陸地棉GhRTE基因家族的鑒定與耐鹽性分析

徐凱祥 焦玚 王帥帥 陳全家 鄭凱

摘要：RTE（reversion-to-ethylene）是一種植物乙烯響應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育并在非生物脅迫的逆境中起著重要作用。通過(guò)對(duì)陸地棉（Gossypium hirsutum）RTE家族成員的鑒定及其在鹽脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行解析，為進(jìn)一步探索棉花RTE家族成員的功能提供一定的研究指導(dǎo)。通過(guò)棉花全基因組數(shù)據(jù)，鑒定棉花RTE家族成員，以陸地棉為主要研究對(duì)象，結(jié)合海島棉（Gossypium barbadense）、亞洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）等植物的RTE基因家族成員進(jìn)行物種內(nèi)的進(jìn)化分析。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，研究陸地棉RTE家族基因的表達(dá)量及其對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答規(guī)律。結(jié)果表明，棉花RTE蛋白家族共鑒定出24個(gè)RTE基因，其中來(lái)自陸地棉和海島棉的各有8個(gè)，有4個(gè)來(lái)自雷蒙德氏棉，4個(gè)來(lái)自亞洲棉。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將24個(gè)RTE基因分成3個(gè)亞族，GhRTE基因同一亞族成員間具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序。GhRTE啟動(dòng)子區(qū)包含了許多與植物激素反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答密切相關(guān)的順式調(diào)控因子。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析以及熒光定量分析，初步驗(yàn)證該家族GhRTE6基因可能在棉花生長(zhǎng)發(fā)育以及鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，可為闡明GhRTE基因耐鹽的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：陸地棉；RTE基因家族；非生物脅迫；表達(dá)特性分析；耐鹽性

中圖分類號(hào)：S562.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）06-0052-09

收稿日期：2023-05-29

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（編號(hào)：2022A03004-2）。

作者簡(jiǎn)介：徐凱祥（1995—），男，甘肅蘭州人，碩士研究生，研究方向?yàn)槊藁望}性。E-mail：965762115@qq.com。

通信作者：陳全家，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事棉花遺傳育種研究，E-mail：chenqjia@126.com；鄭凱，博士，副教授，從事棉花種質(zhì)資源優(yōu)異基因挖掘和分子育種研究，E-mail：zhengkai555@126.com。

乙烯是人類迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種植物氣體激素，它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的作用。乙烯與受體結(jié)合后，可觀察到對(duì)種子萌發(fā)、干細(xì)胞分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)和分化、根毛生長(zhǎng)、幼苗、性別決定、果實(shí)成熟、果實(shí)衰老、果實(shí)脫落以及對(duì)鹽、干旱、洪水、低溫脅迫等方面的各種反應(yīng)及影響^[1]。RTE是植物乙烯反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育并在非生物脅迫的逆境中起著重要作用。RTE基因在高等真核生物中廣泛表達(dá)，而在低等真核生物和原核生物中不表達(dá)。前人通過(guò)遺傳學(xué)分析及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)擬南芥中RTE的功能進(jìn)行了進(jìn)一步研究，結(jié)果表明，RTE基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了乙烯的抗性；然而，當(dāng)乙烯受體ETR（ethylene-response）基因被敲除，該基因過(guò)表達(dá)后，植株就會(huì)喪失對(duì)乙烯的抗性，這表明乙烯受體與RTE之間存在著緊密的相互作用。通過(guò)構(gòu)建RTE和受體功能缺失的多突變體，發(fā)現(xiàn)RTE可能在乙烯信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)控作用，并且RTE可能對(duì)ETR起正調(diào)控作用^[2]。然而在陸地棉中，關(guān)于棉花RTE基因家族成員相關(guān)的生物信息及功能特性鮮有報(bào)道。

