血清骨鈣素及SIRT6在急性缺血性腦卒中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值分析

何德英,潘成德,郭富饒,江思德

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是腦卒中最常見類型,近年來其患病率呈逐漸升高的趨勢[1]。AIS一旦發(fā)生,病情急劇發(fā)展,伴隨較高的致殘率和致死率[2]。尋找能評估AIS病情及預(yù)后的生物標(biāo)志物,對于改善患者預(yù)后具有重要意義[3]。骨鈣素是由BGLAP基因編碼,由非增殖期成骨細(xì)胞特異性合成和分泌,參與骨形成、葡萄糖及脂肪代謝的調(diào)節(jié)[4]。近年來發(fā)現(xiàn),血清骨鈣素等骨代謝指標(biāo)表達(dá)失?？稍黾幽X卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),是潛在的AIS血清標(biāo)志物[5]。去乙?；?(sirtuin 6, SIRT6)具有組蛋白賴氨酸殘基的脫乙酰酶作用,參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、自噬及衰老等多種生物學(xué)過程[6]。研究發(fā)現(xiàn),在急性腦缺血小鼠模型中,SIRT6表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,增加動(dòng)物病死率,是潛在的AIS血清標(biāo)志物[7]。本研究通過檢測AIS患者血清骨鈣素、SIRT6表達(dá),探討兩者對AIS患者臨床預(yù)后的預(yù)測價(jià)值,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2019年2月—2021年2月重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治AIS患者90例為AIS組,男44例,女46例,年齡31～83 (64.35±7.34)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～27 (22.52 ±2.28) kg/m2,病程1～24(6.12±2.13)h;吸煙史33例,飲酒史40例;既往史:高血壓46例,糖尿病18例;頭顱MR測量梗死面積:≤4 cm260例、>4 cm230例。以同期診治的高血壓或糖尿病患者90例為非AIS組,男48例,女42例,年齡31～78 (62.97±7.81)歲;BMI 18～29(22.53±2.41) kg/m2;高血壓60例,糖尿病30例;吸煙史30例,飲酒史38例。以同期體檢健康者90例為健康對照組,男45例,女45例,年齡32～80 (63.82±8.01)歲;BMI 18～28 (22.49 ±2.31) kg/m2。3組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史及飲酒史比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(KY20198134075009),受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、頭顱MR明確診斷為AIS,同時(shí)診斷和治療原則均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8];②初次發(fā)病;③患者發(fā)病到入院時(shí)間小于24 h;④無意識障礙及抽搐史;⑤臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn): ①既往有AIS病史;②入院予以靜脈溶栓、血管內(nèi)治療者;③合并顱腦腫瘤、顱腦外傷、嚴(yán)重心律失常、心肌梗死等;④合并骨質(zhì)疏松、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料收集:包括性別、年齡、BMI、高血壓、糖尿病等資料;檢測血脂(總膽固醇、三酰甘油、高密度和低密度脂蛋白膽固醇)水平;頭顱MR檢查并計(jì)算腦梗死面積。AIS患者入院時(shí)進(jìn)行美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)評分[9],評分范圍0～42分,評分越高,神經(jīng)功能缺損程度越重。根據(jù)NIHSS評分,分為輕癥亞組(0～15分,30例),中癥亞組(16～30分,33例)和重癥亞組(31～42分,27例)。

1.3.2 血清骨鈣素、SIRT6測定:于患者入院次日清晨和健康對照組體檢時(shí)采取肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h,離心留取上層血清。以ELx800型酶標(biāo)儀(Biotek公司)檢測血清骨鈣素(酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海撫生生物公司,貨號A102876)、SIRT6水平(酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自上海滬震生物科技公司,貨號HZ-2117)。

