基于解吸電噴霧質譜成像技術分析番紅花球莖中代謝物的組織分布

陳 希，謝星光，馮坤苗，陸穎潔，韓 婷 （海軍軍醫(yī)大學藥學系生藥學教研室, 上海 200433）

西紅花，為鳶尾科多年生植物番紅花（Crocus sativusL.）的干燥柱頭，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效[1]。番紅花是三倍體不育植物，只能通過被稱為球莖的塊狀球莖無性繁殖。西紅花的產(chǎn)量和品質與球莖大小直接相關[2]。而球莖中包含的有機酸、脂肪酸、萜類等化合物[3]與球莖生長代謝過程密切相關，并在很大程度上影響球莖的大小。然而，目前球莖中內源性代謝物的分析方法均需要將樣本進行勻漿后檢測，這就會造成空間信息的丟失，無法實現(xiàn)原位分析。因此，利用新的技術手段研究番紅花球莖中內源性代謝物的空間分布規(guī)律至關重要。

解吸電噴霧電離質譜成像（DESI-MSI）無需復雜的預處理步驟，可直接對樣品進行可視化分析[4]。目前已在解析植物內源性代謝物的空間定位方面顯示出強大的分析能力。本研究通過優(yōu)化切片厚度，建立了一種靈敏、高覆蓋的質譜成像分析方法，以可視化番紅花球莖中內源性代謝物在不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同部位的空間分布，實現(xiàn)了番紅花球莖中黃酮、有機酸、氨基酸、類胡蘿卜素和環(huán)烯醚萜苷的原位表征。為探究番紅花全生命周期內的生長過程和開展番紅花球莖種質篩選提供了新的技術支持。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1900-冷凍切片機（浙江益迪醫(yī)療科技有限公司）；SYNAPT G2-Si HDMS 質譜成像儀、HD Imaging質譜成像數(shù)據(jù)分析軟件 （Waters 公司）；標準級顯微鏡載玻片（上海泰坦科技股份有限公司）。

OCT 包埋劑（美國櫻花SAKURA 公司）；甲醇（HPLC 級，美國Merck 公司）。

1.2 樣品收集和前處理

番紅花球莖分別購自上海崇明、浙江建德和安徽亳州西紅花種植合作社，批號分別為20230901SH、20230830ZJ、20230830AH，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學韓婷教授鑒定。將新鮮球莖置于冷凍切片機中預冷30 min之后，用OCT 包埋劑固定于切片機樣品托上。連續(xù)切片，分別制備成20、30、40、50 μm 的切片，黏附于載玻片上，在室溫下干燥20 min 后備用。

1.3 DESI 質譜成像分析

將準備好的組織切片置于X 軸和Y 軸二維操控臺上，使用SYNAPT G2-Si HDMS 質譜成像儀在正離子模式下進行檢測。檢測的質荷比（m/z）范圍設定為50～650；空間分辨率為200 μm；施加在電噴霧針上的電壓為3.0 kV；電噴霧針與二維操控臺的角度為38°；離子傳輸管溫度為100 ℃；二維操控平臺移動速度為200 μm/s。質譜成像原始數(shù)據(jù)文件利用HD imaging 軟件轉化成圖片，用總離子流圖進行歸一化。

2 結果和討論

2.1 切片厚度的優(yōu)化

組織切片是獲得高質量質譜成像圖像的關鍵步驟[5]。組織切片的厚度會影響切片的完整性，如果碎裂就無法獲得完整的空間分布圖像[6]。質譜成像在動物、人體內源性代謝物的可視化分布研究起步較早。對于哺乳動物組織，推薦5～20 μm 作為檢測低分子量的最優(yōu)厚度[7]。然而受限于植物組織富含水分，組織容易破碎的特點，難以制成薄片。為了獲得高質量質譜圖片，本研究進行了切片厚度的優(yōu)化。在番紅花球莖中，除了水分之外，淀粉是其干物質的重要組成之一[8]，因此切片時成形性較差，極易造成組織破碎、結構不完整。本研究選用在20～50 μm 之間的浙江建德球莖，以10 μm為梯度，進行了4 個不同的切片厚度探索。結果表明，切片厚度為20 μm 時，頂芽部位存在大部分缺失，球莖部分也存在部分碎裂；30 μm 和40 μm時，頂芽的部位切片完整，但球莖部分仍然不完整，其中40 μm 球莖完整度好于30 μm；而50 μm 切片整體完整度較高，能良好的呈現(xiàn)球莖和頂芽形態(tài)（圖1）。因此本研究選擇50 μm 切片厚度進行后續(xù)質譜成像檢測。

圖1 不同切片厚度的優(yōu)化

2.2 代謝物在球莖不同部位中的分布特征

使用優(yōu)化的條件直接進行DESI-MSI 檢測，獲得球莖切片在正離子模式下的平均質譜圖，如圖2所示，可以觀測到豐富的信號峰，其中，m/z范圍在150～400 之間信號豐度較高，在450～650 范圍內也觀察到不少代謝物，但是豐度較低。用總離子流圖進行歸一化后在HD imaging 軟件中提取質荷比，結合數(shù)據(jù)庫和已報道文獻檢索，共獲得了66 種化合物的空間分布信息。其中，觀察到代謝物在球莖的不同部位具有不同的分布特征。