棉花是一種重要的纖維作物，也是一種以商業(yè)規(guī)模將纖維轉(zhuǎn)化為織物的經(jīng)濟(jì)作物^[3]。鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響貫穿于植物個(gè)體發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，但幼苗期被認(rèn)為是最脆弱的時(shí)期之一^[4-5]。此外，雖然棉花被認(rèn)為是中等耐鹽的，臨界值為7.7 dS/m，但其生長(zhǎng)在苗期受到嚴(yán)重影響，從而降低了產(chǎn)量^[6]。新疆是我國(guó)最大的棉產(chǎn)地，2022年，新疆棉花產(chǎn)量539.1 萬(wàn)t，占全國(guó)總量的90.2%，比2021年增加26.2 萬(wàn)t，增長(zhǎng)5.1%^[7]，新疆棉花生產(chǎn)能夠直接影響我國(guó)的棉花生產(chǎn)。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆鹽堿土地面積約占我國(guó)鹽堿土地總面積的22.01%，達(dá)到 2 181.4 萬(wàn)hm²。在新疆地區(qū)407 萬(wàn)hm²耕地中，受鹽漬化影響的耕地達(dá)122.88 萬(wàn)hm²，極大程度影響了棉花的種植^[8-9]。提高棉花的耐鹽性是改善土壤鹽堿化的必要方法。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料

本研究所用陸地棉耐鹽材料CQJ-5和敏鹽材料新陸早49號(hào)（XLZ-49）均由新疆作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供^[10-11]。將形狀飽滿的棉種播種于裝滿蛭石與花土體積比1 ∶1混合的營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽放入3～4粒種子，于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為 25 ℃，光、暗周期為12 h光照、12 h黑暗。待長(zhǎng)到3葉1心期，選取真葉生長(zhǎng)一致的幼苗，展開(kāi)鹽脅迫處理，將幼苗根系浸入150 mmol/L NaCl溶液中，分別于0 、3 、6 、12 、24、48 h后，取棉花幼苗的根、莖、葉部用于分析GhRTE6基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)水平。以上樣品選取后迅速用液氮冷凍，貯藏于 -80 ℃ 冰箱備用^[12]。

1.2? 棉花RTE家族基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

本試驗(yàn)首先從CottonGen數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cottongen.org/）中獲取棉花的全基因組和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，并下載GFF3注釋文件^[13]。以從NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的RTE蛋白保守結(jié)構(gòu)域（PF05608）為切入點(diǎn)，借助于隱馬爾可夫模型，并基于Hmmsearch搜索結(jié)果，通過(guò)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，獲取棉花全基因組RTE蛋白質(zhì)的序列信息，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)而對(duì)已知的RTE蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析。通過(guò)ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam在線工具，分析棉花RTE基因編碼的蛋白質(zhì)序列的分子量（MW）、等電點(diǎn)（pI）等物理化學(xué)性質(zhì)，并通過(guò)WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位^[14-15]。

1.3? 進(jìn)化樹(shù)、同源性分析

采用MEGA-X軟件對(duì)陸地棉、海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉等棉花品種的RTE蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并建立進(jìn)化樹(shù)^[16]。用名為Evolview v3的在線網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行美化^[17]。根據(jù)棉花的基因組和染色體數(shù)據(jù)庫(kù)CottonFGD，利用TBtools軟件顯示出RTE蛋白家族成員在棉花染色體上的同源性^[18]。通過(guò)CottonGen數(shù)據(jù)庫(kù)、BLAST軟件、TBtools軟件和MCScanX等工具，對(duì)在陸地棉內(nèi)部A、D基因亞組之間以及四大棉種之間的RTE蛋白家族同源性，進(jìn)行了比對(duì)和共線性分析，并通過(guò)TBtools進(jìn)行可視化分析后用Adobe Illustrator CS6進(jìn)行美化修飾^[19-22]。

1.4? 染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

借助TBtools軟件將GhRTE基因染色體的定位信息從已下載的GFF3注釋文件中提取出來(lái)，之后進(jìn)行可視化。利用MEME程序分析RTE家族成員的Motif基序（最大發(fā)現(xiàn)數(shù)設(shè)置為15）^[23]，并使用TBtools軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析。

1.5? 順式作用元件預(yù)測(cè)

利用TBtools軟件，從已下載的基因組文件中提取陸地棉RTE基因起始密碼子上游2 000 bp序列，將這些序列視為啟動(dòng)子區(qū)，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)其進(jìn)行分析，以此來(lái)預(yù)測(cè)GhRTE基因上游啟動(dòng)子區(qū)可能存在的順式作用元件^[15，24]。