1.3.3 隨訪:患者出院第3個(gè)月時(shí)均接受門診復(fù)查,應(yīng)用改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRS)評估其預(yù)后情況并進(jìn)行分組[10],預(yù)后不良亞組(>2分,n=24),預(yù)后良好亞組(≤2分,n=66)。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清骨鈣素、SIRT6水平比較 與健康對照組比較,血清骨鈣素、SIRT6水平AIS組均降低(t/P=25.013/<0.001、27.571/<0.001),非AIS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=2.559/0.152,3.113/0.067);與非AIS組比較,AIS組2項(xiàng)指標(biāo)均降低(t/P=31.808/<0.001、36.440/<0.001),見表1。

表1 3組受試者血清骨鈣素及SIRT6水平比較

2.2 不同病情嚴(yán)重程度AIS患者血清骨鈣素、SIRT6水平比較 血清骨鈣素、 SIRT6水平重癥亞組<中癥亞組<輕癥亞組(t/P=7.793/<0.001、3.809/<0.001,10.987/<0.001、6.684/<0.001),見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度AIS患者血清骨鈣素、SIRT6水平比較

2.3 不同預(yù)后AIS患者臨床指標(biāo)比較 與預(yù)后良好亞組比較,預(yù)后不良亞組梗死面積大、NIHSS評分較高,血清骨鈣素及SIRT6均較低(P均<0.01);其他資料2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 不同預(yù)后AIS患者臨床指標(biāo)比較

2.4 AIS患者預(yù)后影響的多因素Logistic回歸分析 以AIS患者預(yù)后為因變量(不良=1,良好=0),以血清骨鈣素、SIRT6、梗死面積、NIHSS評分為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:梗死面積大、NIHSS評分高是影響AIS患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,血清骨鈣素及SIRT6高是影響AIS患者預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.01),見表4。

表4 AIS患者預(yù)后影響的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預(yù)后的評估價(jià)值 繪制血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預(yù)后的評估價(jià)值ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示: 血清骨鈣素、SIRT6及兩項(xiàng)聯(lián)合對AIS 患者不良預(yù)后的AUC分別為0.782、0.796、0.886,兩項(xiàng)聯(lián)合的AUC大于各自單獨(dú)預(yù)測效能(Z=4.526、4.209,P均<0.001),見表5、圖1。

圖1 AIS患者預(yù)后的受試者工作特征曲線分析

表5 血清骨鈣素、SIRT6水平對AIS患者不良預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

3 討 論

AIS是大腦供血不足導(dǎo)致腦組織損傷的急性疾病,疾病早期可出現(xiàn)神經(jīng)功能惡化,導(dǎo)致肢體和語言殘疾,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。目前影響AIS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的因素較多,如高齡、高血壓及糖尿病等[11],但目前尚無有效評估AIS患者預(yù)后的血清標(biāo)志物。研究影響AIS患者預(yù)后的因素,有利于指導(dǎo)臨床診治。

骨鈣素是由成熟成骨細(xì)胞合成分泌的特異性非膠原蛋白,是包含49個(gè)氨基酸的小分子肽,不僅參與骨形成、骨轉(zhuǎn)換過程,其還能夠作為一種內(nèi)分泌激素,參與能量代謝及雄性生殖的過程[4]。研究發(fā)現(xiàn),母體骨鈣素可以穿過胎盤,促進(jìn)胎兒大腦神經(jīng)發(fā)生和發(fā)育,促進(jìn)空間學(xué)習(xí)和記憶能力[12]。本研究中,AIS患者血清骨鈣素水平明顯降低,提示骨鈣素表達(dá)下調(diào)促進(jìn)AIS的發(fā)生發(fā)展。骨鈣素不僅表達(dá)于成骨細(xì)胞,也存在于血管平滑肌細(xì)胞中,有學(xué)者研究表明血清骨鈣素降低能夠?qū)е缕咸烟呛椭敬x紊亂,促進(jìn)血管鈣化、血管動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)膜增生等的發(fā)生,增加AIS等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5]。研究表明,骨鈣素表達(dá)下調(diào)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞不穩(wěn)定性,促進(jìn)動(dòng)脈血管平滑肌鈣化,增加AIS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[13]。本研究中,AIS患者血清骨鈣素與疾病嚴(yán)重程度有關(guān),病情程度越重,血清骨鈣素水平越低,提示血清骨鈣素水平有助于反映AIS患者疾病嚴(yán)重程度。其原因可能是骨鈣素能夠促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞代謝重編程,在腦缺血時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究表明,骨鈣素的表達(dá)下調(diào)能夠激活脯氨酸羥化酶1,促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)及葡萄糖的有氧氧化,加重腦缺血缺氧時(shí)神經(jīng)元的損傷[14]。此外,骨鈣素水平降低還能降低循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平,降低其增殖和分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力,缺血區(qū)新生血管生成減少,加重AIS神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度[13]。本研究結(jié)果表明,骨鈣素高表達(dá)是影響AIS預(yù)后的保護(hù)因素。分析其原因,可能是骨鈣素能夠通過抑制AIS缺血半影區(qū)神經(jīng)元的死亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明,骨鈣素能夠通過抑制缺血半影區(qū)神經(jīng)元中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活性及Gasdermin D的表達(dá),進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡的發(fā)生,減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡及患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生[15]。