圖2 番紅花球莖在正離子模式下的DESI 質譜圖

值得關注的是，芹菜素7-（6''-O-乙?；?葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷幾乎只分布在頂芽中；芹菜素7-O-二葡糖醛酸同樣主要分布在頂芽中，球莖部分也有少量分布（圖3）。蜀黍氰苷是廣泛分布于植物界的一種含氮化合物，通過在食草動物的組織破裂時釋放氰化氫而起到化學防御作用[9]。在萌發(fā)的高粱種子中，發(fā)現(xiàn)蜀黍氰苷主要積累在萌發(fā)的胚芽中[10]。本研究中觀察到蜀黍氰苷主要在番紅花球莖萌發(fā)的頂芽中分布，與文獻報道一致，其分布的特異性可能是由于對抗食草動物從而保護新興的組織。黃酮類化合物作為中藥成分的重要藥效部分，具有一定的抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用[11]。異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在西紅花中已有檢測，本次發(fā)現(xiàn)其在頂芽中豐度較高，推測與芽承擔運輸功能有關。

圖3 浙江建德番紅花球莖中不同部位代表性代謝物的質譜成像圖

在球莖中，主要觀察到氨基酸和部分次生代謝物的分布，如L-瓜氨酸、苯乙酰甘氨酸、紫苜蓿酚和梔子苷等均只特異性分布在球莖中（圖3）。氨基酸作為一種重要的初生代謝物，不僅在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的角色，還是生物堿合成的重要前體[12]。因球莖是番紅花的營養(yǎng)器官，故氨基酸主要積累于球莖部位，為其生長提供所需物質和能量。

某些化合物在頂芽和球莖中均可以觀察到，如咖啡酸3-葡萄糖苷、咖啡?；野彼?、迷迭香酸和牡荊素（圖3）。有趣的是，酪氨酸除了分布于球莖部分，在頂芽中也有不少分布。研究表明，酪氨酸參與植物色素合成且是生物堿合成的重要前體[12]，其在球莖和頂芽中均有分布，說明球莖在萌發(fā)過程中已經(jīng)開始色素和生物堿合成的準備。

2.3 代謝物在不同產(chǎn)地番紅花球莖中的分布特征

總體來說，大多數(shù)化合物都呈現(xiàn)出一致的分布規(guī)律。對于在球莖部位分布的化合物來說，在上海的球莖中豐度最高，浙江次之，安徽最低，但是浙江球莖檢測到的化合物種類最多。此外，我們還觀察到了某些化合物在不同產(chǎn)地具有不同的分布規(guī)律。如梔子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-（6''-O-乙?；?葡萄糖苷在上海球莖中未觀察到分布，而異鼠李素-3-O-葡萄糖苷在安徽球莖中未觀察到分布（圖4）。番紅花喜涼怕酷熱、怕嚴寒、喜濕潤，對生長環(huán)境要求較高[13]。上海崇明地處中國最大河流長江入?？?，氣候溫和濕潤，年平均氣溫16.5 ℃，年平均降雨量1 128.9 mm；浙江建德年平均氣溫17.8 ℃，年降水量1 905.1 mm，氣候同樣溫暖濕潤；而安徽亳州年平均氣溫14.9 ℃，屬溫帶半濕潤氣候區(qū)，年平均降雨量僅831 mm。與安徽亳州相比，上海崇明和浙江建德的氣候特點顯然更適于番紅花生長。同時，從光學照片可以發(fā)現(xiàn)，浙江球莖的頂芽分化早于上海和安徽球莖，這可能是浙江球莖內代謝物較為豐富的原因之一。

圖4 不同產(chǎn)地番紅花球莖中代表性代謝物的質譜成像圖

3 結論

本文通過優(yōu)化切片厚度，利用DESI 質譜成像技術對不同產(chǎn)地番紅花球莖內源性代謝物的分布特征進行了可視化研究，實現(xiàn)了黃酮、類胡蘿卜素、氨基酸和有機酸的原位表征。不同化合物在球莖不同部位顯示出不同分布，其中蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素衍生物主要分布于頂芽中，而作為能量和物質供應的氨基酸則主要積累在球莖。此外，不同產(chǎn)地的番紅花球莖也存在較大差異。從成像豐度來看，上海的球莖物質豐度較高，其次是浙江，安徽豐度最低。就化合物的分布規(guī)律而言，大部分代謝物在不同產(chǎn)地球莖中分布是一致的，但也觀察到了一些差異。如梔子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷在上海未觀察到分布，而異鼠李素-3-O-葡萄糖苷僅在上海和浙江產(chǎn)地觀察到分布。我們推測，這可能是由于不同地域的溫度、濕度等環(huán)境因素所致。本研究首次可視化了不同產(chǎn)地番紅花球莖中不同物質在不同部位的分布特征，為探究番紅花全生命周期內的生長過程和開展番紅花球莖種質篩選提供了新的技術支持。