葡萄糖氧化酶及其配伍控制仔豬腸道損傷及腹瀉的作用

◆作者：謝瑞炎 洪耿輝 李轉(zhuǎn)見 萬博 職愛民 陳丹 左建軍

◆單位：1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院；4.鄭州工程技術(shù)學(xué)院化工食品學(xué)院；5.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司

根據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國2023 年生豬出欄72662 萬頭，同比增長3.8%。這表明我國生豬養(yǎng)殖業(yè)正在穩(wěn)定恢復(fù)因非洲豬瘟帶來的豬肉產(chǎn)能下降的影響。生豬養(yǎng)殖過程中，有效預(yù)防和治療斷奶仔豬腹瀉是實(shí)現(xiàn)高效養(yǎng)殖生產(chǎn)的關(guān)鍵之一，研究數(shù)據(jù)表明，我國仔豬腹瀉發(fā)病率普遍達(dá)30%～50%、死亡率達(dá)10%～15%，仔豬腹瀉造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Wu 等, 2015；王磊等，2020）。引起仔豬腹瀉的原因有多種，其中包括病毒和細(xì)菌性感染；營養(yǎng)消化不良導(dǎo)致腸腔內(nèi)外體液失衡；應(yīng)激因素，尤其是環(huán)境應(yīng)激致腸道氧化損傷；仔豬斷奶后，母源抗體急劇下降，造成仔豬抵抗力下降；給料量不當(dāng)，如過度限制仔豬采食或者仔豬過度采食都會引起仔豬腹瀉等（Smith 等,2010；姜玲玲等，2014；劉智慧，2020；孫遜，2019）。

1 抗生素及高鋅控制仔豬腹瀉的作用

長久以來，控制仔豬腹瀉最為成熟有效且生產(chǎn)上依賴性比較強(qiáng)的手段是在日糧中添加抗生素（馬有錄，2019）或高劑量氧化鋅（2500～4000 mg/kg）（Hahn等,1993；王磊等，2020）。雖然抗生素的使用很大程度上緩解了仔豬的斷奶應(yīng)激，降低了腹瀉率，提高了仔豬生長性能并降低了死亡率（Ma 等,2021；張瑩等，2021），但在畜牧生產(chǎn)中抗生素濫用還會帶來病原菌耐藥性產(chǎn)生、機(jī)體免疫力和抗病力降低、藥物殘留等弊端，所以早在1986年瑞典就已經(jīng)開始禁止使用促生長型抗生素，歐盟也于2006年禁止飼喂類似促進(jìn)動物生長的相關(guān)抗生素和藥物，2017 年美國畜牧業(yè)宣布全面禁抗（陳雙明等，2021）。此外，鋅是動物生長發(fā)育過程所必需的一種元素，常以氧化鋅的形式添加到仔豬日糧中。研究表明，機(jī)體內(nèi)多種重要酶在鋅作用下合成，所以添加適量的氧化鋅可以促進(jìn)動物體內(nèi)蛋白水解酶的合成，進(jìn)而提高機(jī)體對蛋白質(zhì)的消化吸收，從而降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長性能（宋佳純等，2021）。但是，氧化鋅的過量添加也會存在各種弊端，例如在仔豬體內(nèi)殘留大量重金屬，并對環(huán)境造成污染，所以2017 年歐盟宣布，在2022年前要完成全面禁止高劑量氧化鋅在仔豬養(yǎng)殖上的應(yīng)用（Hedegaard 等,2017）。

近年來，我國也出臺了一系列政策，以規(guī)范畜禽養(yǎng)殖過程中抗生素的安全使用，其中農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了第194 號公告，公告要求自2020 年7 月1 日起，飼料企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。我國農(nóng)業(yè)部2625號公告也明確規(guī)定：基于高氧化鋅條件下，造成的營養(yǎng)素互作、重金屬污染、鋅的毒性、鋅和微生物抗性、環(huán)境問題等方面因素考慮，仔豬（≤25 kg）配合飼料中鋅元素的最高添加量不能超過110 mg/kg，除非在仔豬斷奶后前兩周這個時間段，才被允許使用氧化鋅或堿式氯化鋅至1600 mg/kg。在此背景下，“替抗減鋅”腹瀉控制的飼料創(chuàng)新技術(shù)研發(fā)已經(jīng)迫在眉睫。

