基于藥效學(xué)優(yōu)化參花方提取工藝及其治療銀屑病的譜效關(guān)系研究

喻 琴,侯 巖,沈翠娥,李星子,陳中建,朱全剛

(上海市皮膚病醫(yī)院/上海中藥外用制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心,上海 200443)

參花方原名中浴1號(hào),是上海市皮膚病醫(yī)院中醫(yī)科治療銀屑病等炎癥性皮膚病的經(jīng)驗(yàn)有效方,臨床應(yīng)用已逾10年[1-2]。該方由苦參、野菊花、生側(cè)柏葉和花椒組成,具有清熱解毒、除濕止癢的功效,針對(duì)銀屑病“血分熱毒熾盛,壅于肌表”的主要病因病機(jī),有望成為治療銀屑病的潛在新藥。目前,臨床上使用的參花方制劑是水提制備的洗劑,本院正在積極將其開發(fā)制備為使用攜帶方便、穩(wěn)定性更好的外洗顆粒劑。本課題組前期已經(jīng)對(duì)參花方顆粒劑的安全性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)該制劑在臨床使用濃度下安全、無毒,極具開發(fā)前景[3]。水提、醇提、水提醇沉為中藥復(fù)方經(jīng)典的提取方法,是影響復(fù)方藥效的重要因素[4],但目前尚無研究對(duì)參花方提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;此外,該方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還不完善,其治療銀屑病的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)也不清晰,這也阻礙了參花方的新藥開發(fā)。近年來新藥研究中鼓勵(lì)以“療效指標(biāo)”而非傳統(tǒng)指標(biāo)“成分的含量”來評(píng)價(jià)提取工藝優(yōu)劣[5]。藥效學(xué)可以在動(dòng)物整體水平上研究中藥的作用效果及機(jī)制,較有效成分的比較更直觀,相關(guān)性更顯著[6]。譜效關(guān)系是在中藥指紋圖譜基礎(chǔ)上,與藥效進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合,旨在闡明中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8],此類研究主要包括指紋圖譜的獲取、多指標(biāo)藥效檢測(cè)和譜效關(guān)系建立。建立中藥譜效關(guān)系,將其作為一種評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的方法,可以將中藥化學(xué)成分與藥效作用結(jié)合起來,更全面地反映中藥質(zhì)量,彌補(bǔ)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的不足[9-11]?；诖?本研究依據(jù)藥效學(xué)優(yōu)化提取工藝的理念,比較參花方水提、醇提、水提醇沉提取物的藥效,篩選最優(yōu)提取工藝;并建立不同提取物的指紋圖譜,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析,研究該方指紋圖譜中共有峰(變量組)與抗銀屑病作用(藥效變量組)的譜效關(guān)系,闡明其抗銀屑病作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為參花方質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完善及新藥開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c小鼠42只,雄性,6～8周齡,體重(20±2)g,購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):20180004030036。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海市皮膚病醫(yī)院動(dòng)物房(溫度22～26 ℃,相對(duì)濕度40%～65%)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海市皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批件號(hào):2021-108(動(dòng))預(yù)。

1.2藥物和試劑 苦參(Sophorae Flavescentis Radix,批號(hào):19050702)、野菊花(Chrysanthemi Indici Flos,批號(hào):19020202)、(生)側(cè)柏葉(Cacumen Platycladi,批號(hào):19041914)、花椒(Zanthoxyli Pericarpium,批號(hào):19039801),藥物均購自吳江上海蔡同德堂中藥飲片有限公司,經(jīng)該公司質(zhì)量保證部檢驗(yàn),質(zhì)量合格。對(duì)照藥:他克莫司軟膏(普特彼,規(guī)格:0.1%,批號(hào):056350)。苦參堿對(duì)照品(批號(hào):110805-201709)、槐定堿對(duì)照品(批號(hào):110784-201706)、蒙花苷對(duì)照品(批號(hào):111528-201911)購自中國食品藥品檢定研究院;綠原酸對(duì)照品(批號(hào):17113021)、木犀草苷對(duì)照品(批號(hào):18083022)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司;卡波姆941(批號(hào):B30M9F57255)購自上海源葉生物科技有限公司;咪喹莫特乳膏(規(guī)格:3 g/150 mg,批號(hào):40210802)購自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司;三乙醇胺(批號(hào):20191224 )、磷酸(批號(hào):20200612)購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;高效液相用甲醇、乙腈為色譜純,氯仿、乙醇等為分析純,水為屈臣氏蒸餾水。

