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      腫瘤壞死因子受體3 相互作用蛋白2與心房顫動相關(guān)性的臨床研究

      2024-04-26 02:47:12耿金李濤李偉袁國良王丙劍章延春
      浙江醫(yī)學(xué) 2024年6期
      關(guān)鍵詞:心房孵育房顫

      耿金 李濤 李偉 袁國良 王丙劍 章延春

      隨著人口的老齡化以及心血管疾病患者的增多,心房顫動(下稱房顫)的發(fā)病率日益升高,其致死、致殘率較高,極大影響患者的生活質(zhì)量及生存率,同時增加家庭、社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1-2]。目前認(rèn)為房顫是一種慢性炎癥性疾病,以心房纖維化為主要特點,伴隨心房電活動和結(jié)構(gòu)的紊亂。盡管關(guān)于房顫的研究很多,但其具體發(fā)病機制仍不詳,臨床中也缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志物來預(yù)測其發(fā)病風(fēng)險。腫瘤壞死因子受體3 相互作用蛋白2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 interacting protein 2,TRAF3IP2)調(diào)節(jié)多種炎癥因子信號通路,在動脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發(fā)揮重要作用[3]。近來有研究表明,TRAF3IP2 在小鼠心肌肥大和缺血再灌注模型中與心肌纖維化有因果關(guān)系[4-5]。本研究旨在探討TRAF3IP2 與房顫的相關(guān)性,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

      1 對象和方法

      1.1 對象 選擇2021 年6 至12 月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院收治的瓣膜性心臟病患者41 例,其中男17 例,女24 例,年齡40~76(58.68±10.70)歲。根據(jù)是否合并房顫,分為房顫組(22 例)和非房顫組(19 例);其中有8 例患者轉(zhuǎn)至心臟外科行瓣膜置換或修復(fù)手術(shù),房顫患者5 例,非房顫患者3 例。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)心臟彩超明確診斷為瓣膜性心臟?。唬?)紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association,NYHA)心功能分級Ⅱ~Ⅲ級;(3)年齡<80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)急性左心衰竭、心功能Ⅳ級;(2)重癥感染和活動性風(fēng)濕熱;(3)甲狀腺功能紊亂;(4)嚴(yán)重的腎功能不全;(5)病態(tài)竇房結(jié)綜合征或其他需要起搏器治療的情況;(6)陣發(fā)性房顫。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者知情同意。

      1.2 方法

      1.2.1 心臟超聲檢查 采用荷蘭飛利浦公司Epic7 彩超儀對所有患者行心臟彩超檢查,在入院3 d 內(nèi)完成,記錄左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimeter,LVEDd)、左心房直徑(left atrial dimeter,LAD)和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

      1.2.2 全血TRAF3IP2 表達(dá)水平檢測 所有患者入院當(dāng)天抽取靜脈血5 mL。采用DNA 提取試劑盒(中國凱基,KGA1206)按照說明書提取全血DNA,簡單步驟如下:全血RNA 以Trizol 試劑提取并以NanoDrop 2000 分光光度計定量。1 μg 的RNA 以cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為DNA。定量PCR 在Stepone Plus Real-Time PCR system 儀器(美國Bio-Rad)上進行。DNA 的表達(dá)水平以2-ΔΔCt法分析。PCR 引物序列如下:GAPDH 正義鏈,5'-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3',反義鏈,5'-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3';TRAF3IP2正義鏈,5'- ACCGTGATGATAATCGTAGCAATC -3',反義鏈,5'-CTGTAGACATGAGTGTTCTGAAGC3 -3'。TRAF3IP2 結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

      1.2.3 心房肌組織TRAF3IP2 表達(dá)水平檢測 8 例患者手術(shù)過程中在左心耳的適當(dāng)部位取少許心房肌組織,-80 ℃冰箱保存行后續(xù)檢測。采用免疫組化法,心房肌組織標(biāo)本以甲醛固定,無水乙醇脫水后制備石蠟切片。石蠟切片脫水后,以2%胎牛血清孵育30 min,以TRAF3IP2 一抗(美國Santa Cruze,sc-398161)4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗后,以二抗孵育30 min,并以蘇木精復(fù)染細(xì)胞核5 min,脫水后封片。TRAF3IP2 的表達(dá)水平采用Image Pro Plus 軟件以整合光密度值分析。

      1.2.4 心房肌組織膠原含量檢測 標(biāo)本同1.2.3,采用馬松染色,按照試劑盒(中國凱基,KGMST-8004)說明書進行,簡單步驟如下:石蠟切片脫水后以蒸餾水清洗,以蘇木精染核5 min,充分水洗后以麗春紅染色液染色5 min,冰醋酸溶液和磷鉬酸溶液清洗后,以苯胺藍(lán)染色液染色5 min,脫水后封片。采用Image Pro Plus 軟件分析心房肌組織膠原含量,評估其纖維化程度。