2 酸化劑控制仔豬腹瀉的作用

按照成分不同可以把酸化劑分為單一型和復(fù)合型，單一型酸化劑又可以分為有機(jī)酸型和無機(jī)酸型，其中有機(jī)酸化劑能作為飼料添加劑是因為含有羧基官能團(tuán)（-COOH），有機(jī)酸又可以分為簡單的單羧酸（甲酸、乙酸和丙酸）或帶有羥基的羧酸（乳酸、蘋果酸、檸檬酸和酒石酸）或含有雙鍵的短鏈羧酸（延胡索酸和山梨酸）；許多有機(jī)酸往往以鈉、鉀或鈣鹽形式存在，其優(yōu)點(diǎn)是氣味更小，在飼料制造過程中易于處理，腐蝕性更小，與游離酸相比更易溶于水等。無機(jī)酸化劑有鹽酸、硫酸和磷酸，無機(jī)酸成本比有機(jī)酸低，但無機(jī)酸因其揮發(fā)性和腐蝕性在實(shí)際應(yīng)用中有很大的局限性（嚴(yán)欣茹等，2020）。復(fù)合型酸化劑是指將兩種或兩種以上的單一酸化劑或者其鹽類按照一定比例組合而成的酸化劑。與單一型酸化劑相比，復(fù)合型酸化劑具有更大的酸度閾值和抑菌系區(qū)，且復(fù)合酸化劑各成分之間的協(xié)同互補(bǔ)效應(yīng)能使酸化劑的作用效果最大化，復(fù)合型酸化劑較單一型酸化劑飼料成本更低，在市場上有更大的競爭優(yōu)勢（陳歷，2019）。

酸化劑在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，包括：①降低畜禽胃腸內(nèi)pH，提高體內(nèi)各種消化酶活性。研究表明，畜禽體內(nèi)存在各種不同的消化酶，而消化酶的活性往往與胃腸道pH 相關(guān)，比如胃蛋白酶適宜pH 為2.0～3.5，酶活性隨pH 升高而降低，而在飼料中添加適量的酸化劑能夠有效提高胃內(nèi)蛋白酶活性，提高機(jī)體對蛋白質(zhì)的消化吸收，減少日糧中的抗原蛋白引起的仔豬過敏反應(yīng)，從而降低仔豬腹瀉率（董子誠，2019）。②促進(jìn)畜禽腸道內(nèi)有益菌的生長，抑制致病菌生長。研究表明，畜禽胃腸道中適宜有益菌生長的pH 在5 左右，而致病菌生長的適宜pH 大多在6 以上（Ravindran 等, 1993），所以在飼料中添加適量的酸化劑能夠改善畜禽腸道的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌的生長繁殖，抑制致病菌的生長繁殖，從而減少動物疾病的發(fā)生。③酸化劑能夠增強(qiáng)畜禽的免疫力和抵抗外來應(yīng)激的能力。比如檸檬酸、富馬酸能夠直接參與三羧酸循環(huán)，其形成能量的速度比葡萄糖分解快，當(dāng)畜禽發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，可快速在體內(nèi)合成ATP，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗應(yīng)激能力（羅佳捷等，2011）。

綜合而言，酸化劑作為抗生素的替代品，具有相對比較穩(wěn)定的替代效果和較低的替代成本等特點(diǎn)。

3 植物精油控制仔豬腹瀉的作用

植物精油（Essential oil，EO）指的是植物在生長發(fā)育中產(chǎn)生的一種油狀次生代謝產(chǎn)物。按其結(jié)構(gòu)的差異，EO 主要分為脂肪族、芳香族、萜類及其含氧衍生物和含硫、氮化合物這幾種類型（周選武，2018）。研究表明，EO對于革蘭氏陰性菌的抑制效果要小于對革蘭氏陽性菌的抑菌效果（Vaara, 1992）。EO 中的香芹酚和百里香酚可使細(xì)菌細(xì)胞壁（包括細(xì)胞膜）致敏，并造成細(xì)胞質(zhì)膜損傷，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而造成細(xì)菌細(xì)胞死亡（Ultee 等,2002）；此外，百里香酚具有使其容易進(jìn)入到脂肪酸鏈里面的細(xì)菌膜上的親脂性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜膨脹而變得更具流動性。正是因為具有這些特性，香芹酚和百里香酚被認(rèn)為是養(yǎng)殖業(yè)中有前景的替抗產(chǎn)品之一（Omonijo 等,2018）。

