針刺對乳腺癌化療后癌因性疲乏模型小鼠腸-腦軸相關(guān)因子的影響*

劉瑞東，王澤鵬，馮曉東，程旭鋒，房璐，阮曉迪，聶晨晨，蘇凱奇，呂轉(zhuǎn)

（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 1.乳腺外科，2.康復科，河南 鄭州 450000）

乳腺癌作為目前全球發(fā)病率第一的惡性腫瘤，其疾病本身及在治療過程中引發(fā)的疲乏、抑郁、失眠等不良反應(yīng)較為常見[1-2]，而60%乳腺癌幸存者存在不同程度的癌因性疲乏（cancer-related fatigue,CRF）癥狀[3]。CRF是一種由癌癥或癌癥治療引起的，擾亂機體正常功能的、持續(xù)存在的主觀感覺，并嚴重影響患者的機體功能康復和生活質(zhì)量。其中接受化療后的患者CRF發(fā)生率為70%～100%，而且患者疲乏程度較未化療者明顯加重[4]。研究表明，腫瘤化療可激活促炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)，炎癥因子可通過各種途徑破壞腸道屏障，引起腸道炎癥以及外周血炎癥反應(yīng)，進而導致中樞炎癥反應(yīng)及下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）軸功能失調(diào)，從而引起CRF[5]。大量研究證實，腫瘤化療可能會損傷腸道上皮組織，使更多腸道內(nèi)容物暴露于隱窩中，導致腸道屏障功能的破壞以及腸道的炎癥反應(yīng)，使腸道中白細胞介素-1β（Interlenkin-1β, IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α, TNF-α）等促炎因子表達水平升高。此外，有研究表明，腫瘤化療可破壞血腦屏障功能，導致IL-1β、IL-6、TNF-α等中樞性促炎因子增加，進而引起皮質(zhì)醇（Cortisol, CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）等HPA軸相關(guān)因子表達紊亂，加重疲乏癥狀[6]。

針刺是將針灸針插入人體特定穴位的一種非藥物治療方法，也是一種廣泛應(yīng)用于臨床實踐的輔助和替代治療方法。相關(guān)研究證實，針刺可通過調(diào)節(jié)腸道炎癥、中樞炎癥及生理屏障功能來調(diào)節(jié)腸道菌群的紊亂，恢復體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在改善腫瘤治療引起的不良反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，通過復制乳腺癌化療后疲乏模型小鼠針刺足三里、三陰交、百會、關(guān)元、氣海穴位可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)豐度，增加腸道有益菌、抑制致病菌、提高機體免疫力，改善乳腺癌化療引起的疲乏癥狀[8]。另有文獻報道針刺可改善乳腺癌CRF患者的疲乏癥狀，提高患者生活質(zhì)量[9]。據(jù)此提出針刺可能通過腸-腦軸改善乳腺癌CRF的假說。本研究通過復制乳腺癌化療后CRF小鼠模型，觀察針刺足三里、三陰交、百會、關(guān)元、氣海穴對CRF小鼠下丘腦和結(jié)腸的炎癥因子及HPA軸相關(guān)激素因子的影響，從而闡明針刺治療CRF的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級BALB/c小鼠[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2020-0004]60只，6～8周齡，體重15～18 g，由北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗室。小鼠在室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h / 12 h晝夜明暗交替，自由進食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（No：YFYDW2021012）。

1.2 細胞

4T1-Luciferase小鼠乳腺癌細胞來源于美國國立癌癥研究所，由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室提供。細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%二氧化碳條件下常規(guī)培養(yǎng)，2～3天傳代1次，實驗取對數(shù)生長期細胞。

1.3 藥物、試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺（CTX）0.2 g（德國ASTA Medica AG公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），特級胎牛血清（以色列BI公司），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），BCA蛋白測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），ECL超敏發(fā)光液（上海雅酶生物科技有限公司），IL-1β、IL-6、TNF-α、β-actin一抗、二抗（武漢三鷹科技有限公司），20×TBST緩沖液（北京索萊寶科技有限公司），ACTH、CORT ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特科技有限公司），一次性華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格0.2 mm×13 mm），Western blotting顯影儀、蛋白垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組和模型復制

