,混勻后37 ℃孵育2 h。充分棄去液體,不洗滌,每孔加入100 μL生物素標(biāo)記抗體工作液,37 ℃孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體,甩干,每孔加入200 μL洗滌工作液,浸泡2 min,甩干,重復(fù)3次。每孔加100 μL辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記親和素工作液,37 ℃下孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體,甩干,每孔加入200 μL洗滌工作液,浸泡2 min,甩干,重復(fù)5次。按照順序每孔加顯色液90 μL,37 ℃下避光孵育30 min后,加入終止液50 μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm時(shí)待測(cè)樣品OD值。

1.5.5細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取上述各組細(xì)胞,嚴(yán)格按照RIPA蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,每孔加入蛋白裂解液,冰上充分裂解10 min后,4 ℃下12 000×g離心10 min,吸取上清,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各目的蛋白濃度。將蛋白樣本與5×蛋白上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸10 min使蛋白充分變性,置于-20 ℃冰箱中保存。每孔總蛋白上樣量為30 μg,使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h。分別加入Runx2抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜,次日用含0.1%吐溫-20的PBS(PBST)溶液洗膜3次,對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h,PBST溶液洗膜3次后經(jīng)ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測(cè)各條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,各目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞增殖活性O(shè)D值比較 鈣化組OD值為0.417±0.034,明顯低于陰性組的0.882±0.039(P<0.05);血栓心脈寧低、中、高劑量組OD值分別為0.529±0.031,0.648±0.039,0.752±0.044,均明顯高于鈣化組(P均<0.05),且OD值呈濃度依賴性升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2各組細(xì)胞中鈣含量、ALP活性及TGF-β1含量比較 鈣化組細(xì)胞中鈣含量、ALP活性及TGF-β1含量均明顯高于陰性組(P均<0.05);血栓心脈寧各組細(xì)胞中鈣含量、ALP活性及TGF-β1含量均明顯低于鈣化組(P均<0.05),且鈣含量、ALP活性及TGF-β1含量呈濃度依賴性降低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血管平滑肌細(xì)胞中鈣含量、ALP活性及TGF-β1含量比較

2.3各組細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)情況比較 鈣化組細(xì)胞中Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性組(P<0.05);血栓心脈寧各組細(xì)胞中Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于鈣化組(P均<0.05),且呈濃度依賴性降低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。 見(jiàn)圖1。

圖1 各組血管平滑肌細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

冠狀動(dòng)脈鈣化主要是由平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥介質(zhì)共同參與的一種病變,大多數(shù)鈣化出現(xiàn)在粥樣硬化的壞死核心,凋亡的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡,而這些囊泡為鈣化形成提供了支撐作用。當(dāng)局部鈣和磷酸鹽濃度異常升高時(shí),自噬體可通過(guò)類似于骨/軟骨形成轉(zhuǎn)化的活性過(guò)程形成鈣化組織,因此冠狀動(dòng)脈鈣化多見(jiàn)于鈣磷代謝異常的腎臟疾病患者[7]。Jia等[8]大樣本量統(tǒng)計(jì)顯示,中重度冠脈鈣化患者的5年內(nèi)主要心血管不良事件發(fā)生率較輕度/無(wú)鈣化患者高(20.7%比17.9%),其中血運(yùn)重建發(fā)生率為15.2%。因此,防治冠狀動(dòng)脈鈣化是目前預(yù)防心血管不良事件發(fā)生的研究熱點(diǎn)。