1.6? 陸地棉RTE基因RNA-seq表達(dá)模式分析

從NCBI SRA網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載陸地棉各器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托）和非生物脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（基因組測(cè)序計(jì)劃編號(hào)為PRJNA248163）。參考基因組文件TM-1_genome_ZJU_v2.1，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組標(biāo)準(zhǔn)分析，獲得表達(dá)數(shù)據(jù)^[25-26]。表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為lg（TPM+1），通過(guò)TBtools軟件繪制表達(dá)量圖。本研究的基因結(jié)構(gòu)圖、順式作用元素圖和熱圖均由TBtools軟件完成，然后用Adobe Illustrator CS6進(jìn)行美化和調(diào)整。

1.7? RNA提取及qRT-PCR分析

利用CottonFGD數(shù)據(jù)庫(kù)下載陸地棉RTE基因編碼序列（CDS）信息，利用DNAMan （Lynnon Corporation，Canada）軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因特異性熒光定量引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書，使用RNAprep Pure多糖多酚的總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]從幼苗中提取總RNA，并使用abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成，以獲得第1條cDNA。通常選擇棉花Ubiquitin7（UBQ7）作為內(nèi)參基因，利用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀，對(duì)在不同部位各個(gè)脅迫處理時(shí)期的RTE基因進(jìn)行 qRT-PCR擴(kuò)增（3次技術(shù)重復(fù)），相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量分析采用2^－ΔΔC_T法^[27]。最后選擇GraphPad Prism version 9.0.0 for Windows對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，完成后用Adobe Illustrator CS6進(jìn)行美化調(diào)整。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 棉花RTE基因的鑒定和分析

通過(guò)本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)棉花RTE蛋白家族進(jìn)行篩選驗(yàn)證，共鑒定出24個(gè)RTE基因，其中陸地棉和海島棉均包含8個(gè)基因，雷蒙德氏棉4個(gè)、亞洲棉4個(gè)（表1）。如表1所示，陸地棉RTE基因編碼區(qū)長(zhǎng)度范圍為684～762 bp，氨基酸長(zhǎng)度范圍在227～253 aa之間，基因編碼的蛋白質(zhì)分子量范圍為25.84～28.62 ku，等電點(diǎn)（pI）介于5.86～7.09之間；海島棉RTE基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為 468～762 bp，氨基酸長(zhǎng)度在155～253 aa之間，基因編碼的蛋白質(zhì)分子量范圍為17.92～28.64 ku，等電點(diǎn)介于4.99～7.09之間；雷蒙德氏棉RTE基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為588～762 bp，氨基酸長(zhǎng)度在195～253 aa 之間，基因編碼的蛋白質(zhì)分子量范圍為22.38～28.57 ku，等電點(diǎn)介于4.94～7.09之間；亞洲棉RTE基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為684～762 bp，氨基酸長(zhǎng)度在227～253 aa之間，基因編碼的蛋白質(zhì)分子量范圍 25.83～28.54 ku，等電點(diǎn)介于5.27～7.01之間。預(yù)測(cè)亞細(xì)胞的定位結(jié)果顯示，棉花中的24個(gè)RTE編碼蛋白基本都位于細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)膜中。RTE基因家族成員的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位結(jié)果大致相同，這也預(yù)示該基因家族在棉花生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)傳遞過(guò)程中扮演著重要角色。