首先將60只雌性小鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白組10只，模型復制組50只。隨后進行荷瘤加化療模型制備：將4T1-Luciferase小鼠乳腺癌細胞濃度調(diào)整為2×106個/mL，分別在模型復制組小鼠的第4乳墊區(qū)皮下接種0.1 mL細胞，接種7～10 d，當腫瘤體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm時，給予模型復制組腹腔注射CTX 100 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，以模型復制組小鼠體重下降、食欲減退、毛發(fā)稀疏、精神萎靡、行動遲緩、活動度減低、便溏等一般情況以及強迫游泳不動時間延長、曠場內(nèi)的水平運動得分和垂直運動得分降低為模型復制成功標準。

1.5 干預方法

模型復制成功后于次日開始干預，共14 d。針刺組小鼠參考《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》[10]，選取位于小鼠膝關(guān)節(jié)下方，腓骨頭下0.3 cm處的肌溝中的“足三里”，后肢內(nèi)踝尖上0.5 cm處的“三陰交”，臍后方1 cm處的“關(guān)元”，臍后方0.5 cm處的“氣海”和頂骨正中的“百會”。在穴位處消毒后，足三里直刺3 mm，三陰交直刺1.5 mm，關(guān)元斜刺1.5 mm，氣海斜刺1.5 mm，百會平刺1 mm，留針30 min，6 min行針1次，1次/d，6 d/周，共14 d；假針刺組每日陪同抓取，固定，不治療。

1.6 小鼠一般情況、體力和疲勞情況評估

分別于模型復制后次日和干預14 d后觀察各組小鼠的體重、精神狀態(tài)、活動度、飲食、毛發(fā)及大便性狀等。分別于模型復制后次日和干預14 d后采用強迫游泳實驗和曠場實驗檢測小鼠疲乏狀況。強迫游泳實驗即在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放入直徑10 cm，高度25 cm的圓柱形透明水桶中，保持桶中的水深10～15 cm，水溫在23～25 ℃，用攝像系統(tǒng)記錄6 min小鼠游泳時間，統(tǒng)計后4 min小鼠的不動時間，以此評估小鼠的體力和疲勞情況；曠場實驗是在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放置在敞箱底面的中心方格內(nèi)，箱上方安置攝像系統(tǒng)，記錄分析小鼠在箱內(nèi)3 min的水平運動得分（小鼠穿越底面塊數(shù)，穿越1塊計1分）和垂直運動得分（小鼠后腿直立次數(shù)，每次計1分），以此評估小鼠在陌生環(huán)境中的自發(fā)運動能力。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠血清ACTH、CORT的含量

小鼠治療后，眼眶取血，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，提取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待測。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒操作說明測定血清ACTH、CORT的含量。

1.8 Western blotting檢測下丘腦和結(jié)腸中炎癥因子的表達

小鼠干預14 d后，處死，開顱取腦，分離下丘腦組織，同時剖腹取結(jié)腸組織，放置在凍存管中，置入-80 ℃?zhèn)溆?。取下丘腦和結(jié)腸組織稱重后勻漿機勻漿，然后加入RIPA裂解液獲取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白含量；根據(jù)蛋白濃度上樣，12.5% PAGE-SDS電泳80 V 30 min、120 V 60 min，轉(zhuǎn)膜250 mA 30 min、脫脂奶粉封閉1 h，IL-1β、IL-6、TNF-α一抗孵育過夜后棄掉一抗，洗滌液洗板后，加入二抗室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液和顯影定影試劑發(fā)光顯色，Image J軟件系統(tǒng)分析灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌化療后CRF模型評價

本實驗共使用50只小鼠復制乳腺癌化療后CRF模型，其中5只小鼠模型復制過程中死亡；根據(jù)強迫游泳和曠場行為學實驗進行模型復制后的行為學觀察，剔除不疲乏小鼠6只，將剩余的39只模型復制小鼠隨機分為模型組、針刺組、假針刺組，每組13只。在干預過程中，各組均死亡3只、部分數(shù)據(jù)不合格剔除2只，最終3組均剩余8只完成整個實驗。