sirtuin家族包括SIRT1～SIRT7共7個(gè)成員,具有去乙酰酶和ADP核糖轉(zhuǎn)移酶活性[16]。SIRT6主要位于細(xì)胞核中,是一種多功能表觀遺傳酶。近年研究發(fā)現(xiàn),SIRT6表達(dá)降低能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管舒張,參與動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展[17]。本研究結(jié)果表明,AIS患者血清SIRT6水平明顯降低,提示SIRT6表達(dá)下調(diào)促進(jìn)AIS的疾病發(fā)生。有學(xué)者證實(shí),在原代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,缺氧條件能顯著抑制SIRT6的表達(dá),并在大腦中動(dòng)脈閉塞的小鼠腦組織中觀察到SIRT6表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象[18]。有研究報(bào)道,內(nèi)皮細(xì)胞SIRT6特異性敲除的AIS小鼠中,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡顯著增加,引起血腦屏障功能障礙,同時(shí)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的過度激活促進(jìn)神經(jīng)元凋亡,加重動(dòng)物神經(jīng)功能損傷,增加動(dòng)物病死率[7]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí),缺氧/復(fù)氧損傷降低了原代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT6的表達(dá)水平,損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表達(dá)增加,神經(jīng)元存活途徑Akt通路受到抑制,加重AIS病情程度[7,19-20]。本研究中,血清SIRT6高表達(dá)是影響AIS患者不良預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),腦神經(jīng)元中SIRT6的過度表達(dá)能夠上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2的表達(dá),增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,減輕了缺血再灌注損傷時(shí)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損,而敲除核因子E2相關(guān)因子2的表達(dá)后,SIRT6則失去神經(jīng)保護(hù)作用[21]。尚有學(xué)者發(fā)現(xiàn),SIRT6能夠促進(jìn)海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型極化,抑制神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷,改善手術(shù)引起的認(rèn)知功能障礙[22]。因此,AIS中SIRT6的表達(dá)下調(diào)參與AIS疾病的發(fā)生發(fā)展,是評估AIS患者預(yù)后的血清標(biāo)志物。

綜上所述,AIS 患者血清骨鈣素、SIRT6表達(dá)降低,兩者的表達(dá)與AIS患者病情嚴(yán)重程度有關(guān),是影響AIS患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。臨床醫(yī)師可根據(jù)AIS患者血清骨鈣素及SIRT6水平,對不同預(yù)后AIS患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層,優(yōu)化不良預(yù)后的AIS患者的臨床治療方案,以減輕患者神經(jīng)功能損傷程度,改善患者臨床預(yù)后。此外,針對骨鈣素、SIRT6的臨床治療藥物能否有效治療AIS,改善AIS患者預(yù)后,值得今后進(jìn)行深入研究。本研究為單中心研究,尚可能存在潛在影響血清骨鈣素、SIRT6水平的其他疾病,有待今后設(shè)計(jì)多中心大樣本臨床試驗(yàn),排除可能的混雜因素進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

何德英、郭富饒:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文撰寫;潘成德:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文撰寫;江思德:課題設(shè)計(jì),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析