甜糯玉米籽粒不同發(fā)育時期基因表達譜和生理生化特性分析

高志方 周玲 梁帥強 張體付 戴惠學 朱英 趙涵

摘要：利用快中子誘變糯玉米自交系通系5，獲得在同一籽粒上表現(xiàn)甜質(zhì)與糯質(zhì)特性的玉米突變材料，命名為甜糯玉米。以甜糯玉米和通系5為研究對象，利用生理生化測定和轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，揭示甜糯玉米在籽粒發(fā)育不同時期的代謝及基因表達差異。結(jié)果表明，在胚乳發(fā)育的各個時間點上甜糯玉米中的淀粉含量均極顯著低于通系5玉米，可溶性總糖、蔗糖含量均極顯著高于通系5玉米。甜糯玉米胚乳的糊化特征參數(shù)均極顯著低于通系5，在授粉后20 d開始呈劇烈增加趨勢。差異轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，與通系5相比，甜糯玉米中有154個基因在胚乳中的表達顯著下調(diào)。籽粒發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄組差異表達分析發(fā)現(xiàn)，4 914個基因僅在通系5的籽粒發(fā)育過程中存在差異表達，富集到生物體發(fā)育、RNA修飾等生物過程；1 829個基因僅在甜糯玉米中差異表達，富集到響應(yīng)化學物質(zhì)、響應(yīng)非生物刺激等生物過程。共同差異表達基因在2種玉米中存在動態(tài)表達趨勢差異。本研究結(jié)果為優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供了種質(zhì)材料和遺傳信息。

關(guān)鍵詞：甜糯玉米；籽粒發(fā)育；物質(zhì)含量；糊化特征；轉(zhuǎn)錄組學；差異表達分析

中圖分類號：S513.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0027-09

鮮食玉米是指在乳熟后期至蠟熟初期采摘果穗，用于加工或直接食用的玉米［1］。根據(jù)品質(zhì)類型，我國鮮食玉米可分為甜玉米、糯玉米、甜糯玉米及其他適合鮮食的玉米類型［2-3］。甜糯玉米是近些年培育出的一種新型鮮食玉米，由糯玉米和甜質(zhì)雙隱性或多隱性基因純合體雜交而成，同一果穗上表達不同品質(zhì)類型的籽粒使玉米表現(xiàn)出既甜又糯的口感［4-6］。甜糯玉米因其獨特的口感風味，深受廣大消費者喜愛，其市場需求仍在不斷增大［7］。但是現(xiàn)有甜糯玉米中甜、糯品質(zhì)在不同籽粒上的分離，導致其口感和果穗外觀略有欠缺。培育在一個籽粒上同時包含甜與糯特性的玉米品種，能夠有效改良甜糯玉米的食味品質(zhì)，滿足人民的消費需求。筆者所在課題組以經(jīng)典糯玉米自交系——通系5作為受體材料，使用快中子輻射誘變技術(shù)，獲得同一籽粒上表現(xiàn)甜與糯口感的玉米材料，該材料種子在授粉后甜度逐漸增強，到20 d左右時甜度最高，之后甜度降低糯性增加表現(xiàn)為糯玉米，但是其甜度比普通糯玉米要高，甜糯玉米干籽粒出現(xiàn)皺縮、頂端凹陷的表型。本研究利用生化檢測與RNA-seq技術(shù)，揭示甜糯玉米籽粒不同發(fā)育時期的生理生化特性與基因表達譜，為優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供了種質(zhì)材料和遺傳信息。

1 材料與方法

1.1 突變體材料獲得與純化

以通系5糯玉米自交系為受體材料，使用劑量為1.28、2.08、3.99、10.50 Gy的快中子輻射進行誘變，篩選到籽粒頂端有明顯皺縮凹陷的突變體材料。將突變材料于江蘇省南京市江寧橫溪基地連續(xù)自交4代后獲得純合材料。

1.2 籽粒發(fā)育不同時期樣品取樣

通系5和甜糯玉米于2023年種植于江蘇省南京市江寧橫溪基地。取自交授粉后14、18、20、22、26 d的玉米穗（保留玉米苞衣），于取樣當天將籽粒去除種皮，收集胚乳樣品，液氮速凍后于-80 ℃儲存。取樣過程中使用的培養(yǎng)皿、樣品收集管均置于冰上，保持低溫環(huán)境。每個材料在各個時間點分別取3個生物學重復(fù)。