2.2 各組小鼠體重及一般情況觀察

與空白組小鼠比較，模型組小鼠毛發(fā)稀疏、精神萎靡、攝食飲水減少、行動遲緩、大便稀黏等表現(xiàn)。在針刺干預2周后，與模型組比較，針刺組小鼠精神狀態(tài)、攝食飲水、活動度、毛發(fā)情況恢復較好，接近空白組小鼠狀態(tài)；而假針刺組與其比較無明顯變化。

2.3 各組小鼠行為學比較

各組小鼠模型復制前強迫游泳不動時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組小鼠模型復制后強迫游泳不動時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組長于空白組。各組小鼠干預前和干預后強迫游泳不動時間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組干預后長于針刺組（P＜0.05），假手術(shù)組干預后長于針刺組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠不同時間點強迫游泳不動時間比較（n=8，±s）

表1 各組小鼠不同時間點強迫游泳不動時間比較（n=8，±s）

組別模型復制后181.8±23.6 124.5±10.5 124.9±9.8 30.7±11.8 158.916 0.000強迫游泳不動時間模型復制前27.5±10.9 27.8±10.7 25.6±8.7 25.9±11.3 0.101 0.959模型組假針刺組針刺組空白組F 值P 值強迫游泳不動時間干預前181.8±23.6 124.5±10.5 124.9±9.8-38.484 0.000干預后180.9±21.8 173.6±16.4 123.6±9.8-31.085 0.000

模型組與空白組小鼠模型復制前水平運動得分、垂直運動得分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組與空白組小鼠模型復制后水平運動得分、垂直運動得分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組低于空白組（P＜0.05）。見表2。

表2 模型組與空白組小鼠模型復制前后水平運動得分、垂直運動得分比較 （n=8，±s）

表2 模型組與空白組小鼠模型復制前后水平運動得分、垂直運動得分比較 （n=8，±s）

組別模型組空白組F 值P 值水平運動得分模型復制前108.6±7.1 110.0±6.5 0.625 0.532模型復制后48.0±8.3 95.6±3.6 83.872 0.000垂直運動得分模型復制前24.8±8.3 25.1±7.0 0.264 0.792模型復制后11.4±1.5 26.2±7.2 21.657 0.000

模型組、假針刺組、針刺組小鼠干預前水平運動得分、垂直運動得分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組、假針刺組、針刺組小鼠干預后水平運動得分、垂直運動得分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），針刺組高于模型組、假針刺組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠干預前后水平運動得分、垂直運動得分比較 （n=8，±s）

表3 各組小鼠干預前后水平運動得分、垂直運動得分比較 （n=8，±s）

組別垂直運動得分干預前13.0±11.0 11.4±3.5 13.1±4.0 0.304 0.743水平運動得分干預前41.3±9.4 43.3±9.5 45.3±9.7 0.212 0.812干預后30.3±5.9 29.5±4.9 41.2±8.8 4.673 0.032模型組假針刺組針刺組F 值P 值干預后6.8±1.9 7.2±2.9 11.6±3.7 4.305 0.039

2.4 各組小鼠小鼠下丘腦組織IL-1β、IL-6、TNFα蛋白相對表達量比較

各組小鼠下丘腦IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、假針刺組高于空白組（P＜0.05），針刺組低于模型組、假針刺組（P＜0.05）。見表4和圖1。

圖1 各組下丘腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白條帶圖

表4 各組小鼠下丘腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表4 各組小鼠下丘腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

組別空白組針刺組模型組假針刺組F 值P 值IL-1β 0.24±0.07 0.41±0.06 0.84±0.08 0.82±0.05 276.207 0.000 TNF-α 0.41±0.01 0.49±0.01 0.74±0.02 0.79±0.02 30.976 0.000 IL-6 0.32±0.03 0.44±0.05 0.78±0.01 0.79±0.02 191.512 0.000

