魯北地區(qū)慢性失眠人群腸道菌群特征分析

李東陽， 白 玉， 郭 澳， 馬文彬

腸道菌群（intestinal flora）是在人類胃腸道中與宿主存在共生關(guān)系的細(xì)菌和其他微生物［1］，其參與機(jī)體的生理和病理調(diào)節(jié)，在人體免疫系統(tǒng)和代謝中發(fā)揮著重要作用。腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以通過腸-腦軸起到雙向調(diào)節(jié)作用［2］。慢性失眠的主要臨床表現(xiàn)為入睡困難、睡眠時(shí)間減少、睡眠中頻繁覺醒等，并且隨年齡的增加逐漸加重［3］。失眠的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，近年來有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在睡眠調(diào)節(jié)中扮演著重要角色［4］，腸道菌群可以通過腸-腦軸的免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和迷走神經(jīng)通路影響中樞神經(jīng)的各項(xiàng)功能［5］，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的睡眠過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。迄今為止，慢性失眠與腸道菌群之間關(guān)系仍需要進(jìn)一步探索。本研究結(jié)合16S rDNA擴(kuò)增子測序和生物信息學(xué)分析，首次檢測魯北地區(qū)健康參與者和失眠患者之間腸道微生物群的相關(guān)性和差異性，擬在探討失眠患者的腸道分類群組成的差異和潛在關(guān)系，為腸道菌群在失眠中的臨床應(yīng)用提供新依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 2022年1月—7月就診于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診的慢性失眠患者30 例，患者來自濱州、東營和德州地區(qū)，年齡在18～65 歲之間。健康人群33 例為對(duì)照，志愿者從濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及公眾招募。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：LW-13），在被告知權(quán)利和義務(wù)后，所有參與者都完全理解了實(shí)驗(yàn)的益處和風(fēng)險(xiǎn)，并簽署了知情同意書。所有參與者均符合嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，并由2 名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生進(jìn)行問卷及專科評(píng)估。研究參與者的糞便樣本均在門診就診當(dāng)天用無菌器械采集，然后保存在-80℃的冰箱中準(zhǔn)備16S rDNA 測序。研究參與者還需要完成一份描述人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和生活方式特征的問卷，缺少或無法確認(rèn)的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)（年齡、種族或性別）、BMI 被排除在研究之外。最后，將63 名確認(rèn)2 周內(nèi)未使用抗生素的合格志愿者分為兩組（慢性失眠組和正常對(duì)照組），兩組間BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 16S rDNA 測序 北京諾和致源科技股份有限公司提供糞便樣本擴(kuò)增子測序技術(shù)服務(wù)。利用ZR糞便DNA試劑盒從患者糞便中提取細(xì)菌DNA，用Illumina HiSeq 2500 測序儀的優(yōu)化引物組對(duì)覆蓋16S rDNA基因V3～V4區(qū)的多重?cái)U(kuò)增子文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)測序后的序列進(jìn)行預(yù)處理，產(chǎn)生雙端合并序列，并使用軟件Vsearch（v2.18.0）去除重復(fù)序列，使用軟件Usearch（v11.0.667）降噪算法unoise3 產(chǎn)生ASV，去除嵌合體，使用軟件Vsearch （v2.18.0）進(jìn)行物種注釋，使用的數(shù)據(jù)庫為 RDPv18（細(xì)菌、古菌16s）或UNITE 25.07.2023（真菌ITS），最后使用軟件R（v3.5.2）語言進(jìn)行抽平、統(tǒng)計(jì)和作圖，包括繪制主坐標(biāo)分析（Principal Coordinats Analysis， PCoA）和相關(guān)性熱圖，通過計(jì)算UniFrac 距離來估計(jì)β 多樣性，通過LEfSe分析對(duì)所有分類水平進(jìn)行差異分析，識(shí)別組內(nèi)組間物種豐度差異，來檢測兩組間的差異豐富分類群，統(tǒng)計(jì)抽平后樣本擴(kuò)增子序列變異（ASV），獲得每個(gè)樣本的微生物群落的具體組成，對(duì)兩組在門、綱、目、科、屬水平的物種進(jìn)行可視化處理，并使用R 包“randomForest”進(jìn)行隨機(jī)森林分析。

