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    凋落物真菌Neocucurbitaria salicis-albae及其代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性

    2024-04-23 11:20:28劉瑤趙吳超楊驍寇雨心都婷婷陳秀青秦夢(mèng)飛徐利劍
    關(guān)鍵詞:粗提物酰胺病原

    劉瑤,趙吳超,楊驍,寇雨心,都婷婷,陳秀青,秦夢(mèng)飛,徐利劍

    (黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150080)

    0 引言

    真菌作為自然界重要的自然資源,分布范圍極其廣泛,其物種的多樣性十分豐富,而且在生態(tài)系統(tǒng)中也扮演了分解者等重要作用。隨著自然條件的變化和生物種群的繁衍,真菌作為自然界不可缺少的一部分,真菌的多樣性及組成也在不斷變化,從而使得真菌物種豐富,功能多樣。真菌物種數(shù)量非常龐大,目前估計(jì)有220 萬(wàn)至380 萬(wàn)種真菌,而已經(jīng)命名的真菌僅20 萬(wàn)種左右,其中多數(shù)真菌的活性與用途未被深入研究,所以真菌被認(rèn)為是重要的未被深入開(kāi)發(fā)的自然資源[1]。

    真菌的次生代謝物作為天然產(chǎn)物,已經(jīng)在工業(yè)、醫(yī)藥、食品等諸多方面表現(xiàn)了很好的應(yīng)用潛力,因此,森林凋落物真菌資源逐漸受到重視[2-4]。2019—2022年,在大興安嶺森林凋落物中共報(bào)道真菌334 株,其中91株為尚未被描述的真菌[5-7],張哲棟等[4]在2株凋落物真菌中分離出4個(gè)單體化合物,其中有3個(gè)單體化合物具有抗菌活性,有2 個(gè)化合物為首次從真菌的提取物中分離得到。SI等[8]在1株真菌中得到5個(gè)單體化合物,且都具有抗菌活性,其中3 個(gè)單體化合物為新結(jié)構(gòu)化合物。甄錦程等[9]在3株凋落物真菌中,共分離8個(gè)化合物,其中2個(gè)表現(xiàn)了抗菌活性,并且含有2個(gè)新化合物。以上研究表明大興安嶺真菌資源豐富,可以產(chǎn)生具有抗菌活性的化合物,但研究不夠廣泛與深入,目前尚有大量真菌資源未被嘗試開(kāi)發(fā)利用。

    為了獲得大興安嶺森林凋落物中未開(kāi)發(fā)的真菌及其抗菌化合物,為防治植物病害提供備選菌株及其抗菌化合物,本研究從大興安嶺森林凋落物中分離鑒定了一株Neocucurbitaria屬真菌SGSF801,并從其發(fā)酵物中分離、純化并鑒定了一個(gè)具有抗植物病原菌活性的抗菌化合物,為大興安嶺森林凋落物真菌資源的利用,提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    1.1.1 樣品采集本研究的凋落物樣品采自于大興安嶺地區(qū)[2]。該地區(qū)主要的植物為樟子松(Pinussylvestris),興安落葉松(Larixgmelinii),水曲柳(Fraxinus mandshurica)白樺(Betulaplatyphylla)等。以每層4 cm至8 cm 的深度采集凋落物的樣品,共采集A、B、C 三層。將所采集的樣品分別裝入已經(jīng)滅菌過(guò)的信封袋里,對(duì)其進(jìn)行自然風(fēng)干,然后放入箱中保存。

    1.1.2 供試微生物植物病原細(xì)菌:水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae),丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae),青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum),植物病原真菌:細(xì)交鏈格孢菌(Alternariatenuis),立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani),用于抗菌活性測(cè)試。供試培養(yǎng)基MEA、OA、PD、PDA、SM、SMAY、YMA 與大米培養(yǎng)基等,培養(yǎng)基配方參考邱天藝等[10]的研究。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 凋落物真菌的分離運(yùn)用顆粒涂布平板法[11]對(duì)凋落物真菌進(jìn)行分離。將所采集到的森林凋落物樣品充分研磨至小顆粒狀,隨后將其配置成懸浮液,按照一定梯度稀釋涂布在1/4 PDA培養(yǎng)基上,放置在25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔12 h觀察一次,在無(wú)菌操作臺(tái)中挑出剛萌發(fā)的菌落至PDA培養(yǎng)基上,進(jìn)行真菌的培養(yǎng)純化。

    1.2.2 凋落物真菌的鑒定運(yùn)用CTAB法[12]獲取真菌的DNA,采用引物ITS1 及ITS4 擴(kuò)增其內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(Internal Transcribed Spacer,ITS),選用引物L(fēng)R0R和LR5 擴(kuò)增其核糖體大亞基基因序列(nuclear large subunit rDNA, LSU),選用引物Bt2a 和Bt2b 擴(kuò)增其β-微管蛋白基因序列(β-tubulin,TUB2)。其中PCR 擴(kuò)增的體系和及引物序列等信息參見(jiàn)GAO 等[13]的方法。經(jīng)過(guò)測(cè)序,運(yùn)用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行真菌基因序列比對(duì)分析,確定該凋落物真菌的分類學(xué)地位。在形態(tài)學(xué)觀察方面,通過(guò)觀察在不同培養(yǎng)基上菌落顏色、質(zhì)地和分泌物,以及觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子的形狀、大小等特征,和相近真菌文獻(xiàn)進(jìn)行比較,進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