      1.2.5 心房肌組織TRAF3IP、α 平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)蛋白表達(dá)水平檢測 標(biāo)本同1.2.3,采用Western blotting 法。以全蛋白提取試劑盒(中國凱基,KGP250)提取組織蛋白,BCA 法定量蛋白濃度。在配好的膠中加入蛋白樣品后電泳,然后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。脫脂牛奶封閉該膜后以TRAF3IP2一抗(美國Santa Cruze,sc-398161)和α-SMA 一抗(美國Santa Cruze,sc-32313)4 ℃孵育過夜,以二抗孵育30 min 后ECL 法顯影,以GAPDH(美國Santa Cruze,sc-47724)作為參照蛋白。采用Image J 軟件定量分析TRAF3IP、α-SMA 蛋白表達(dá)水平。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 分析軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。對LAD 進行分層分析,采用Spearman 直線相關(guān)法分析TRAF3IP2 與LAD 的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、性別、伴隨疾病、LVEDd、LVEF 及生化指標(biāo)等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。房顫組LAD、LAD>3.5 mm的比例及TRAF3IP2 表達(dá)水平均大于非房顫組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。

      表1 兩組患者一般資料比較

      2.2 LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平的相關(guān)性分析和分層分析 相關(guān)性分析顯示,LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平呈直線相關(guān)(r=0.33,P=0.037),見圖1。分層分析顯示,LAD<3.5 mm 者及LAD>3.5 mm 者中,房顫患者的TRAF3IP2 表達(dá)水平均高于非房顫患者(均P<0.01),見表2。

      圖1 LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點圖

      表2 不同LAD 患者TRAF3IP2 表達(dá)水平比較

      2.3 兩組患者心房肌組織膠原含量和TRAF3IP2、α-SMA 蛋白表達(dá)水平比較 8 例患者于心臟外科行瓣膜置換術(shù)或修復(fù)術(shù),其中非房顫組3 例,房顫組5 例。馬松染色顯示房顫組心房肌組織膠原含量高于非房顫組(P<0.01),免疫組化染色顯示房顫組心房肌組織TRAF3IP2 蛋白表達(dá)水平高于非房顫組(P<0.01),見圖2A、B。Western blotting 法顯示房顫組左心房組織的TRAF3IP2 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均高于非房顫組(均P<0.01),見圖2C、D。

      3 討論

      TRAF3IP2 是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銜接蛋白,能直接與TNF-α、IL-1 等結(jié)合,通過激活其下游的JNK 和NF-κB 通路調(diào)節(jié)炎癥因子的合成與分泌、參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,目前關(guān)于TRAF3IP2 的研究多在動物和細(xì)胞模型中進行。部分研究表明,TRAF3IP2在動脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發(fā)揮重要作用[3],其潛在機制可能是通過TRAF3IP2 參與泡沫細(xì)胞的形成、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和促進平滑肌細(xì)胞遷移、增殖[6-8]。近期,Sakamuri 等[4]以醛固酮皮下注射小鼠構(gòu)建心肌肥大模型,發(fā)現(xiàn)心肌的TRAF3IP2表達(dá)水平明顯升高,抑制TRAF3IP2 的表達(dá)后小鼠心肌肥大的程度減輕,同時心肌纖維化的程度也得到了抑制。在小鼠缺血再灌注模型中,心肌TRAF3IP2的表達(dá)水平同樣明顯升高,而敲除TRAF3IP2 基因后,小鼠心肌梗死面積以及纖維化程度均明顯減少[5]。進一步的研究表明,TRAF3IP2 通過JNK 通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移,且促進其分泌各型膠原最終誘導(dǎo)纖維化[9]。這些動物和細(xì)胞的研究結(jié)果均表明,TRAF3IP2 作為一種炎癥相關(guān)蛋白,廣泛參與了動脈粥樣硬化、心肌重構(gòu)和心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。TRAF3IP2 在人體中同樣廣泛表達(dá),但健康狀態(tài)表達(dá)量較低,病理狀態(tài)下表達(dá)則明顯升高[10]。目前尚缺乏TRAF3IP2 與人類心血管疾病相關(guān)性的研究數(shù)據(jù)。

      心房肌纖維化是心房顫動的主要特征之一,因此TRAF3IP2 可能參與房顫進展。為驗證該假說,本研究入選瓣膜病房顫患者,發(fā)現(xiàn)房顫患者的TRAF3IP2表達(dá)水平較非房顫患者明顯升高,此外,TRAF3IP2 表達(dá)水平與患者LAD 呈直線相關(guān),由于房顫患者的左心房顯著大于非房顫患者,因此行分層分析以校正其對結(jié)果的影響。最終發(fā)現(xiàn)TRAF3IP2 表達(dá)水平與房顫的相關(guān)性不受左心房大小的影響。有部分患者行外科手術(shù),術(shù)中取其左心耳心房肌組織行馬松染色、免疫組化及Western blotting,發(fā)現(xiàn)房顫患者心房肌組織的TRAF3IP2 表達(dá)水平和纖維化程度高于非房顫患者,這些結(jié)果表明TRAF3IP2 表達(dá)水平可能與心房肌的纖維化相關(guān),進而參與房顫的進展。根據(jù)本研究的結(jié)論,推測在房顫發(fā)展過程中TRAF3IP2 通過調(diào)節(jié)心肌纖維化參與房顫的進展,但尚需進一步的研究證實。

      本研究在臨床標(biāo)本中證實TRAF3IP2 與房顫存在相關(guān)性,但由于樣本量較小,且并未行動物以及細(xì)胞實驗明確TRAF3IP2 與房顫的因果關(guān)系,因此仍需更多的臨床以及基礎(chǔ)研究證實本結(jié)論。

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