HMS-01 的遺傳毒性評(píng)價(jià)

陳 弋，孫青?，黎 翔，孫 旸，劉 霞 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系臨床藥學(xué)教研室, 上海 00433；.先導(dǎo)物成藥性研究全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 003）

0 前言

肥胖是因體內(nèi)脂肪過(guò)度蓄積導(dǎo)致健康損害的一種機(jī)體狀態(tài)。目前已證實(shí)與肥胖相關(guān)聯(lián)的疾病多達(dá)21 種，廣泛涉及心血管、消化、呼吸、神經(jīng)、肌肉骨骼等系統(tǒng)相關(guān)疾病甚至傳染性疾病[1]。根據(jù)2023 年3 月世界肥胖聯(lián)盟（WOF）公布的《2023世界肥胖地圖》，預(yù)計(jì)到2035 年，肥胖或超重（WHO標(biāo)準(zhǔn)BMI≥25 kg/m2）率將達(dá)到51%，引起的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)4 萬(wàn)億美元[2]。中國(guó)同樣面臨肥胖發(fā)病率逐年增高的嚴(yán)峻問(wèn)題，根據(jù)最新報(bào)道，按照中國(guó)人的BMI 分 級(jí)（BMI≥24 kg/m2），我 國(guó) 目 前 已 有34.8%的人超重，14.1%的人肥胖[3]。而我國(guó)上市的關(guān)于肥胖的治療藥物卻屈指可數(shù)，自2007 年脂肪酶抑制劑奧利司他獲批以來(lái)，只有胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑利拉魯肽和貝納魯肽于2023 年7 月獲批超重（肥胖）適應(yīng)證[4]。但這兩類藥物仍存在各自的弊端：奧利司他因嚴(yán)重脂肪瀉導(dǎo)致部分患者不耐受，且因減肥效果有限而不被推薦用于合并并發(fā)癥的肥胖治療[5]；利拉魯肽和貝納魯肽減肥效果優(yōu)異[6]，但需注射給藥且價(jià)格昂貴，近期還有報(bào)道稱此類藥物胃腸道不良反應(yīng)遠(yuǎn)比其公布的要嚴(yán)重[7]，并有可能增加腸梗阻風(fēng)險(xiǎn)，甚至使少數(shù)使用者產(chǎn)生自殺念頭[8]。因此，研發(fā)可有效治療肥胖且不良反應(yīng)小的藥物對(duì)治療肥胖、減少并發(fā)癥具有重要的意義。

研究人員前期發(fā)現(xiàn)，脂肪因子血清類粘蛋白（ORM）可作用于下丘腦瘦素受體，抑制攝食并調(diào)控能量平衡[9]，是潛在的減重藥物研發(fā)靶點(diǎn)（專利號(hào)：ZL201510230870.2）。但ORM 為高度糖基化的大分子蛋白質(zhì)，制備困難且需注射給藥，限制了其藥物開(kāi)發(fā)前景。研究人員前期篩選到一個(gè)全新小分子化合物HMS-01，該化合物由大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥紅霉素改造而來(lái)，為一種未上市的在研新藥，可顯著升高ORM 并降低肥胖小鼠體質(zhì)量，且具有可經(jīng)消化道用藥、無(wú)抗菌活性的特征，有望為藥物治療肥胖開(kāi)辟新賽道。

根據(jù)創(chuàng)新藥物臨床前研究的國(guó)際國(guó)內(nèi)指導(dǎo)原則[10-11]，新藥上市前需通過(guò)藥效學(xué)和毒理學(xué)研究評(píng)估藥物的有效性和安全性，其中，遺傳毒性研究是毒理學(xué)研究的重要部分。遺傳毒性是指化合物能直接或間接損傷生物體遺傳物質(zhì)，造成基因改變或突變，危及生物體及其后代健康。近年來(lái)，因具有致突變性而引起的藥品召回事件時(shí)有發(fā)生[9]。本研究通過(guò)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames 試驗(yàn)）對(duì)該化合物的遺傳毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，以期為創(chuàng)新藥物的遺傳安全性及其臨床前毒理學(xué)評(píng)估提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試樣品及對(duì)照品

受試樣品：HMS-0（西安秦申嘉合藥物研究有限公司，批號(hào)20190127，純度98%）。陰性對(duì)照品：二甲基亞砜（DMSO，Sigma-aldrich，CAS:67-68-5）。陽(yáng)性對(duì)照品：吖啶誘變劑ICR-191（Sigma-aldrich，CAS：17070-45-0）、2-硝基芴（Sigma-aldrich，CAS：607-57-8）、疊氮鈉（Sigma-aldrich，CAS：26628-22-8）、甲基磺酸甲酯（Sigma-aldrich，CAS：66-27-3）、2-氨基蒽（Sigma-aldrich，CAS：613-13-8）。