    1.2.3 菌株發(fā)酵及提取物制備 首先把菌碟接種在SMAY培養(yǎng)基中,放置于搖床里在180 r/min,25℃條件下振蕩培養(yǎng)3 d,然后分別吸取200μL菌液,接種到20 mL體系的SM、PD、PDA 及大米培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株發(fā)酵。SM、PD發(fā)酵置于搖床180 r/min,25℃條件下培養(yǎng)14 d,PDA及大米培養(yǎng)基發(fā)酵置于25℃靜置培養(yǎng)21 d。真菌發(fā)酵結(jié)束后,加入20 mL 的乙酸乙酯,充分混勻,然后靜置24 h,通過(guò)減壓濃縮得到發(fā)酵提取物,使用1 mL的10%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)作為溶劑,得到真菌發(fā)酵物的提取物溶液。

    1.2.4 粗提物的抗菌活性測(cè)定運(yùn)用打孔藥劑擴(kuò)散法[14]測(cè)定真菌的抗菌活性。抗植物病原細(xì)菌:將搖好的菌液加入到溫度在50℃的LBA培養(yǎng)基中,倒平板后靜置4 h,待其凝固后用打孔器均勻打6 個(gè)孔。取10μL 發(fā)酵提取物溶液,加入孔中??怪参锊≡婢河么蚩灼髟赑DA平板上均勻的打6個(gè)孔,中間接種植物病原真菌菌碟,其余同上。

    1.2.5 化合物的分離與鑒定利用大米培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵,利用乙酸乙酯進(jìn)行提取。將濃縮粗提物與等量的100~200 目硅膠混合均勻。風(fēng)干上樣進(jìn)行柱層析,使用二氯甲烷與甲醇溶液梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫2 L溶液,得到洗脫樣品S1~S30。利用薄層層析(TLC)法合并相似組分[15],采用葡聚糖凝膠Sephadex LH20 層析柱,二氯甲烷與甲醇1:1比例配置洗脫溶液,洗脫流速約為8 s一滴。利用半制備液相(C18反向硅膠柱)甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行制備,HPLC 進(jìn)行化合物純度檢測(cè),獲得高純度的單體化合物。隨后進(jìn)行核磁共振氫譜(1HNMR)分析與碳譜(13C-NMR)分析,查閱文獻(xiàn),鑒定其結(jié)構(gòu)。

    1.2.6 單體化合物測(cè)定最低抑菌濃度參照張哲棟等[4]研究方法。使用96 孔板對(duì)化合物最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)進(jìn)行測(cè)定,首先將單體化合物溶于5%的DMSO 溶液中溶解,然后倍半稀釋至不同濃度,添加至96孔板,3次重復(fù),5%的DMSO 與金霉素分別作為對(duì)照。密封于25℃的培養(yǎng)箱中,進(jìn)行黑暗培養(yǎng),24 h后開(kāi)始觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 凋落物真菌的分離與鑒定

    從森林凋落物中分離出真菌SGSF801,經(jīng)多序列相似性分析,其最相近菌種為Neocucurbitariasalicisalbae(表1)。真菌SGSF801 在PDA 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)橄欖綠色,YMA上呈白棕色,可產(chǎn)生厚垣孢子,與報(bào)道的形態(tài)學(xué)特征[16]存在一定的差異。真菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1 所示,結(jié)合分子鑒定結(jié)果,初步將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。

    圖1 形態(tài)學(xué)觀察

    表1 多序列相似性分析結(jié)果

    2.2 凋落物真菌的生長(zhǎng)速率分析

    通過(guò)比較4 種培養(yǎng)基不同溫度下的生長(zhǎng)速率,發(fā)現(xiàn)SGSF801 在OA 培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度最快,其最適生長(zhǎng)溫度為20℃至25℃。不同培養(yǎng)基及不同溫度的生長(zhǎng)直徑如表2所示。

    表2 不同培養(yǎng)基及不同溫度的生長(zhǎng)直徑 mm

    2.3 粗提物的抗菌活性測(cè)定

    SGSF801菌株粗提物的抗菌活性測(cè)定結(jié)果如表3所示。在抗植物病原細(xì)菌活性方面,4 種培養(yǎng)基發(fā)酵的粗提物都表現(xiàn)了不同程度的抗丁香假單胞菌和青枯勞爾氏菌的活性,在抗真菌方面,大米培養(yǎng)基粗提物表現(xiàn)了抗立枯絲核菌的活性,綜合比較選擇大米培養(yǎng)基作為擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)基。