1.3 樣品前處理

將胚乳樣品在液氮環(huán)境下使用多樣品組織研磨儀（Tissuelyser-48L，凈信，中國）研磨成粉末，用于后期淀粉、蔗糖、可溶性總糖含量測定以及總RNA提?。粚⑴呷闃悠酚谡婵绽鋬龈稍餀C（FD-1A-50，博醫(yī)康，中國）中進行冷凍干燥，然后用研磨儀研磨成粉末，用于支鏈淀粉含量測定以及糊化特性分析。將通系5和甜糯玉米的干種子使用研磨儀研磨成粉末后過100目篩，用于干種子粉的糊化特性分析。

1.4 玉米淀粉糊化特性分析

稱取 3 g 玉米干種子或胚乳樣品粉末放入鋁筒中，加入 25 mL 蒸餾水混勻，使用快速黏度分析儀（RVA-3D，紐波特科技，澳大利亞）中標準程序1進行測定［8］。使用TCW軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個樣品重復(fù)測定2次。

1.5 胚乳中物質(zhì)含量分析

1.5.1 淀粉含量測定

使用淀粉含量檢測試劑盒（BC0705，索萊寶，中國）測定胚乳樣品中的淀粉含量。液氮環(huán)境下稱取約0.03 g胚乳粉末，按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng)，使用酶標儀（Cytation5，伯騰，美國）測定反應(yīng)液在620 nm波長處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。淀粉含量計算：

淀粉含量（mg/g）=x×V提取÷m÷1.11×F=0.811x÷m×F。（1）

式中：x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度，mg/mL；V提取為提取后體積，0.9 mL；m為樣本質(zhì)量，g；F為樣本稀釋倍數(shù)；1.11是此法測得葡萄糖含量換算為淀粉含量的常數(shù)，即 111 μg 葡萄糖用蒽酮試劑顯示的顏色相當于100 μg淀粉用蒽酮試劑顯示的顏色。

1.5.2 支鏈淀粉含量測定

使用支鏈淀粉含量檢測試劑盒（BC4270，索萊寶，中國），測定胚乳樣品中的支鏈淀粉含量。稱取約0.005 g冷凍干燥粉末樣品，按照試劑盒中標準操作流程提取樣品中支鏈淀粉，與反應(yīng)液反應(yīng)后使用酶標儀測定530 nm 和 755 nm 處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。支鏈淀粉含量計算：

支鏈淀粉含量（mg/g）=x×V樣總÷m=5x÷m。（2）

式中：x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度，mg/mL；V樣總為加入試劑盒中試劑四體積，5 mL；m為樣本質(zhì)量，g。

1.5.3 蔗糖含量測定

使用植物蔗糖含量檢測試劑盒（BC2465，索萊寶，中國），測定胚乳樣品中的蔗糖含量。液氮環(huán)境下稱取約0.1 g胚乳粉末，按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng)，使用酶標儀測定反應(yīng)液在480 nm處的吸光度，空白管、標準管和測定管的測定值分別記為 D1、D2 和 D3。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。蔗糖含量計算：

蔗糖含量（mg/g）=（C標準管×V1）×（D3-D1）÷（D2-D1）÷（m×V1÷V2）= （D3-D1）÷（D2-D1）÷m。（3）

式中：C標準管為標準管濃度，1 mg/mL；V1為加入樣本體積，0.025 mL；V2為加入提取液體積，1 mL；m為樣本質(zhì)量，g。

1.5.4 可溶性總糖含量測定

使用植物可溶性糖含量檢測試劑盒（BC0035，索萊寶，中國），測定胚乳樣品中的可溶性總糖含量。液氮環(huán)境下稱取約 0.1 g 胚乳粉末，按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng)，使用酶標儀測定反應(yīng)液在620 nm處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次?？扇苄蕴呛坑嬎悖?/p>

可溶性糖含量（mg/g）=（x×V1）÷（m×V1÷V2）=10x÷m。（4）

式中：x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度，mg/mL；V1為加入樣本體積，0.04 mL；V2為樣本總體積，10 mL；m為樣本質(zhì)量，g。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用Origin 2018和illustrator軟件進行相關(guān)分析作圖。

1.6 胚乳樣品總RNA提取

使用植物總RNA提取試劑盒（RC411-01，諾唯贊，中國）提取胚乳樣品總RNA。液氮環(huán)境下稱取0.05～0.06 g胚乳樣品粉末，按照試劑盒中提供的操作流程提取總RNA。RNA溶于無RNA酶的雙去離子水中，于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序