2.2? 棉花RTE基因染色體定位與命名

將棉花RTE基因進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)定位分析，結(jié)果如圖1所示，4個(gè)棉花品種RTE基因在染色體上呈不均勻分布。陸地棉和海島棉的A01、A02、A03、A04、A05、A06、A09、A12、A13、D01、D02、D03、D04、D05、D06、D09、D12、D13染色體均無(wú)RTE基因分布，A07、A08、A10、A11、D07、D08、D10和D11染色體各有1個(gè)基因分布。亞洲棉中Chr07、Chr08、Chr10和Chr11染色體各有1個(gè)基因分布，其他染色體上均無(wú)RTE基因。雷蒙德氏棉中Chr01、Chr04、Chr07和Chr11染色體各有1個(gè)基因，其他染色體上均無(wú)RTE基因。陸地棉所含的RTE基因分布于8條不同的染色體上，其中A亞組染色體上有4個(gè)，D亞組染色體上有4個(gè)，海島棉與之相同。雷蒙德氏棉4個(gè)RTE基因分布于4條不同的染色體上，亞洲棉與之相同。說(shuō)明該基因家族在進(jìn)化過(guò)程中比較穩(wěn)定。之后根據(jù)基因在染色體上的排列位置，將它們命名為GhRTE1～GhRTE8、GbRTE1～GbRTE8、GaRTE1～GaRTE4、GrRTE1～GrRTE4。

2.3? 棉花RTE基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用鄰接法對(duì)棉花RTE基因進(jìn)行聚類，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖2可以看出，24個(gè)RTE基因可以被劃分為3個(gè)亞族，分別用Group1、Group2和Group3表示。Group1成員最多有12個(gè)，其中陸地棉和海島棉均有4個(gè)，雷蒙德氏棉和亞洲棉均有2個(gè)。其次，Group2和Group3成員個(gè)數(shù)相同，均為6個(gè)，Group2中陸地棉和海島棉成員均有2個(gè)，雷蒙德氏棉和亞洲棉成員均有1個(gè)。Group3中陸地棉和海島棉成員均有2個(gè)，雷蒙德氏棉和亞洲棉均有1個(gè)。結(jié)合圖1可以發(fā)現(xiàn)，陸地棉和海島棉在染色體相同位置上的RTE基因都緊密地聚集在了同一個(gè)亞族中，另外，每一個(gè)亞族中，與雷蒙德氏棉、亞洲棉相比，陸地棉、海島棉所含的基因數(shù)量均是它們的2倍，這與棉屬的演化規(guī)律相吻合。

2.4? 陸地棉RTE基因同源性分析

同源是指在演化過(guò)程中具有相同祖先血統(tǒng)的支系間的演化關(guān)系。在不同的物種中，源自于同一個(gè)祖先的基因被叫作直系同源基因，而在相同的物種中，因?yàn)榛驈?fù)制而分離出來(lái)的同源基因就是旁系同源基因^[28]。為了解棉花RTE基因家族的同源進(jìn)化關(guān)系，對(duì)陸地棉、海島棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉進(jìn)行分析，同時(shí)也可以了解到8個(gè)GhRTE在二倍體棉和四倍體棉中的進(jìn)化聯(lián)系。陸地棉各染色體之間有4對(duì)直系同源基因，A亞組和D亞組出現(xiàn)了加倍復(fù)制，并且不同亞組之間有更緊密的進(jìn)化關(guān)系（圖3）。陸地棉與亞洲棉之間有12對(duì)直系同源基因，與雷蒙德氏棉之間有12對(duì)直系同源基因，與海島棉之間有8對(duì)直系同源基因（圖4），說(shuō)明彼此之間具有極密切的進(jìn)化關(guān)系，且這些基因在不同棉花中可能具有相同的功能。

2.5? 陸地棉RTE蛋白保守基序及對(duì)應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)分析

本研究分析了陸地棉中8個(gè)RTE蛋白的序列特征，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域保守程度較高，將從RTE蛋白序列中找到的12個(gè)保守基序依次命名為Motif1～Motif12，8個(gè)GhRTE蛋白均含有Motif1～Motif7和Motif9（圖5-A）。Motif11基序只存在于GhRTE1與GhRTE5中。Motif10基序只存在于GhRTE2與GhRTE6中。Motif12基序只存在于GhRTE3與GhRTE7中。而GhRTE1、GhRTE5、GhRTE2和GhRTE6中均含有Motif8基序。GhRTE家族8個(gè)基因均有2個(gè)外顯子（圖5-B）。從基因長(zhǎng)度方面來(lái)看，具有不同長(zhǎng)度的基因，其編碼序列是相似的。這表明，在進(jìn)化的過(guò)程中，RTE基因的內(nèi)含子長(zhǎng)度