    表3 抗菌活性測(cè)定

    2.4 單體化合物的結(jié)構(gòu)

    對(duì)SGSF801菌株進(jìn)行大米培養(yǎng)基發(fā)酵,得到16.8 g粗提物。通過(guò)對(duì)粗提物抗菌活性追蹤分離得到1個(gè)單體化合物。該化合物的13C-NMR(101 MHz,CDCl3)共有16 個(gè)峰,化學(xué)位移值為δ 201.68、197.57、191.61、178.15、169.38、166.05、158.07、154.99、105.46、103.77、101.50、99.21、93.81、58.73、31.91、27.69。經(jīng)文獻(xiàn)查詢,該化合物的13C-NMR與1H-NMR波譜數(shù)據(jù)與化合物尾孢酰胺(Cercosporamide)的數(shù)據(jù)一致[17],其分子式為C16H13NO7,其結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

    圖2 單體化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)

    2.5 單體化合物的MIC值測(cè)定結(jié)果

    利用植物病原細(xì)菌青枯勞爾氏菌和丁香假單胞菌,對(duì)單體化合物進(jìn)行了MIC的測(cè)定,結(jié)果顯示該單體化合物對(duì)青枯勞爾氏菌的MIC值為31.25~62.5 μg/mL,對(duì)丁香假單胞菌的MIC值為125~250 μg/mL。

    3 結(jié)論與討論

    大興安嶺森林凋落物中具有大量未開(kāi)發(fā)利用的真菌資源[5-7],本研究在大興安嶺森林凋落物中,分離鑒定了 一 株 真 菌N.salicis-albaeSGSF801。Neocucurbitaria菌屬隸屬于Cucurbitariaceae 菌科,該屬由WANASINGHE 等[18]建立于2017年,目前包括22個(gè)物種,可以腐生在灌木與喬木上。N.salicis-albae是由CROUS 等[16]基于其ITS、LSU 及TUB2 等序列分析結(jié)果,建立于2019 年,最初該物種發(fā)現(xiàn)于烏克蘭的白柳(Salixalba)樹(shù)枝上,形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該菌可以產(chǎn)生棕色球形分生孢子器,分生孢子為近圓柱形至梭形。菌株SGSF801雖然未見(jiàn)產(chǎn)生分生孢子器與分生孢子,但經(jīng)ITS、LSU 及TUB2 多序列分析發(fā)現(xiàn)SGSF801 的最相近菌種為N.salicis-albae,ITS與LSU的相似性都超過(guò)了99%,但是TUB2 其相似的相似性為97.54%與已知株系存在差異,由此將其鑒定為N.salicis-albae的新株系。關(guān)于Neocucurbitaria菌屬的天然產(chǎn)物化學(xué)方面,HU 等[19-20]在N.unguis-hominis提取物中分離到15個(gè)二萜類新化合物,但未見(jiàn)這些化合物具有明顯的抗菌活性,尚未見(jiàn)關(guān)于N.salicis-albae天然產(chǎn)物的報(bào)道。本研究首次嘗試分離N.salicis-albae的天然產(chǎn)物,在其大米發(fā)酵提取物中鑒定了一個(gè)抗菌化合物尾孢酰胺,該研究豐富了Neocucurbitaria菌屬的次生代謝物數(shù)據(jù)。尾孢酰胺最初分離于Cercosporidium henningsii[21],后來(lái)也發(fā)現(xiàn)于真菌Verruculinaenalia中[17],尾孢酰胺曾被發(fā)現(xiàn)可以選擇性地作用于Pkc1激酶,具有開(kāi)發(fā)成廣譜型抗真菌藥物的潛力[22],但尚未見(jiàn)尾孢酰胺抗植物病原細(xì)菌丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的報(bào)道,本研究為首次在Cucurbitariaceae 菌科真菌中發(fā)現(xiàn)尾孢酰胺,并且還證明了尾孢酰胺在離體情況下具有抗植物病原細(xì)菌的活性,但是否能在活體植株上表現(xiàn)出相同活性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在對(duì)SGSF801的次生代謝物分離過(guò)程中,還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)類似萜類的化合物,且在預(yù)試驗(yàn)中表現(xiàn)出了抗菌活性和抗線蟲活性,由于條件有限未能純化出單體化合物,關(guān)于凋落物真菌SGSF801 的次生代謝產(chǎn)物的研究還有待深入。

    綜上所述,本研究在森林凋落物上分離、培養(yǎng)、鑒定了N.salicis-albae的一個(gè)新株系,在它的大米發(fā)酵物中分離鑒定了1 個(gè)抗菌化合物——尾孢酰胺,并首次發(fā)現(xiàn)該化合物具有抗丁香假單胞菌與青枯勞爾氏菌的活性,其MIC為31.25~250 μg/mL。本研究結(jié)果,豐富了關(guān)于Cucurbitariaceae菌科尤其是Neocucurbitaria屬真菌抗菌次生代謝物的研究,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用大興安嶺凋落物真菌資源奠定了基礎(chǔ)。

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