實時熒光PCR法檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌的研究

龐婕 劉杰 孔慶巖 秦森翰 董建鋒

摘 要：近年來，包裝飲用水中銅綠假單胞菌超標的現象時有發(fā)生，運用國家安全標準方法進行檢驗，過程煩瑣，周期較長，不利于監(jiān)管。然而，實時熒光PCR檢驗法具有靈敏、快速、準確等優(yōu)點，被廣泛應用于各種檢驗檢測中。本文采用實時熒光PCR法，利用特異性引物和探針對目標基因進行擴增。然后通過實時熒光PCR法對其他5種細菌和梯度含量的銅綠假單胞菌菌懸液進行檢測，驗證方法的特異性和靈敏度。結果表明，只有銅綠假單胞菌的實時熒光PCR檢測結果為陽性，其他細菌的檢測結果為陰性，說明本方法對銅綠假單胞菌的特異性較好，方法的靈敏度為1×103 CFU·mL-1。同國家安全標準方法相比，實時熒光PCR法所用時間更短，明顯提高了檢測效率。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；實時熒光PCR；包裝飲用水

Abstract： In recent years， the phenomenon of excessive levels of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water has occurred. The use of national safety standard methods for inspection is cumbersome and time-consuming， which is not conducive to supervision. However， the real-time fluorescence PCR detection method has the advantages of sensitivity， speed， and accuracy， and is widely used in various testing methods. In this paper， real-time fluorescent PCR was used to amplify the target gene with specific primers and probes. Then， the other 5 kinds of bacteria and the gradient content of Pseudomonas aeruginosa suspensions were detected by real-time fluorescent PCR to verify the specificity and sensitivity of the method. The results showed that only Pseudomonas aeruginosa was positively detected by real-time fluorescent PCR， while the detection results of other bacteria were negative， indicating that the specificity of this method for Pseudomonas aeruginosa was good， and the sensitivity of this method was 1×103 CFU·mL-1. Compared with the national safety standard method， the real-time fluorescent PCR method takes less time and significantly improves the detection efficiency.

Keywords： Pseudomonas aeruginosa; real-time fluorescent quantitative PCR; packaged drinking water

銅綠假單胞菌，又叫綠膿桿菌，是在自然界中廣泛分布的一種致病菌，可能引起多種感染，包括皮膚、眼睛、肺部和尿路感染等[1]。因此，評價水體中微生物污染狀況的重要指標為是否含有銅綠假單胞菌。

《食品安全國家標準包裝飲用水》（GB 19298—2014）中要求銅綠假單胞菌的檢測方法為《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）。該方法為傳統(tǒng)微生物法，是將水中細菌截留在濾膜后，用滅菌鑷子夾取濾膜，移放在假單胞菌瓊脂平板上培養(yǎng)后，分離純化，再進行確證試驗。全部實驗總時長最短為48 h，最長可達96 h。同時確證試驗包括綠膿菌素試驗、產氨試驗、42 ℃生長試驗、氧化酶試驗和金氏B培養(yǎng)基試驗，整體操作過程較為煩瑣，并且需要消耗大量的人力物力資源，檢測速度慢，工作效率低下。隨著分子生物技術的高速發(fā)展，PCR技術具有快速、簡便、準確的優(yōu)勢，已經在病毒和細菌的快速檢測中得到了廣泛的應用[2]。本研究采用實時熒光PCR法對包裝飲用水中的銅綠假單胞菌進行檢測，同時運用5種常見標準菌株對該方法的特異性、靈敏度、重復性等進行驗證，并將試驗結果同《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）中銅綠假單胞菌的檢測結果進行比較，驗證方法的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設備

標準菌株：銅綠假單胞菌（ATCC27853）、沙門氏菌（ATCC14028）、熒光假單胞菌（ATCC13525）、單增李斯特氏菌（ATCC19111）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923），環(huán)凱生物[3]。

腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒、銅綠假單胞菌核酸檢測試劑盒，廣州雙螺旋基因技術有限公司。

全自動生化鑒定系統(tǒng)（VITEK 2 Compact System），生物梅里埃美國股份有限公司；BIO-RAD（CFX96）實時熒光PCR儀，美國伯樂；BSC-1000IIA2生物安全柜，上海析牛萊伯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準菌株的活化

將銅綠假單胞菌等6種標準菌株按照標準菌種使用說明書進行活化，即將西林瓶表面用75%乙醇擦拭消毒后，在無菌條件下打開西林瓶，加入復蘇液（腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基），制成懸浮液。用生理鹽水對菌懸液進行梯度稀釋，形成梯度含菌量為1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1、1×102 CFU·mL-1和1×10 CFU·mL-1的菌懸液。

1.2.2 模板的提取

用無菌吸管吸取1 mL菌懸液，用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取細菌基因組DNA，渦旋振蕩混勻，100 ℃下加熱5～10 min，所得上清液即為提取的核酸基因組，作為擴增模板。

1.2.3 特異性引物和探針

參照《出口食品中致病菌熒光重組酶介導鏈替換核酸擴增（RAA）檢測方法 第12部分：銅綠假單胞菌》（SN/T 5516.12—2023）[4]，銅綠假單胞菌檢測所用引物和探針如表1所示。

1.2.4 實時熒光PCR擴增

（1）添加模板。實時熒光擴增反應體系為50 μL，其中緩沖液25 μL，上游引物2.0 μL，下游引物2.0 μL，探針1.0 μL，DNA模板5.0 μL，雙蒸水15.0 μL[5]。反應用各種試劑均已分裝于購買的商品化試劑盒中。將試劑盒置于室溫中，等各組分試劑解凍后，用渦旋混勻器混勻，離心30 s，分裝于0.2 mL PCR管中。向分裝好的PCR管中分別加入5 ?L模板，以雙蒸水為空白對照，以目的基因lasB為陽性對照，順序為空白對照、待測樣品模板、陽性對照，離心30 s，立即進行擴增反應。