1.3參花方提取物的制備 ①水提物:按照處方配比稱取復(fù)方各味藥材,加6倍量水加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后靜置過夜,取上清液,繼續(xù)濃縮適量即為水提物。②醇提物:按照處方配比稱取復(fù)方各味藥材,加6倍量70%乙醇加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后靜置過夜,取上清液,繼續(xù)濃縮適量(無醇味)即為醇提物。③水提醇沉物:按照處方配比稱取復(fù)方各味藥材,加6倍量水加熱回流提取2次,第1次2 h,第2次1 h,濾過,合并濾液,加熱濃縮后添加乙醇至醇含量為70%,靜置過夜,取上清繼續(xù)濃縮適量(無醇味)即為水提醇沉物。

1.4干浸膏的制備 將以上3種提取工藝制備的提取物干燥,即得干浸膏,依據(jù)投料及產(chǎn)率計(jì)算生藥比。

1.5凝膠劑的制備 將提取物制備成1%的卡波姆凝膠劑,外涂給藥,以便進(jìn)行藥效學(xué)研究。制備方法:向上述3種提取物中加適量三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至5～6,加適量卡波姆、純化水,制備成終制劑生藥比為25%的凝膠劑;按上述凝膠劑處方(不含飲片提取物),將三乙醇胺、水、卡波姆制備的空白凝膠劑作為陰性對(duì)照。

1.6HPLC指紋圖譜建立方法

1.6.1對(duì)照品溶液的制備 取苦參堿、綠原酸、木犀草苷、蒙花苷對(duì)照品適量,精密稱定,于同一10 mL的量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,即得混合對(duì)照品溶液:苦參堿118 μg/mL、綠原酸105.3 μg/mL、木樨草苷107.3 μg/mL、蒙花苷97 μg/mL。

1.6.2供試品溶液的制備 取不同提取物制備的各3批干浸膏1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱質(zhì)量,超聲處理45 min,冷卻至室溫,稱質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.6.3色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),高效液相色譜儀為Waters e2695(美國Waters公司);以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%磷酸水為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫(0～20 min,5%A→15%A;20～50 min,15%A→30%A;50～65 min,30%A→50%A;65～70 min,50%A→60%A;70～80 min,60% A→85% A;80～90 min,85%A→95%A);流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長為210 nm,進(jìn)樣量為20 μL。

1.6.4精密度考察 取水提干浸膏粉末,精密稱定,按照“1.6.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制樣,按“1.6.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以苦參堿(即峰1,該峰分離度好、峰面積大且穩(wěn)定)為參照峰(S),計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4%,相對(duì)峰面積的RSD均小于5.3%,表明儀器精密度良好。

1.6.5穩(wěn)定性考察 取水提干浸膏粉末,精密稱定,按照“1.6.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制樣,室溫下放置0,4,8,12,24 h后,按“1.6.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以1號(hào)峰苦參堿為參照,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.4%,相對(duì)峰面積的RSD均小于6.0%,表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.6.6重復(fù)性考察 取水提干浸膏粉末6份,精密稱定,按照“1.6.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制樣,按“1.6.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以1號(hào)峰苦參堿為參照,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.3%,相對(duì)峰面積的RSD均小于5.8%,表明該方法重復(fù)性良好。