1.2 主要試劑及配制方法

營(yíng)養(yǎng)肉湯（賽默飛，CM0067）；磷酸鹽緩沖液（生工生物）；頂層瓊脂培養(yǎng)基（Solarbio，貨號(hào)：LA3080） ；底層培養(yǎng)基（Solarbio，貨號(hào)：3090）；S9混合液溶劑（按照180 ml 試驗(yàn)用量配制）：氯化鉀（生工生物，CAS：7447-40-7）6.6 mmol、氯化鎂（生工生物，CAS：7791-18-6）1.6 mmol、葡糖-6-磷酸（Sigmaaldrich，CAS：3671-99-6）1 mmol、輔酶Ⅱ（Sigmaaldrich，CAS：24292-60-2）0.8 mmol、0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（20×PBS 緩沖液，Solarbio，貨號(hào)：P1032）120 ml、去離子水定容至180 ml；S9混合液： 代謝活化系統(tǒng)S9是經(jīng)苯巴比妥/β-萘黃酮誘導(dǎo)的雄性SD 大鼠肝勻漿上清液制備而成，購(gòu)自Molecular Toxicology，使用前與S9溶劑按照1∶9（V/V）的比例配制。

1.3 主要儀器設(shè)備

全自動(dòng) Ames 實(shí)驗(yàn)儀（北京慧榮和科技有限公司，型號(hào)：HRH-AMES116）；全自動(dòng)菌落分析儀（杭州澤析生物科技有限公司，型號(hào)：DTS3）；倒置顯微鏡[徠卡貿(mào)易（上海）有限公司，型號(hào)：Leica DMi8 M/C/A]。

1.4 試驗(yàn)菌株

此次試驗(yàn)所使用的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535，購(gòu)自Molecular Toxicology 公司，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2 方法

根據(jù)毒理學(xué)研究的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，設(shè)計(jì)制定Ames 試驗(yàn)以檢測(cè)受試藥物HMS-01 的遺傳毒性。Ames 試驗(yàn)亦稱細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)，是利用傷寒沙門氏菌具有回復(fù)突變的特性，以鑒定受試物是否具有致突變性的一種試驗(yàn)方法。his-鼠傷寒沙門氏菌，因不能自主合成組氨酸而不能在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在外界致突變因素的作用下可突變?yōu)槟茏灾骱铣山M氨酸的原養(yǎng)型沙門氏菌，從而能在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。因此，可通過(guò)觀測(cè)其經(jīng)受試物作用后，在無(wú)組氨酸培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況來(lái)判定受試物是否具有致突變毒性。

試驗(yàn)結(jié)果要求應(yīng)滿足以下條件：①陰性對(duì)照組的回復(fù)突變菌落均數(shù)在歷史陰性/溶媒對(duì)照范圍內(nèi)；②陽(yáng)性對(duì)照組的回復(fù)突變菌落均數(shù)為其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組的3 倍以上；③污染平皿數(shù)不超過(guò)平皿總數(shù)的5%。

2.1 試驗(yàn)菌鑒定及擴(kuò)增培養(yǎng)

5 種試驗(yàn)菌（TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535）應(yīng)具備表1 所示的特性，因此于實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行如下生物學(xué)特性鑒定 ：his-鑒定、脂多糖屏障缺陷（rfa 突變）鑒定、氨芐青霉素抗性（菌株R 因子缺失）鑒定、紫外線敏感性（ΔuvrB 突變）鑒定、四環(huán)素（pAQ1）抗性的鑒定、自發(fā)回變菌落數(shù)（his+）測(cè)定 、對(duì)陽(yáng)性誘變劑的回變敏感性測(cè)定，以確定試驗(yàn)菌株符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 各試驗(yàn)菌株生物學(xué)特性

取鑒定合格試驗(yàn)菌分別接種于裝有7 ml 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，于（35±2） ℃、（120±25） r/min條件下在空氣恒溫震蕩器中擴(kuò)增培養(yǎng)16～18 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液光密度并估算活菌濃度，待濃度達(dá)1×109個(gè)/ml 以上時(shí)可用于試驗(yàn)。