（2）反應程序。熒光基團選擇Fam，淬滅基團選擇None。去污染：37 ℃，10 min，一個循環(huán)；預變性：95 ℃，1 min，一個循環(huán)；擴增：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s，40個循環(huán)。

1.2.5 結果判斷

Ct值=0或≥40，擴增曲線為一條直線或者輕微斜線，則樣品檢測結果為陰性，即不含有銅綠假單胞菌[6]。Ct值≤36，擴增曲線呈“S”型，則樣品檢測結果為陽性，即含有銅綠假單胞菌。36＜Ct值＜40，需進行一次重復實驗，若Ct值≥40則為陰性，不含有銅綠假單胞菌；否則為陽性，含有銅綠假單胞菌。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR特異性檢測結果

將6種標準菌株進行活化、培養(yǎng)后，按照1.2.2的方法提取模板，進行實時熒光PCR擴增，每個標準菌株進行2次重復試驗。如圖1所示，只有銅綠假單胞菌的檢測結果為陽性，其余5種菌株均為陰性。說明本研究采用的實時熒光PCR方法具有良好的特異性，不會引起非特異性擴增。

2.2 實時熒光PCR靈敏性檢測結果

分別取濃度為1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1、1×102 CFU·mL-1和1×10 CFU·mL-1的銅綠假單胞菌菌懸液1 mL，按照1.2.2的方法提取模板，再進行實時熒光PCR檢測。如圖2所示，濃度為1×107 CFU·mL-1、1×106 CFU·mL-1、1×105 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1、1×103 CFU·mL-1的菌懸液均有擴增曲線，濃度為1×102 CFU·mL-1、1×10 CFU·mL-1的菌懸液均無擴增曲線，表明該實時熒光PCR檢測方法最低檢測濃度為1×103 CFU·mL-1。

2.3 實時熒光PCR重復性測試結果

根據《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）選取將銅綠假單胞菌濃度為1×106 CFU·mL-1、1×104 CFU·mL-1的菌懸液，按照1.2.2的方法提取DNA后，進行實時熒光PCR檢測。每種濃度的菌懸液分別進行10次重復試驗，將擴增結果的Ct值記錄下來并計算變異系數。如表2所示，試驗建立的實時熒光PCR方法具有良好的重復性。

2.4 實時熒光PCR方法與國家安全標準方法檢測結果的比較

將銅綠假單胞菌標準菌株活化后，分別用實時熒光PCR方法和國家安全標準方法《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）對其進行檢測，重復試驗7次，進行結果比較[7]。結果顯示，實時熒光PCR方法與國標法的重復性試驗檢測結果相似，說明該研究建立的實時熒光PCR方法具有較高的精確度，可以應用于實際檢測當中。

2.5 實際樣品檢驗

采用本試驗建立的實時熒光PCR方法對承德地區(qū)生產的10個不同品牌的包裝飲用水進行檢測。結果顯示，有一個樣品檢出有銅綠假單胞菌，其他樣品均未檢出，說明本試驗建立的實時熒光PCR方法具有良好的實用性。

3 結論與討論

本研究采用實時熒光PCR法對銅綠假單胞菌進行檢測，同時與其他5種常見致病菌的特異性檢測進行比對。結果表明，該方法對銅綠假單胞菌的特異性好，能排除其他致病菌的干擾。檢測限為1×103 CFU·mL-1。此外，本研究同時采用實時熒光PCR法與國家安全標準方法對銅綠假單胞菌進行重復性試驗，檢測結果相似，表明本研究建立的實時熒光PCR方法具有較高的精確度和良好的實用性。相比國家安全標準方法而言，實時熒光PCR法具有檢測效率高、易于操作和靈敏度高等特點，在食品檢驗檢測中可得到廣泛的應用。即將實施的《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2023）中增加了實時熒光PCR法，并作為第二法。實時熒光PCR技術作為一種檢測手段具有很大的實際運用價值，隨著科學技術的不斷發(fā)展，實時熒光PCR檢測方法也將得到進一步的發(fā)展和完善，并在微生物檢測中得到更多的應用。

參考文獻

[1]孟嘉偉.飲用天然礦泉水源中銅綠假單胞菌污染防治研究[J].中文科技期刊數據庫（文摘版）工程技術，2017（1）：72.

[2]李金明.實時熒光PCR技術[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2007.

[3]王芳妹，徐月，林丹，等.包裝飲用水中銅綠假單胞菌實時熒光定量PCR快速檢測[J].食品與機械，2023（6）：75-80.

[4]中華人民共和國海關總署.出口食品中致病菌熒光重組酶介導鏈替換核酸擴增（RAA）檢測方法 第12部分：銅綠假單胞菌：SN/T 5516.12—2023[S/OL].（2023-05-05）[2024-01-15].http：//www.csres.com/detail/391792.html.

[5]王丹，李赫婧，薛晨玉，等.基于實時熒光聚合酶鏈式反應快速檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌[J].食品安全質量檢測學報，2023，14（10）：301-306.

[6]張惟材，朱力，王玉飛.實時熒光定量PCR[M].北京：化學工業(yè)出版社，2016.

[7]國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法：GB 8538—2022[S].北京：中國標準出版社，2022.

基金項目：承德市科技計劃項目（202303A167）。

作者簡介：龐婕（1986—），女，河北承德人，本科，工程師。研究方向：食品檢驗檢測。

通信作者：劉杰（1989—），男，河北承德人，本科，工程師。研究方向：食品藥品檢驗。E-mail：425504383@qq.com。