將RNA樣品進行濃度與完整性檢測，滿足濃度≥60 ng/μL、總量≥2 μg、RNA完整性（RIN）≥5.5的建庫要求后，構(gòu)建有參普通真核轉(zhuǎn)錄組類型文庫，文庫質(zhì)檢合格后，使用Illumina測序平臺進行高通量測序［安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司］。測序結(jié)果經(jīng)BCL-Convert軟件進行序列堿基識別后轉(zhuǎn)化為原始測序序列。

1.8 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

對原始測序序列進行過濾處理，去除接頭污染、低質(zhì)量（Q>30）以及含氮比例大于5%的初始序列，獲得高質(zhì)量的干凈序列進行后續(xù)分析［9］。使用Salmon 軟件（1.1.0版本）將過濾后的序列比對到玉米B73參考基因組（https：//download.maizegdb.org/Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0/），使用quasi-mapping方法計算基因的表達量［10-11］。以｜log2FC｜≥1和P<0.01為標準，用DESeq2 R包在R語言環(huán)境下（4.3.1版）分析各個發(fā)育時間點甜糯玉米相對于通系5的差異表達基因［12］。對相同材料中5個時間點進行兩兩比較，篩選｜log2FC｜≥1、P<0.01的基因為發(fā)育過程中差異表達的基因。

1.9 生物信息學分析

組間差異基因的維恩分析及圖形繪制使用bioinformatics網(wǎng)站的Venn Diagrams在線軟件完成（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；使用pheatmap包在R語言條件下繪制差異表達基因的熱圖；使用在線AgriGO v2.0工具包對甜糯和通系5玉米發(fā)育過程中特異差異表達基因進行基因本體論（GO）富集分析，顯著富集的條目使用ggplot2（2.2.1版）包在R語言環(huán)境下繪制泡泡圖［13］。發(fā)育過程中的差異基因動態(tài)趨勢分析使用Omicshare在線工具（https：//www.omicshare.com/），P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，趨勢的數(shù)量選擇為20。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得甜糯玉米突變體材料

利用快中子技術(shù)誘變通系5獲得1種同一籽粒同時具備甜質(zhì)與糯質(zhì)特性的玉米材料。該突變材料的植株與受體材料通系5無明顯差異，但其成熟的籽粒出現(xiàn)明顯的頂部皺縮表型（圖1）。為分析甜糯玉米種子的糯性是否與通系5玉米有差異，使用快速黏度分析儀檢測甜糯和通系5玉米干種子的糊化特性。由圖2和表1可見，2種玉米種子的糊化曲線相似，糊化特征的各個參數(shù)，如峰值黏度、谷值黏度、終值黏度等，無明顯差異。對甜糯和通系5玉米籽粒進行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，甜糯玉米胚乳中的淀粉粒形狀與通系5相似，均呈現(xiàn)為不規(guī)則型且無明顯的單面，但是淀粉粒體積比通系5的淀粉粒小，顆粒之間空隙更大，排列疏松（圖3）。在對該材料進行品嘗時發(fā)現(xiàn)，在籽粒發(fā)育前期（授粉后20 d內(nèi)），其口感類似于甜玉米，而在后期，其糯性增加，但是甜度仍高于通系5。將該材料命名為甜糯玉米。

2.2 籽粒發(fā)育不同階段的物質(zhì)含量分析

玉米胚乳是淀粉等貯存物質(zhì)的主要存儲組織，為分析甜糯玉米材料與其受體材料通系5在種子發(fā)育過程中的物質(zhì)差異，選取授粉后14、18、20、22、26 d 的玉米籽粒胚乳進行測試分析。由圖4-a可見，隨授粉天數(shù)增加，甜糯和通系5玉米胚乳中淀粉含量均逐漸增加，但在每個發(fā)育時間點，甜糯玉米胚乳中的淀粉含量均極顯著低于通系5。支鏈淀粉是糯玉米種子中的主要淀粉形式，檢測甜糯和通系5玉米胚乳中的支鏈淀粉含量發(fā)現(xiàn)，除授粉后 20 d 外，在其他各發(fā)育時間點上，甜糯玉米胚乳中的支鏈淀粉含量均極顯著低于通系5，尤其是在授粉后14、18 d，甜糯中的支鏈淀粉含量僅為通系5中的63.9%和62.9%（圖4-b）。