以肉桂醛等醛類物質(zhì)為主要成分的精油的抗菌能力僅次于酚類物質(zhì)。肉桂醛的抗菌活性與膜效應(yīng)和能量產(chǎn)生有關(guān)（Gill等,2004）。據(jù)報道，肉桂醛的羰基能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制細(xì)菌中氨基酸脫羧酶的活性，從而達(dá)到抑菌殺菌的目的（Wendakoon等,1995）。

EO 除了有比較好的抑菌性能外，還具有提高畜禽生長性能、抗氧化、抗炎作用、提高飼料適口性以及改善腸道健康等功能（張玥，2021），因此被認(rèn)為是一種理想的替代抗生素的添加劑，成為行業(yè)研究的熱點(diǎn)之一。

4 單寧酸控制仔豬腹瀉的作用

單寧酸是一種具有較強(qiáng)生物學(xué)特性和藥理活性的多酚類天然化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為水解單寧酸、縮合單寧酸和復(fù)合單寧酸，廣泛存在于五倍子、栗木、漆樹葉、黃櫨、高粱和咖啡等植物的組織器官中（唐青松等，2021）。長久以來縮合單寧酸都被認(rèn)為是飼料中的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有降低采食量和適口性等負(fù)面效應(yīng)，但隨著深入研究發(fā)現(xiàn)水解單寧酸具有殺菌、收斂、抗病毒等生物活性（農(nóng)斯偉等，2020），因此水解單寧酸作為一種新型的綠色添加劑應(yīng)用到畜禽飼料中可有效替代飼料中氧化鋅和抗生素的使用。

目前水解單寧酸在畜禽上的作用主要表現(xiàn)為以下幾方面：①抗病毒。單寧可與寄主的細(xì)胞膜或病毒體的蛋白質(zhì)外殼相結(jié)合，阻止病毒附著在寄主細(xì)胞上，從而導(dǎo)致病毒失去侵襲力；或者通過某些結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入到病毒里面，抑制病毒的糖蛋白復(fù)制，導(dǎo)致病毒死亡（唐青松等，2021）。②抗氧化。單寧中的多酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠提供活性氧，使自由基滅活。通過絡(luò)合鈣、銅、鐵等多種金屬離子，消除產(chǎn)生自由基的催化劑；或者抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而阻止該反應(yīng)產(chǎn)生的脂自由基在體內(nèi)傳播（劉漢鎖等，2019）。③抑菌。單寧酸的多酚羥基結(jié)構(gòu)可與細(xì)菌外膜穩(wěn)定性相關(guān)的二價陽離子相螯合，進(jìn)而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，當(dāng)多酚進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，可抑制致病菌遺傳物質(zhì)生物大分子的合成，從而影響細(xì)菌的遺傳表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變（Darvin 等,2017）。④抗腹瀉。由于水解單寧酸具有收斂特性，可以降低食糜在腸道移動速度，使水分和營養(yǎng)物質(zhì)能夠與腸道絨毛接觸更長時間，從而促進(jìn)水分和營養(yǎng)物質(zhì)吸收，達(dá)到有效降低斷奶仔豬腹瀉率的作用（李建光等，2021）。

5 葡萄糖氧化酶及其配伍控制仔豬腹瀉的作用

5.1 葡萄糖氧化酶的作用及其機(jī)制

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）作為一種廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的酶，其應(yīng)用到養(yǎng)殖業(yè)具有能夠替代抗生素的作用，例如能夠改善動物生產(chǎn)性能，增強(qiáng)動物免疫力和維持腸道穩(wěn)態(tài)等（Tang 等,2016）。