2 結(jié) 果

2.1 失眠患者較正常人群存在腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能的顯著變化 分別計(jì)算了慢性失眠（IN）組和正常（HC）組ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)，反映了兩組間的α 多樣性，且存在腸道微生物多樣性的改變（見圖1）。此外，基于Bray-Curtis 距離的β 多樣性分析表明，失眠（IN）組和正常（HC）組在空間距離的第一維度上存在顯著的結(jié)構(gòu)差異（見圖2）。通過線性判別分析效應(yīng)大?。↙DA EFfect Size，LEfSe）分析顯示兩組的相對(duì)豐度存在顯著差異，尤其是梭狀芽孢桿菌、厚壁菌門等菌屬（見圖3）?；趐icrust2 功能基因預(yù)測結(jié)果表明，慢性失眠組和正常組的腸道菌群功能相關(guān)基因無顯著區(qū)別。對(duì)測序后物種從門、綱、目、科、屬水平上進(jìn)行了相對(duì)豐度分析，我們發(fā)現(xiàn)在門水平，相對(duì)豐度最高的菌群包括梭桿菌門、擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、疣微菌門等（見圖4）。

圖1 慢性失眠（IN）組和正常對(duì)照（HC）組的α多樣性分析

圖2 基于Bray-Curtis距離的β多樣性分析

圖3 LDA EFfect Size分析

圖4 門水平上物種相對(duì)豐度分析

2.2 通過隨機(jī)森林分析識(shí)別與失眠癥相關(guān)的腸道微生物群 傳統(tǒng)的方法，如LEfSe 分析，通過比較各組之間腸道菌群相對(duì)豐度的差異，鑒定的生物標(biāo)志物建立疾病診斷的預(yù)測模型比較困難。為了改進(jìn)生物標(biāo)志物的識(shí)別，我們采用隨機(jī)森林分析，在考慮最低誤差率加標(biāo)準(zhǔn)偏差的情況下，鑒定最佳的物種生物標(biāo)志物。其中，ASV_17（毛螺菌科）是慢性失眠組和正常分組貢獻(xiàn)最高的ASV（見圖5）。

圖5 隨機(jī)森林分析

3 討 論

健康成年人腸道中的菌群種類和數(shù)量十分龐大，大約包括1 000 多種菌群，細(xì)菌的總數(shù)則超過了100 萬億，腸道菌群主要包括厚壁菌、擬桿菌、放線菌、疣微菌和變形菌等五個(gè)菌門，其中主要為厭氧菌［6］。大量證據(jù)表明，睡眠在保護(hù)人類健康、恢復(fù)身體功能、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)大腦健康等方面均發(fā)揮著十分重要的作用［7］，并可以通過腸-腦軸與腸道菌群建立聯(lián)系。

到目前為止，有關(guān)睡眠不足對(duì)人體腸道微生物群組成的影響的研究并不多見，曾有研究對(duì)大鼠行7 d的睡眠限制后，并未檢測到主要微生物種群的改變［8］。Poroyko等［9］在研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠行4周的睡眠剝奪后可明顯觀察到體內(nèi)腸道微生物群的變化。有證據(jù)表明，隨著睡眠剝奪時(shí)間的不斷延長，人類腸道微生物群的受到的影響程度會(huì)逐漸增強(qiáng)。針對(duì)連續(xù)數(shù)個(gè)晚上保持2 h 以內(nèi)睡眠的實(shí)驗(yàn)會(huì)降低腸道微生物群的豐富度，并且α 多樣性的相對(duì)豐度增大［10］，而在另一項(xiàng)研究中，將睡眠時(shí)間延長到每晚4 h后則對(duì)β多樣性沒有產(chǎn)生影響［11］。