除了上述機(jī)制,冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞成骨樣轉(zhuǎn)化同樣是鈣化病變進(jìn)展的重要機(jī)制。在此過(guò)程中,平滑肌細(xì)胞能夠從收縮表型轉(zhuǎn)化為合成型,最終丟失平滑肌細(xì)胞標(biāo)記基因形成擁有成骨樣標(biāo)記基因的細(xì)胞[9]。Runx2作為一種重要的成骨轉(zhuǎn)錄控制因子,是人體骨骼系統(tǒng)發(fā)育、成骨的重要調(diào)節(jié)因素,但是在一些異常因素影響下,其功能可超出成骨轉(zhuǎn)錄的作用[10]。如Balderman等[11]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)100 ng/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)處理的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在24 h內(nèi) Runx2蛋白表達(dá)增加了1.7倍,在此過(guò)程中BMP-2下調(diào)miR-30b和miR-30c以增加平滑肌細(xì)胞中的Runx2表達(dá),并促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈的鈣化;Cobb等[12]研究報(bào)道,一些遺傳性的損傷可以誘導(dǎo)Runx2表達(dá)積累及其成骨靶基因的激活,導(dǎo)致鈣化增強(qiáng),抑制DNA損傷信號(hào)則可減弱這種反應(yīng)。由此可見(jiàn),Runx2在平滑肌細(xì)胞成骨樣轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用,但是在血管損傷部位沒(méi)有鈣化的情況下,Runx2會(huì)暫時(shí)上調(diào),而Runx2在體內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞中的靶向過(guò)表達(dá)不足以導(dǎo)致鈣化,表明需要額外的因素或修飾來(lái)激活其成骨能力,而大量的研究證實(shí)TGF-β1是其有效的上游調(diào)控因素。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子,可以調(diào)節(jié)廣泛的生物過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。在TGF-β1/Smad、ERK/MAPKs等通路影響下,平滑肌細(xì)胞表型能夠發(fā)生改變并向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。如Arumugam等[13]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1刺激Runx2在絲氨酸氨基酸處的磷酸化,加速了大鼠細(xì)胞成骨樣的變化,當(dāng)用ERK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞時(shí),TGF-β1介導(dǎo)的MMP-13mRNA表達(dá)減少;熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定確定TGF-β1僅在存在野生Runx2構(gòu)建體的情況下刺激這些細(xì)胞中的MMP-13啟動(dòng)子活性。Convento等[14]報(bào)道,TGF-β1可誘導(dǎo)收縮型平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨樣平滑肌細(xì)胞,加速平滑肌細(xì)胞鈣化,這個(gè)過(guò)程中Runx2同樣出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)的情況。本研究發(fā)現(xiàn)鈣化的大鼠平滑肌細(xì)胞中TGF-β1和Runx2均高表達(dá),與上述研究結(jié)果相似。

目前缺乏改善甚至逆轉(zhuǎn)冠狀動(dòng)脈鈣化病變的特效藥物,主要采用冠狀動(dòng)脈旋磨術(shù)、切割球囊等介入術(shù)去除鈣化組織,但是手術(shù)存在損傷冠狀動(dòng)脈組織等風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)藥是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶,中醫(yī)認(rèn)為冠狀動(dòng)脈鈣化屬于“胸痹”范疇,單一證候主要包括血瘀證、寒凝證、氣滯證、痰濁證、氣虛證,復(fù)合證候常見(jiàn)的為心血瘀阻證、痰濁內(nèi)阻證和心氣虛弱證,其中重度鈣化多為血瘀證和寒凝證,復(fù)合證候以心血瘀阻證較為常見(jiàn)[15-16]。治療以扶正祛邪為主。血栓心脈寧片是基于血脈雙治的中醫(yī)理論,根據(jù)現(xiàn)代技術(shù)將川芎、丹參、毛冬青、水蛭、槐花、麝香、冰片等10味中藥精華濃縮研制而成。其中丹參、川芎為君藥,二者均歸心經(jīng),具有益氣活血、通經(jīng)止痛之效,能擴(kuò)張血管,改善微循環(huán),調(diào)理血脈兼治血管;毛冬青、麝香、水蛭等為臣藥,冰片、牛黃、蟾酥等為佐使,益氣活血配以開(kāi)竅醒神、活血通經(jīng)、軟堅(jiān)散結(jié)。全方血脈雙治、雙心共調(diào),體現(xiàn)出中醫(yī)藥全方位、多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)。張曉天等[17]的研究發(fā)現(xiàn),血栓心脈寧片對(duì)于氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞有一定的保護(hù)作用,并具有藥物濃度相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,血栓心脈寧片可濃度依賴性抑制鈣化血管平滑肌細(xì)胞中TGF-β1和Runx2的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞活力,降低細(xì)胞內(nèi)鈣含量和ALP活性。

綜上所述,血栓心脈寧片對(duì)鈣化大鼠血管平滑肌細(xì)胞具有一定的抑制作用,其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1和Runx2的表達(dá)有關(guān),為冠狀動(dòng)脈鈣化的防治提供了新思路,值得進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。