GOD 的作用機(jī)制是：GOD進(jìn)入動物腸道后，消耗葡萄糖，反應(yīng)生成葡萄糖酸和過氧化氫。首先GOD 反應(yīng)會消耗氧氣形成厭氧環(huán)境，而厭氧條件不利于有害菌的生長，反而促進(jìn)有益菌生長使其成為腸道優(yōu)勢菌群，從而改善腸道健康（王鑫等，2021）；生成的葡萄糖酸具有類似于酸化劑的作用，降低胃腸道pH，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸（Tsukahara 等,2002）；生成的過氧化氫同樣具有廣譜殺菌的功效，能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌等多種致病菌的生長繁殖（羅同陽等，2021）。此外，GOD 還具有一定的抗氧化能力，研究表明，畜禽受到應(yīng)激會產(chǎn)生過量自由基，同時導(dǎo)致機(jī)體自身的清除自由基能力下降，造成機(jī)體腸道上皮細(xì)胞損傷，而在飼料中添加適量的GOD 能夠有效清除這些自由基，防止腸道上皮細(xì)胞的完整性被破壞，提高機(jī)體免疫水平，進(jìn)而提高畜禽的生長性能（呂進(jìn)宏等，2004）。

5.2 葡萄糖氧化酶及其配伍的應(yīng)用

陳嘉銘（2019）在無抗飼料中添加適量的GOD 可有效降低仔豬腸道pH、減少腹瀉，同時還能增強(qiáng)仔豬的抗氧化能力和免疫力。侯振平等（2017）也報道了，在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%的GOD，顯著提高了仔豬末重和平均日增重，提高程度分別是9.85%和16.25%，同時也顯著降低了仔豬腹瀉率。Su 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)日糧中添加100mg/kg 的植物精油（主要活性成分是百里香酚和肉桂醛）可以改善斷奶豬的生長性能、緩解斷奶應(yīng)激等；李建光等（2021）發(fā)現(xiàn)添加800 g/t 的五倍子單寧酸能夠顯著提高仔豬平均日增重，降低料重比，并且因其收斂性能夠明顯降低食糜在腸道蠕動的速度和頻率，從而減少糞便的含水量，降低腹瀉率；姚繼明等（2017）研究結(jié)果表明，日糧中添加10 kg/t 檸檬酸后仔豬日增重顯著增加了6.67%，料重比顯著降低了2.74%，腹瀉率也顯著降低了65.87%。以上這些結(jié)果說明了GOD、百里香酚、五倍子單寧酸和檸檬酸均具有改善仔豬生長性能，降低仔豬腹瀉的作用。但是單一的抗生素替代品往往不能等效代替飼料中的抗生素，而且有研究表明，與單一抗生素替代品相比，使用不同的抗生素替代品組合對斷奶仔豬的生長性能和腸道健康有更好的促進(jìn)作用（陳一中等，2019）。

但是，目前GOD 和其他替抗產(chǎn)品的配伍研究較少。謝瑞炎（2022）發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶和百里香酚聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌有協(xié)同抑菌作用；葡萄糖氧化酶和五倍子單寧酸、葡萄糖氧化酶和檸檬酸聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌有相加抑菌作用。仔豬感染模型的飼養(yǎng)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）感染仔豬模型組相比，抗生素處理組和其他添加劑處理組ADG 均有提高的趨勢，提高的幅度分別是20.15%、17.10%、21.61%、7.32%、29.51%，其中GOD 和檸檬酸配伍協(xié)同效果最為顯著；能夠反映仔豬腹瀉程度的糞便評分也均有不同程度的降低、其中40 g/t 硫酸粘桿菌素、2000U/t GOD 和2000U/t GOD +1000 g/t 五倍子單寧酸組達(dá)到顯著水平；并且，通過腸道形態(tài)與物理結(jié)構(gòu)、炎性因子、盲腸微生物等分析，充分說明GOD和檸檬酸、百里香酚、五倍子單寧酸在提高仔豬免疫功能、改善腸道健康、控制腹瀉方面具有很好的配伍使用的組合效應(yīng)。

6 小結(jié)

目前，“替抗減鋅”產(chǎn)品主要集中在單一成分的應(yīng)用上，但是單一添加劑往往存在功效單一、成本高等問題，無法等效替代抗生素或高鋅，研究不同抗生素替代品的組合效益對實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。立足于生產(chǎn)，通過體外法評估各添加劑協(xié)同殺菌抑菌效果，并建立感染仔豬模型以分析“抗菌酶”配伍植物精油、酸化劑、益生菌等的協(xié)同增效作用、篩選配伍方案，可為飼料“替抗減鋅”方案的探討提供新思路和研究方法。