種子中的可溶性糖含量決定玉米種子的甜度。可溶性總糖檢測結(jié)果顯示，隨授粉天數(shù)增加，甜糯和通系5玉米胚乳中的可溶性總糖含量總體呈下降趨勢（圖4-c）。在5個發(fā)育時間點上，甜糯玉米胚乳中的可溶性總糖含量均極顯著高于通系5玉米，尤其是在授粉后26 d時，通系5玉米胚乳中僅能檢測到2.5 mg/g可溶性糖，但在甜糯玉米胚乳中可溶性糖含量為34.2mg/g，即胚乳中的可溶性糖占比為3.4%。與可溶性總糖含量的結(jié)果相似，隨授粉天數(shù)的增加，玉米胚乳中的蔗糖含量總體呈下降趨勢，在5個發(fā)育時間點上，甜糯玉米胚乳中的蔗糖含量均極顯著高于通系5玉米（圖4-d）。

2.3 籽粒發(fā)育不同階段的糯性分析

為分析甜糯與通系5玉米籽粒在發(fā)育過程中的糯性差異，檢測了授粉后14、18、20、22、26 d的玉米籽粒胚乳樣品的糊化特性。由表2可見，甜糯玉米胚乳的糊化特征參數(shù)，包括峰值黏度、谷值黏度、崩解值、終值黏度、回生值，均極顯著低于通系5。從變化趨勢分析，隨著授粉天數(shù)增加，甜糯玉米胚乳的黏度變化與通系5相似，均總體呈現(xiàn)上升趨勢，在籽粒發(fā)育中后期，峰值黏度、谷值黏度、終值黏度均呈現(xiàn)劇烈增加的趨勢（圖5）。

2.4 甜糯與通系5玉米胚乳差異表達基因

為分析甜糯與通系5玉米的基因表達差異，分別提取5個發(fā)育時間點的甜糯與通系5玉米胚乳樣品總RNA，進行測序后獲得RNA-seq數(shù)據(jù)。對過濾后的數(shù)據(jù)進行差異分析后發(fā)現(xiàn)，在授粉后14、18、20、22、26 d的甜糯玉米胚乳中分別鑒定到1 417、3 033、3 270、4 237、3 864個差異表達基因（DEGs，｜log2FC｜≥1，P<0.01），其中有155個基因共同包含在5個時間點的DEGs中（圖6-A）。這些共同包含的DEGs中僅有1個在甜糯玉米胚乳中呈上調(diào)表達，其余基因均為下調(diào)表達（圖6-B）。對155個DEGs進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因未被富集到特定通路中。約2/3的共同包含DEGs在甜糯玉米胚乳中的變化倍數(shù)超過10倍，其中大多數(shù)DEGs在通系5玉米胚乳中鑒定到較高的counts數(shù)（原始堿基計數(shù)），而在甜糯材料中很難被鑒定到。例如一種編碼賴氨酸-組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因（Zm00001d002176）在通系5玉米胚乳中鑒定到的counts數(shù)分布在280～550，而在甜糯玉米胚乳中5個時間點最多鑒定到3個counts，表明此基因的表達在甜糯玉米胚乳中被強烈抑制。

2.5 籽粒發(fā)育不同階段的差異表達基因分析

為解析甜糯材料的突變?nèi)绾斡绊懽蚜０l(fā)育過程，分別分析了通系5和甜糯玉米胚乳中隨發(fā)育過程發(fā)生顯著變化的基因，即在5個時間點間表達量存在差異的基因（｜log2FC｜≥1，P<0.01）。由圖7-A可見，在通系5中存在8 412個顯著變化的基因，其中4 914個基因僅在通系5胚乳發(fā)育過程中

發(fā)生顯著變化，而在甜糯玉米中未發(fā)生變化。對這些基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼的蛋白可能參與生物體發(fā)育過程、生殖過程、物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程、RNA修飾以及細胞壁組織或生物發(fā)生過程，分布于細胞的各個部位，如細胞膜、線粒體、液泡等（圖7-B）。被顯著富集的分子功能條目僅有2個，即核糖體的結(jié)構(gòu)成分和內(nèi)切酶活性。

在甜糯玉米中，有5 327個基因的表達量隨胚乳發(fā)育過程發(fā)生顯著變化，其中1 829個基因僅在甜糯玉米中發(fā)生顯著變化。對這些甜糯特異變化基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因顯著富集到響應(yīng)化學物質(zhì)、響應(yīng)非生物刺激、響應(yīng)激素、RNA生物合成過程調(diào)節(jié)、小分子生物合成等生物過程（圖7-C）。顯著富集的細胞組分和分子功能條目僅有3個，分別為細胞膜、質(zhì)體以及結(jié)合特意DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子活性（轉(zhuǎn)錄因子活性，特異序列DNA結(jié)合）。