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較

各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組、模型組、假針刺組高于空白組（P＜0.05），針刺組低于模型組、假針刺組（P＜0.05）。見表5和圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白條帶圖

表5 各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

組別空白組針刺組模型組假針刺組F 值P 值IL-1β 0.33±0.04 0.42±0.03 0.80±0.01 0.82±0.02 59.055 0.000 TNF-α 0.36±0.07 0.46±0.10 0.82±0.04 0.81±0.07 453.071 0.000 IL-6 0.34±0.10 0.44±0.12 0.73±0.08 0.75±0.06 114.745 0.000

2.6 各組小鼠血清ACTH、CORT蛋白水平比較

各組小鼠血清ACTH、CORT蛋白水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、假針刺組ACTH蛋白水平高于空白組（P＜0.05），CORT蛋白水平低于空白組（P＜0.05）；針刺組ACTH蛋白水平低于模型組（P＜0.05），CORT蛋白水平高于模型組（P＜0.05）；針刺組ACTH蛋白水平低于假針刺組（P＜0.05），CORT蛋白水平高于假針刺組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠血清ACTH、CORT蛋白水平比較（n=8，pg/mL，±s）

表6 各組小鼠血清ACTH、CORT蛋白水平比較（n=8，pg/mL，±s）

組別空白組針刺組模型組假針刺組F 值P 值A(chǔ)CTH 82.47±3.17 88.69±6.11 135.72±12.92 135.57±17.37 52.204 0.000 CORT 666.39±109.34 386.04±69.57 107.12±39.01 113.05±36.41 15.848 0.000

3 討論

CRF屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，主要病機為臟腑氣血陰陽的虧虛[11]?；熑纭八幎尽?，耗傷機體脾胃氣陰，脾胃乃氣血生化之源，脾胃虛則氣血生化無源，則有疲勞、乏力、納差等癥狀，故化療后引起的CRF基本病機為“虛”，脾胃受損為主，并兼氣血陰陽虧虛[12]。中醫(yī)傳統(tǒng)針刺療法治療CRF有其獨特優(yōu)勢，其可通過毫針刺激穴位，并施以補瀉手法，激發(fā)經(jīng)氣，起到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)臟腑、運行氣血、扶正祛邪的作用。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，具有補益氣血之功；三陰交屬足太陰脾經(jīng)，又與肝經(jīng)、腎經(jīng)相交通，有滋陰養(yǎng)脾、補益肝腎之功效；百會為諸陽之會，是人體陽氣最強盛的地方，一穴補諸陽；關(guān)元、氣?？善鸬郊ぐl(fā)正氣，補益中氣之功效[13]。李文濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)益三焦針法可緩解肺癌CRF患者的疲勞狀態(tài)，增強患者免疫功能，改善生活質(zhì)量；另一項研究證實針刺百會、內(nèi)關(guān)、氣海、足三里、三陰交治療后，乳腺癌康復期患者的疲乏程度明顯低于假穴淺刺組，生活質(zhì)量得到明顯提高[9]；同時根據(jù)另一項Meta分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺治療CRF穴位使用頻次較多的為足三里、關(guān)元、氣海、三陰交、合谷、百會穴[15]。因此，本研究選用針刺足三里、三陰交、關(guān)元、氣海、百會五個穴位，起到補益氣血陰陽，滋養(yǎng)脾腎的功效。

本研究通過復制乳腺癌化療后CRF小鼠模型，結(jié)合小鼠一般情況及強迫游泳實驗、曠場實驗，發(fā)現(xiàn)乳腺癌化療后CRF小鼠行動遲緩、精神萎靡、毛發(fā)稀疏、大便稀黏、體重明顯下降，強迫游泳不動時間明顯延長，曠場內(nèi)的水平運動得分和垂直運動得分均出現(xiàn)下降，證實荷瘤加化療治療的方法可以引起小鼠疲乏癥狀。針刺治療后，小鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，強迫游泳不動時間明顯縮短，曠場內(nèi)的水平運動得分和垂直運動得分均升高，提示治療組小鼠疲乏程度有所減輕。結(jié)果證實針刺治療可改善乳腺癌化療后CRF小鼠的疲乏癥狀。