1.7藥效試驗(yàn)方法 將BALB/C小鼠隨機(jī)分為7組,每組6只?？瞻捉M不給予任何處理;其他組小鼠采用咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病:造模前采用脫毛膏脫去背部2.5 cm×2.5 cm范圍的背毛,然后每天上午涂抹咪喹莫特乳膏65 mg/只,涂抹面積2 cm×2 cm,連續(xù)7 d。造模期間同時(shí)每天下午給予治療(除模型組),空白凝膠組涂抹空白凝膠劑,他克莫司組涂抹他克莫司軟膏,參花方水提物組、參花方醇提物組、參花方水提醇沉物組分別涂抹相應(yīng)的凝膠劑,均50 mg/只。實(shí)驗(yàn)期間,每天測(cè)定各組小鼠體重,觀察小鼠皮損變化情況。第8天,參考文獻(xiàn)[12],依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠病變部位相應(yīng)紅斑、鱗屑及浸潤增厚程度進(jìn)行評(píng)分,三者總和即為PASI評(píng)分;然后處死小鼠,取皮損皮膚,多聚甲醛固定,石蠟切片,進(jìn)行HE染色病理學(xué)觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1指紋圖譜的生成及相似度評(píng)價(jià) 參花方按照水提、醇提、水提醇沉工藝各制備3批干浸膏,按照“1.6.2”項(xiàng)下操作,制備成供試品溶液,按“1.6.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。將得到的色譜圖導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版)軟件中,以其中1批水提法得到的干浸膏樣品(S1)的圖譜作為參照指紋圖譜(R),計(jì)算得到參花方不同工藝提取物的相似度≥0.922,相似度結(jié)果見表1,總體上樣品之前質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定;不同工藝提取物的HPLC圖整體峰形一致,共有18個(gè)色譜峰是共有的,確定它們?yōu)楣灿兄讣y峰,疊加圖譜見圖1。

圖1 參花方水提物(S1～S3)、醇提物(S4～S6)及水提醇沉物(S7～S9)HPLC指紋圖譜疊加圖譜

表1 參花方水提、醇提、水提醇沉提取物的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

2.2共有峰的指認(rèn) 取“1.6.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,按“1.6.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖(見圖2)。將對(duì)照品圖譜與參花方的疊加圖譜進(jìn)行比較,即將圖1和圖2進(jìn)行比對(duì),指認(rèn)峰1為苦參堿,峰5為綠原酸,峰12為木犀草苷,峰17為蒙花苷4個(gè)特征峰。

注:1為苦參堿;5為綠原酸;12為木犀草苷;17為蒙花苷

2.3參花方抗銀屑病的藥效

2.3.1對(duì)銀屑病小鼠臨床癥狀的影響 與空白組比較,實(shí)驗(yàn)過程中模型組小鼠體重顯著下降,第3天體重下降至約90%,之后幾天在低位波動(dòng);背部皮膚覆蓋厚重鱗屑,顯著增厚隆起,鱗屑下皮膚紅腫,PASI評(píng)分高達(dá)10.5分,表明銀屑病樣小鼠建模成功。空白凝膠組小鼠皮膚覆蓋厚重鱗屑,增厚明顯,皮損的鱗屑、紅斑、增厚評(píng)分及PASI評(píng)分與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),表明空白凝膠不干擾參花方以凝膠劑進(jìn)行藥效考察。參花方各組及他克莫司組小鼠體重下降趨勢(shì)有所緩解,但與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。參花方各組及他克莫司組小鼠皮損的鱗屑、紅斑、增厚評(píng)分及PASI評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05),其中參花方水提物組小鼠鱗屑、紅斑、增厚評(píng)分及PASI評(píng)分降低最明顯,背部鱗屑覆蓋不全,輕微鱗屑,皮損較輕;參花方醇提物組小鼠背部覆蓋中度鱗屑,皮損中度隆起;參花方水提醇沉物組小鼠背部覆蓋大部分鱗屑,皮損中度隆起。見圖3。