發(fā)生了較大的改變，這就有可能導(dǎo)致不同的功能。

2.6? 陸地棉RTE基因家族的啟動(dòng)子分析

對(duì)陸地棉啟動(dòng)子的順式元件進(jìn)行分析，可為研究基因的組織特異性或應(yīng)激性表達(dá)模式提供思路和幫助。由圖6可知，在8個(gè)陸地棉RTE基因中鑒定到的順式作用元件中，有41個(gè)與激素有關(guān)，例如水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element，SARE）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif，TATC-box，P-box）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element，AuxRR-core）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件（TGACG-motif，CGTCA-motif）等^[29]。此外，還發(fā)現(xiàn)了20個(gè)逆境應(yīng)答元件，如低溫反應(yīng)響應(yīng)元件（LTR）、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS），以及1個(gè)類黃酮合成響應(yīng)元件（MBSI）。8個(gè)GhRTE基因含有4～10個(gè)不同的順式作用元件，其中以脫落酸和茉莉酸酯相關(guān)的順式作用元件的含量最高。據(jù)研究，脫落酸與植株抗逆性顯著相關(guān)，茉莉酸甲酯與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆性相關(guān)。其中GhRTE1、GhRTE4和GhRTE5基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順式元件數(shù)量為3個(gè)，GhRTE6和GhRTE8基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順式元件數(shù)量為4個(gè)。說(shuō)明陸地棉RTE基因家族可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及在非生物脅迫逆境中發(fā)揮著較強(qiáng)作用。

2.7? 陸地棉RTE基因家族的表達(dá)分析

為了明確RTE家族基因在陸地棉中的組織表達(dá)特異性，以及它們對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)規(guī)律，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，借助TBtools軟件對(duì)8個(gè)GhRTE基因在棉花根、莖、葉、花瓣、花托、花萼等組織進(jìn)行了特異性表達(dá)分析。在正常的生長(zhǎng)環(huán)境下，這些基因在陸地棉的不同部位表現(xiàn)出了不同的表達(dá)模式：GhRTE1、GhRTE2、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因在不同組織中的表達(dá)有很大的差異，并且它們的表達(dá)量比較高，而其他基因的表達(dá)量則比較低，甚至不表達(dá)，暗示這些基因可能在陸地棉的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用（圖7-A）。同時(shí)分析在不同時(shí)期鹽脅迫下的陸地棉RTE家族基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6在鹽脅迫下的各個(gè)時(shí)間階段中表現(xiàn)出高表達(dá)趨勢(shì)（圖7-B），且在花托和花萼這類營(yíng)養(yǎng)器官中的表達(dá)量高于其他組織。由此可推測(cè)出GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6可能在棉花的生長(zhǎng)發(fā)育階段以及在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2.8? qRT-PCR分析

通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)順式作用元件（圖6）以及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)（圖7）分析結(jié)果，選取鹽脅迫下表達(dá)變化明顯且抗逆性相關(guān)順式作用元件交集最多的GhRTE基因，最終挑選GhRTE6基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。分別對(duì)耐鹽棉花材料CQJ-5以及敏鹽材料新陸早49號(hào)進(jìn)行72 h鹽脅迫處理（圖8）。根據(jù)GhRTE6基因序列設(shè)計(jì)引物（表2）并利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，耐鹽材料CQJ-5經(jīng)鹽脅迫處理 12 h 后，GhRTE6基因在莖部的表達(dá)量較高，而在葉片和根部的表達(dá)量則相對(duì)較低；敏鹽材料新陸早49在脅迫后24 h時(shí)，在莖中表達(dá)水平較高，而在根和葉中表達(dá)水平相對(duì)較低（圖9）。從總體觀察發(fā)現(xiàn)，GhRTE6基因在耐鹽材料中的表達(dá)量高于敏鹽材料。