研究表明，CRF的發(fā)生與腫瘤本身、針對腫瘤的治療措施、腫瘤合并癥及與這些相關(guān)的社會心理等因素有關(guān)，但其具體的發(fā)病原因和機制尚不完全清楚，可能與炎性介質(zhì)學說、HPA軸改變等諸多因素有相關(guān)性[5,16]。姜萍嵐等[17]研究證實腫瘤及其治療均可以激活促炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)，特別是在放化療期間會產(chǎn)生IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、CRP等促炎細胞因子，這些炎癥因子可通過破壞的腸道屏障、血腦屏障等各種途徑進入大腦，引起中樞炎癥反應(yīng)，破壞HPA軸，減少皮質(zhì)醇合成和釋放，引起疲乏。SCHREPF等[18]發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療完成后1年內(nèi)疲乏癥狀得到改善的卵巢癌患者血漿中IL-6水平也隨之降低。另有研究者發(fā)現(xiàn)，TNF-α的表達水平與肺癌CRF有關(guān)，疲乏組表達水平高于對照組[19]。本研究結(jié)果表明，與正常組小鼠比較，模型組、假針刺組小鼠下丘腦組織和結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，經(jīng)針刺治療后，上述細胞因子均顯著降低，表明乳腺癌化療后CRF小鼠中腸道和中樞炎癥水平較高，而通過針刺治療可明顯抑制下丘腦和結(jié)腸的促炎因子分泌，改善中樞和腸道的炎癥反應(yīng)。

HPA軸包括CORT、CRH、ACTH等。有研究表明，HPA軸的改變在疲乏的發(fā)生、發(fā)展中充當重要角色[20]。一項隨機對照試驗發(fā)現(xiàn)，CRF組患者血清ACTH水平顯著高于非疲乏組，且ACTH與CRF呈高度正相關(guān)[21]；WEINRIB等[22]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者血清CRH的變化與CRF呈負相關(guān)；MCEWEN等[23]指出，HPA軸可通過調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素而調(diào)節(jié)促炎癥細胞因子的水平。CORT是糖皮質(zhì)激素，主要受促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)，同時CORT又可以對促腎上腺皮質(zhì)激素水平起反饋調(diào)節(jié)，而抗腫瘤治療可以擾亂這種反饋調(diào)節(jié)機能，使皮質(zhì)醇水平調(diào)節(jié)紊亂，從而導致CRF的發(fā)生[24]。本研究結(jié)果表明，與正常組比較，模型組、假針刺組小鼠CORT水平明顯降低、ACTH水平明顯升高；經(jīng)針刺治療后，針刺組CORT水平顯著升高，ACTH水平明顯下降，表明乳腺癌化療后CRF小鼠中存在下丘腦相關(guān)激素水平紊亂，而通過針刺治療可明顯調(diào)節(jié)下丘腦相關(guān)激素水平變化，改善HPA軸功能紊亂狀態(tài)。

綜上所述，本研究證明針刺可降低乳腺癌化療后CRF模型小鼠下丘腦、結(jié)腸組織中促炎因子水平，改善中樞和腸道的炎癥反應(yīng)，使進入大腦的炎癥因子減少，進而提升血清CORT水平，降低ACTH水平，調(diào)節(jié)HPA軸功能紊亂狀態(tài)，從而減輕乳腺癌CRF的疲乏癥狀，這可能是針刺治療CRF的作用機制之一。同時本研究也存在一定的局限性，對腸-腦軸中生理屏障、全身炎癥及中樞其他部分炎癥等相關(guān)研究并未深入探討，因此實驗后續(xù)將在前期研究基礎(chǔ)上探討腸-腦軸更多相關(guān)指標的研究，為針刺通過調(diào)節(jié)腸道微生物-腸-腦軸治療CRF的作用機制提供更多理論依據(jù)。