迄今為止，對(duì)于睡眠障礙可以具體改變腸道微生物群的哪些細(xì)菌種類的結(jié)論尚未完全一致［9］。在睡眠中斷的小鼠中，厚壁菌門與擬桿菌門的比例增加［12］，梭狀芽孢桿菌科和毛螺菌科的相對(duì)豐度也發(fā)生相應(yīng)改變［13］，并且毛螺菌科種群數(shù)量的增加或減少還可能和腸道的不同部位有很大關(guān)系［14］。另一方面，一項(xiàng)對(duì)37 名老年人進(jìn)行的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，更好的睡眠質(zhì)量則與疣狀梭菌門比例相關(guān)［15］。本次實(shí)驗(yàn)通過LEfSe 分析（判斷標(biāo)準(zhǔn)LDA 值＞3.0，P＜0.05）觀察到魯北地區(qū)慢性失眠（IN）組中梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等一些菌屬的相對(duì)豐度與正常組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），同時(shí)通過隨機(jī)森林分析發(fā)現(xiàn)，毛螺菌科種群數(shù)量在魯北地區(qū)慢性失眠人群中顯著增加，這些發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一步豐富了失眠對(duì)腸道菌群組成影響的研究。有研究表明睡眠可以影響到腸道菌群的代謝功能，睡眠破碎可能導(dǎo)致產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌的豐度減少，并進(jìn)一步影響丁酸代謝［16］。Christian等［13］在正常體重個(gè)體中進(jìn)行了一項(xiàng)研究，評(píng)估睡眠不足對(duì)人類腸道微生物群的影響，發(fā)現(xiàn)兩天的短期睡眠剝奪可以降低胰島素敏感性，間接影響了人體的糖代謝能力，因此我們可以推測慢性失眠患者和健康人體內(nèi)與衰老、抗藥性、氨基酸代謝等功能基因相關(guān)的菌群種屬相對(duì)豐度或許也存在差異，本次基于picrust2 功能基因預(yù)測結(jié)果并未顯示出慢性失眠組和正常組的腸道菌群功能相關(guān)基因的顯著區(qū)別，可能存在樣本量較小和地區(qū)差異等限制因素。

失眠癥是否直接導(dǎo)致腸道微生物群的微生態(tài)失調(diào)尚不清楚。隨機(jī)森林分析等統(tǒng)計(jì)方法能夠以較高的預(yù)測精度和預(yù)測效率識(shí)別特征生物標(biāo)志物，尤其適用于基于腸道微生物群的疾病預(yù)測和診斷。本研究中隨機(jī)森林模型確定了一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)菌分類群（毛螺菌科），它不僅與臨床數(shù)據(jù)密切相關(guān)，而且在腸道生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，可作為識(shí)別失眠患者的潛在生物標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

本研究中利用前沿的生物信息學(xué)算法，證明了失眠與正常健康之間的差異，反映了魯北地區(qū)失眠人群的微生物群落組成。本研究表明失眠人群存在腸道微生物多樣性的改變，魯北地區(qū)失眠人群存在梭桿菌門、厚壁菌門及擬桿菌門的豐度相對(duì)的改變，而且我們也確定了毛螺菌科作為潛在生物標(biāo)記物的可能性，雖然上述方法僅基于生物信息學(xué)分析，但結(jié)果具有一定的參考價(jià)值，后續(xù)研究可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。這將為利用腸道微生物群的信息開發(fā)新的治療策略，打開新的視角。

倫理學(xué)聲明：本研究方案經(jīng)由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：LW-13），患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李東陽負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架、起草論文；白玉負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、繪制圖表；郭澳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、研究過程的實(shí)施；馬文彬負(fù)責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。