3? 討論與結(jié)論

RTE基因在多種植物中的功能分析已見(jiàn)報(bào)道，但關(guān)于RTE基因家族分析研究卻極少，在棉花中從未有過(guò)基因家族鑒定及功能分析。本研究鑒定出陸地棉8個(gè)、海島棉8個(gè)、雷蒙德氏棉4個(gè)和亞洲棉4個(gè)，共24個(gè)棉花RTE家族成員，進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系解析將其分為3個(gè)亞族，每個(gè)亞族中的陸地棉和海島棉在染色體相同位置上的RTE基因都緊密地聚集在了一起，而且每個(gè)亞組中陸地棉和海島棉的基因數(shù)量都是雷蒙德氏棉和亞洲棉的2倍左右，符合棉花物種的進(jìn)化關(guān)系。本研究中棉花RTE基因家族成員編碼的蛋白通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)多數(shù)位于質(zhì)膜上，少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，這與前人的研究結(jié)果^[2]較為一致。

前人的研究表明，RTE家族包括2個(gè)類群：RTE1組和RTH（RTE1-homolog）組^{[23，30-32]}。RTE1可以正調(diào)控乙烯受體ETR1，并通過(guò)ETR1的N端跨膜域?qū)σ蚁┬盘?hào)進(jìn)行調(diào)控，番茄中的GR（green-ripe）和GRL1（green-ripe like 1）是擬南芥中的AtRTE1的同源基因，對(duì)RTE1/GR/GRL1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，可以提高乙烯受體活性，進(jìn)而降低植株對(duì)乙烯的敏感性^[31-33]。擬南芥中的AtRTE1也可以結(jié)合生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)基因（ARGOS）參與調(diào)控器官大小，它的保守的TPT區(qū)使其對(duì)乙烯的敏感性下降^[33-34]，ARGOS基因的過(guò)表達(dá)能夠提高擬南芥和玉米的耐旱性。本研究通過(guò)順式作用元件預(yù)測(cè)得出陸地棉RTE基因家族啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育激素以及逆境響應(yīng)調(diào)控元件，其中GhRTE1、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順勢(shì)元件數(shù)量最多，且GhRTE1、GhRTE4和GhRTE5基因含有抵御脅迫相關(guān)的順式作用元件，說(shuō)明RTE基因家族可能也參與了棉花的生長(zhǎng)發(fā)育并調(diào)控其他酶類合成以應(yīng)對(duì)逆境脅迫。

對(duì)RTE家族中不同組織及逆境條件下不同基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，GhRTE1、GhRTE2、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因的表達(dá)量明顯高于其他基因，表明它們?cè)诿藁ㄉL(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。同時(shí)分析在不同時(shí)期鹽脅迫下的陸地棉RTE家族基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6在不同的鹽分脅迫時(shí)期表現(xiàn)出了較高的表達(dá)趨勢(shì)，在12～48 h之間表達(dá)量較高，其余基因受非生物脅迫后表達(dá)量低甚至不表達(dá)。GhRTE6基因在棉花受到鹽脅迫處理下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在不同的陸地棉材料中做出了顯著性應(yīng)答。在耐鹽材料中，GhRTE6基因在脅迫12 h后表達(dá)量較高，而在敏鹽材料中GhRTE6在脅迫24 h后表達(dá)量較高，且都在莖中高表達(dá)，這說(shuō)明GhRTE6在敏鹽材料中對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)比耐鹽材料中慢，證明GhRTE6對(duì)鹽脅迫具有一定的調(diào)控作用。由此可推測(cè)出GhRTE6可作為棉花響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵基因進(jìn)一步研究其功能特性。

本研究從陸地棉、海島棉、雷蒙德氏棉以及亞洲棉等4個(gè)棉花品種中，發(fā)現(xiàn)了24個(gè)RTE基因家族成員，并在進(jìn)化樹(shù)上將它們劃分為3個(gè)亞族，依據(jù)同源性關(guān)系可推斷出陸地棉與海島棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)同族成員中個(gè)別基因保守基序不同且相似長(zhǎng)度基因其外顯子的數(shù)量和長(zhǎng)度也有所不同，故其功能可能存在一定的差異。通過(guò)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉RTE基因啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育激素和逆境響應(yīng)元件，說(shuō)明其可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抵御非生物脅迫逆境中發(fā)揮著較大作用。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉RTE基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)量存在差異，并且qRT-PCR結(jié)果證明GhRTE6對(duì)鹽脅迫具有一定的調(diào)控作用。本研究結(jié)果可為今后探索棉花RTE基因的功能及分子機(jī)制提供參考。

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