圖3 空白組和銀屑病各組小鼠皮損情況、皮損PASI評(píng)分及體重變化

2.3.2對(duì)銀屑病小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)的影響 空白組小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)完整,表皮無增厚,未見角化過度和角化不全,表皮顆粒層清晰,真皮周圍無炎性細(xì)胞浸潤;模型組和空白凝膠組小鼠表皮增厚明顯,存在角質(zhì)層角化不全及大量炎性細(xì)胞浸潤,表皮厚度均明顯高于空白組(P均<0.05),但2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);參花方各組及他克莫司組小鼠表皮增厚、角化不全及炎性浸潤均有不同程度的改善,表皮厚度均明顯低于模型組(P均<0.05),其中參花方水提物組皮膚組織病理改變改善最優(yōu)。見圖4。

圖4 空白組和銀屑病各組小鼠皮膚HE染色表現(xiàn)及表皮厚度比較

2.4基于灰色關(guān)聯(lián)度的譜效關(guān)系

2.4.2灰色關(guān)聯(lián)度分析 根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)下處理后的結(jié)果,分別計(jì)算各母序列與子序列之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值,即灰色關(guān)聯(lián)度(r)。根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)原理可知,隨著關(guān)聯(lián)度的增大,子序列和母序列之間的相關(guān)性也就越強(qiáng),當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.5時(shí),表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有關(guān)聯(lián)性;當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8時(shí),表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有較大關(guān)聯(lián)性。計(jì)算得到的關(guān)聯(lián)性結(jié)果見表2～4。參花方的18個(gè)共有峰與降低銀屑病藥效指標(biāo)PASI評(píng)分能力的關(guān)聯(lián)度為0.556 1～0.834 8,其中有16個(gè)峰與PASI評(píng)分有明顯相關(guān)性(關(guān)聯(lián)度>0.8);共有峰與恢復(fù)至正常表皮厚度能力的關(guān)聯(lián)度為0.461 2～0.911 0,其中有15個(gè)峰與表皮厚度有明顯關(guān)聯(lián)性;以PASI評(píng)分和表皮厚度按相同權(quán)重比計(jì)算而得的綜合藥效指標(biāo)與各共有峰關(guān)聯(lián)性結(jié)果顯示,有15個(gè)峰與藥效有明顯關(guān)聯(lián)性,相關(guān)度為0.824 3～0.862 0,按相關(guān)性由大到小排名依次為峰2,9,4,8,11,10,13,3,6,7,16,5(綠原酸),14,15,1(苦參堿)。綜合兩種指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果,參花方18個(gè)共有峰中有15個(gè)在抗銀屑病作用方面具有主要貢獻(xiàn),且總體關(guān)聯(lián)性均大于0.8;其余3個(gè)共有峰中峰12(木樨草苷)及峰17(蒙花苷)的關(guān)聯(lián)度大于0.6,峰18的關(guān)聯(lián)度大于0.5,對(duì)銀屑病的治療作用也有關(guān)聯(lián)性。表明參花方的作用與其組方的4味藥材密切相關(guān),是復(fù)方多組分綜合效應(yīng)的結(jié)果。