2.2 試驗(yàn)分組

設(shè)置6 個(gè)HMS-01 實(shí)驗(yàn)組，最高劑量為HMS-01 5 000 μg/皿，其下等比稀釋設(shè)置5 個(gè)劑量組分別為1 666.7、555.6、185.2、61.7、20.6 μg/皿。除此之外，另設(shè)置空白對(duì)照組及各菌對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照組，分組情況見(jiàn)表2。

表2 各試驗(yàn)菌對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性誘變劑及劑量

2.3 平板滲入法

用全自動(dòng)Ames 實(shí)驗(yàn)儀進(jìn)行試驗(yàn)，即2 ml 融溶狀態(tài)下的頂層瓊脂培養(yǎng)基與下列物質(zhì)混合：0.5 ml S9混合液或0.5 ml 磷酸鹽緩沖液、0.1 ml 對(duì)應(yīng)受試藥品、0.1 ml 擴(kuò)增菌液，迅速混勻，室溫靜置，待平皿凝固后倒置于（37±1） ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h。各組共設(shè)置3 個(gè)平行皿，重復(fù)試驗(yàn)1 次。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果觀察及判定

培養(yǎng)結(jié)束后肉眼或顯微鏡下觀察各皿的受試藥品是否有析出以及背景菌斑的生長(zhǎng)情況，并計(jì)數(shù)各平行皿的回變菌落數(shù)。每個(gè)組分別求均值，并將結(jié)果以（±s） 的方式列出，各組平行數(shù)表示為n。

根據(jù)中國(guó)食品藥品檢定研究院發(fā)布的《細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》制定的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于TA97a、TA98、TA100 及TA102，其誘導(dǎo)的回復(fù)突變菌落均數(shù)大于各自陰性對(duì)照組的2 倍，且具有濃度依賴性及可重現(xiàn)性，即可判定為陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)于TA1535，其誘導(dǎo)的回復(fù)突變菌落均數(shù)高出各自陰性對(duì)照組的3 倍，且具有濃度依賴性及可重現(xiàn)性，結(jié)果可判定為陽(yáng)性。受試藥品在加S9或不加S9混合液的條件下，經(jīng)上述5 種試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有1 種試驗(yàn)菌株為陽(yáng)性，即可認(rèn)定該受試藥品的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性，反之則判斷為陰性。

3 結(jié)果

3.1 受試樣品析出及背景菌斑生長(zhǎng)情況

受試藥品HMS-01 在有S9處理?xiàng)l件下的TA97a和TA1535 菌株實(shí)驗(yàn)中，1 666.7 和5 000 μg/皿濃度組有觀察到鏡下非干擾沉淀，其余所有處理?xiàng)l件均未觀察到供試品沉淀，結(jié)果見(jiàn)表3。所有試驗(yàn)組均未觀察到背景菌斑抑制現(xiàn)象。

表3 HMS-01 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3)

3.2 回復(fù)突變菌落數(shù)

受試藥品HMS-01 在所有處理?xiàng)l件下的回復(fù)突變菌落平均數(shù)均小于各自陰性對(duì)照組的2 倍，且無(wú)濃度依賴性升高，結(jié)果見(jiàn)表4。本次試驗(yàn)條件中，在有（或無(wú)）代謝活化條件時(shí)，受試品HMS-01對(duì)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（his-）鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535 均無(wú)潛在致突變性。

表4 HMS-01 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3)

4 討論

遺傳毒性因其對(duì)生物體及其后代影響巨大，一直是新藥臨床前毒理學(xué)評(píng)價(jià)的重要組成部分。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)B·N·Ames教授于1975 年建立并經(jīng)后來(lái)者的不斷發(fā)展完善，也稱為Ames 試驗(yàn)，現(xiàn)今已成為全球基因毒性測(cè)試中的最為公認(rèn)的方法之一，通常作為體外毒理學(xué)測(cè)試的第1 步，被廣泛應(yīng)用于藥物致突變性的初篩檢驗(yàn)。該試驗(yàn)以his-的沙門氏菌為指示生物，試驗(yàn)中包含了加與不加代謝活化系統(tǒng)，通過(guò)該菌特定的生物效應(yīng)能檢測(cè)基因突變，對(duì)受試物的遺傳毒性進(jìn)行分析。本研究利用細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)對(duì)受試藥物HMS-01 遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，HMS-01 在有（或無(wú)）代謝活化條件下，均無(wú)致突變性，未發(fā)現(xiàn)其具有遺傳毒性。該結(jié)果將為HMS-01 的后續(xù)新藥研發(fā)提供有力支撐。