在通系5和甜糯玉米的籽粒發(fā)育過程中有 3 498 個共同顯著變化基因。為分析甜糯材料的突變是否影響胚乳發(fā)育過程中特定基因的表達變化趨勢，本研究對這些共同變化基因分別在通系5和甜糯玉米中的趨勢變化進行分析。由圖8-A可見，在通系5玉米中，有2 398個基因顯著聚類到6種變化趨勢，包括在授粉后18 d出現(xiàn)最低值的P5和P6，在授粉后22 d出現(xiàn)最低值的P8，分別在授粉后20 d和18 d出現(xiàn)峰值的P11和P13以及在胚乳發(fā)育過程中持續(xù)上升的P19。在甜糯玉米中，有 2 433 個基因聚類到5個顯著變化趨勢，其中P8、P13和P19與通系5中聚類的趨勢顯著性相同，而P0（授粉后表達量持續(xù)下降）和P15（先增后降再增，隨后持平）顯著是甜糯玉米特有的。通系5和甜糯玉米雖然聚類到3個相同的動態(tài)趨勢，但在這些趨勢中包含的基因數(shù)量有較大差異，例如，通系5玉米的P13趨勢中包含703個基因，而甜糯玉米中僅包含272個基因；通系5玉米的P19中包含644個基因，而甜糯玉米P19中的基因數(shù)量高達1 199個。通過對相同基因在2種玉米中的變化趨勢所屬類型進行分析，發(fā)現(xiàn)在通系5中變化趨勢屬于P13趨勢的703個基因，在甜糯玉米中分別有177、67、57、92個轉(zhuǎn)變?yōu)镻8、P15、P17、P19趨勢；而在通系5中有124、199、92、57個分別屬于P6、P11、P13、P18趨勢的基因，在甜糯玉米中的變化趨勢都變?yōu)槌掷m(xù)上升趨勢（P19）（圖8-B）。這些結(jié)果表明，甜糯玉米的突變導致玉米胚乳發(fā)育過程中的基因表達趨勢的改變。

3 討論與結(jié)論

在玉米籽粒發(fā)育過程中，可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，其峰值出現(xiàn)在授粉后8～10 d，在此時，淀粉開始積累，籽粒進入灌漿期［14］。糯玉米籽粒隨著淀粉含量的增加，糯性逐漸增加［15-16］。糯玉米籽粒的糊化特性，尤其是峰值黏度、谷值黏度和終值黏度，與玉米糯性呈顯著正相關(guān)［17］。本研究中，甜糯玉米中的可溶性總糖和蔗糖含量均極顯著高于受體材料通系5（圖4）。授粉后20 d之前，甜糯玉米的糊化特性中的黏度相關(guān)指標均較低，表明其糯性較低（圖5）。因此，在授粉后20 d之前，甜糯玉米籽粒表現(xiàn)偏向于甜玉米，而在20 d之后，甜糯玉米中的淀粉含量劇烈增加，糊化特性中的黏度相關(guān)指標均劇烈升高，其糯性逐漸增加，此時可溶性總糖含量和蔗糖含量仍極顯著高于通系5，表明在20 d之后，玉米籽粒表現(xiàn)出甜與糯共存的特性。

甜糯玉米與通系5的差異轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，有154個基因的表達在甜糯玉米胚乳中被強烈抑制（圖6），這些基因的發(fā)掘可為后期甜糯基因的定位與遺傳機理的解析提供參考。對籽粒發(fā)育不同階段的差異表達基因進行分析發(fā)現(xiàn)，通系5玉米胚乳中鑒定到8 412個基因在授粉后的不同階段存在差異表達，而甜糯玉米中的差異基因有5 327個，其數(shù)量明顯少于通系5（圖7）。4 914個基因僅在通系5胚乳發(fā)育過程中顯著變化，而在甜糯玉米中未發(fā)生顯著變化，暗示這些基因可能是甜糯基因的下游基因，在甜糯基因功能缺失后，這些基因在胚乳發(fā)育過程中無法被正常動員。1 829個基因僅在甜糯玉米中存在顯著變化，這些基因顯著富集到響應(yīng)非生物刺激、響應(yīng)激素、免疫反應(yīng)、過氧化氫代謝過程等生物過程，表明甜糯基因突變可能導致大量抗逆過程被調(diào)動。

綜上，本研究揭示了甜糯玉米在授粉后不同發(fā)育時期表現(xiàn)甜與甜糯特性差異的生理生化機制，通過籽粒發(fā)育不同時期差異轉(zhuǎn)錄組學分析，獲得甜糯玉米與其受體材料通系5的差異基因表達譜，可為后期甜糯基因定位與功能分析以及優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供數(shù)據(jù)支撐。

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