表2 銀屑病小鼠PASI評(píng)分與各特征峰峰面積關(guān)聯(lián)度

表3 銀屑病小鼠表皮厚度與各特征峰峰面積關(guān)聯(lián)度

表4 銀屑病小鼠藥效指標(biāo)與各特征峰峰面積關(guān)聯(lián)度

3 討 論

參花方是治療銀屑病的有效經(jīng)驗(yàn)方,臨床沿用水提工藝制備洗劑供患者藥浴,進(jìn)行新藥開發(fā)還需對(duì)其提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證、對(duì)其治療銀屑病的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行探索。本研究建立了參花方不同工藝提取物的指紋圖譜,前期對(duì)提取物干浸膏供試品制備過程中不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)用甲醇作為提取溶劑時(shí),圖譜出峰更為豐富,故選擇甲醇作為干浸膏的提取溶劑;對(duì)不同流動(dòng)相體系(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)甲醇-水作為流動(dòng)相體系時(shí)基線不平且漂移嚴(yán)重,乙腈-水基線較平穩(wěn),乙腈-0.1%磷酸溶液基線平穩(wěn)且出峰更多,故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系;在檢測(cè)波長選擇過程中,進(jìn)行紫外全波長(200～400 nm)掃描,掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長為210 nm時(shí)出峰最多,信號(hào)強(qiáng),大多數(shù)峰的峰面積值較大,故選擇210 nm作為參花方HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長。本研究對(duì)參花方指紋圖譜的色譜條件、樣品處理、方法學(xué)等均進(jìn)行了詳細(xì)的考察,為參花方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及新藥開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用藥效學(xué)為導(dǎo)向的提取工藝篩選策略,建立了文獻(xiàn)常用的咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型,比較水提、醇提、水提醇沉法的提取物對(duì)銀屑病樣皮損的治療作用,證實(shí)水提法為最優(yōu)提取工藝。此外,在參花方不同提取物HPLC指紋圖譜特征峰與其抗銀屑病作用數(shù)據(jù)量化的基礎(chǔ)上,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)參花方不同提取物指紋圖譜特征峰與抗銀屑病作用的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行相關(guān)性分析,表明各特征峰與降低PASI評(píng)分能力的關(guān)聯(lián)度均大于0.5,18個(gè)共有峰中除峰17、峰18,其余峰與PASI評(píng)分關(guān)聯(lián)度均大于0.8,對(duì)抗銀屑病作用均有較大貢獻(xiàn);在表皮厚度數(shù)據(jù)中,除18號(hào)峰,各特征峰的關(guān)聯(lián)度亦大于0.5,除峰12、峰17、峰18,其余15個(gè)特征峰與表皮厚度關(guān)聯(lián)度大于0.8,對(duì)銀屑病治療作用有較大貢獻(xiàn);以PASI評(píng)分及表皮厚度按相同權(quán)重比計(jì)算而得的綜合銀屑病藥效數(shù)據(jù)顯示,18個(gè)共有峰均與銀屑病藥效有關(guān)聯(lián)性,其中15個(gè)特征峰的關(guān)聯(lián)度大于0.8,有明顯關(guān)聯(lián)性,表明參花方抗銀屑病作用是多種成分共同作用的結(jié)果。

中藥復(fù)方成分眾多,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰一直是制約中藥國際化的重要瓶頸之一[14]。傳統(tǒng)研究方法是植化分離法,通過對(duì)中藥的提取、分離、解析,明晰其結(jié)構(gòu),并在此基礎(chǔ)上結(jié)合藥理模型對(duì)純化后的成分進(jìn)行相應(yīng)的藥效驗(yàn)證[15]。該方法雖然為闡明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)起到了積極的推動(dòng)作用,但是卻忽略了中藥各成分之間的協(xié)同作用,往往導(dǎo)致中藥化學(xué)成分越分越細(xì),而細(xì)小、微量成分無法發(fā)揮中藥整體協(xié)同的藥效[16-17]。針對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)等特點(diǎn),建立在中藥指紋圖譜研究基礎(chǔ)上,將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與中藥藥效聯(lián)系起來,進(jìn)而篩選出與藥效密切關(guān)聯(lián)的成分的理論,即譜效關(guān)系學(xué)。相比于其他研究方法,譜效關(guān)系學(xué)不僅高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保,更能體現(xiàn)中醫(yī)藥的整體觀理念。本研究對(duì)參花方治療銀屑病的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)群進(jìn)行了初步研究,獲得了指紋圖譜中各特征峰所代表的化學(xué)成分對(duì)體內(nèi)抗銀屑病作用貢獻(xiàn)的大小順序,為參花方新藥開發(fā)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。