基于BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞模型導(dǎo)向分離糙葉五加根的化學(xué)成分

陳 楊，肖 瑾，蔣詩琴，羅 姣，劉向前

基于BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞模型導(dǎo)向分離糙葉五加根的化學(xué)成分

陳 楊，肖 瑾，蔣詩琴，羅 姣，劉向前*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208

基于BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞模型導(dǎo)向分離糙葉五加根的化學(xué)成分。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥模型，以MTT法測定細(xì)胞毒性，對糙葉五加根的正己烷、醋酸乙酯、正丁醇提取部位進(jìn)行活性篩選，確定活性部位，根據(jù)篩選結(jié)果對最佳活性部位進(jìn)一步采用柱色譜、D101大孔樹脂、半制備液相等方法進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和所得到的光譜數(shù)據(jù)，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。并對其中得到的部分化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證。糙葉五加醋酸乙酯提取物部位的活性最佳，從中分離得到17個(gè)化合物，分別鑒定為 (＋)-芝麻素（1）、松柏醛（2）、acuminatolide（3）、芝麻素酮（4）、10-二十九烷醇（5）、(±)--甲基-4-羥基癸酰胺（6）、羅漢松脂素（7）、(1,2,5,6)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane（8）、1-辛烯（9）、胡椒醇（10）、(?)-松脂醇（11）、榕醛（12）、丁香醛（13）、丁香脂醇（14）、(?)-表丁香脂素（15）、原兒茶醛（16）、原兒茶酸（17）。其中分離得到的(＋)-芝麻素和丁香醛在細(xì)胞耐受濃度（5～80 μmol/L）下能減少LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮（NO）的釋放，且呈劑量相關(guān)性。化合物3～10、12、15首次從五加科植物中分離得到，化合物2～12、15～16首次從糙葉五加中分離得到。糙葉五加根中的化合物芝麻素和丁香醛具有潛在的抗神經(jīng)炎活性。

糙葉五加；抗神經(jīng)炎活性；五加屬植物；木脂素類；芝麻素；丁香醛

神經(jīng)炎癥對包括阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森癥（Parkinson’s disease，PD）等在內(nèi)的多種急性和慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系[1-3]，神經(jīng)炎癥[4]產(chǎn)生的主要病因有膠質(zhì)細(xì)胞的激活、血腦屏障的破壞以及外周免疫細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)等，膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活會導(dǎo)致細(xì)胞釋放多種炎性因子，如一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子及前列腺素E2等，造成神經(jīng)元的損傷和變性。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）具有很強(qiáng)的致炎效應(yīng)，但對神經(jīng)元不會產(chǎn)生直接的不良反應(yīng)，而是通過產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子，從而激活膠質(zhì)細(xì)胞間接引起炎癥反應(yīng)。此過程也常被用于體外炎癥模型的建立，使用LPS刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，使其活化分泌大量致炎因子如NO、腫瘤壞死因子、前列腺素E2等從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)[5-6]，其中NO常被用于判斷炎癥反應(yīng)是否發(fā)生的重要指標(biāo)。

糙葉五加(Oliv.) Harms又名亨利五加，為中國特有的五加屬植物，廣泛分布于湖南、湖北、浙江、安徽、甘肅、四川、河北、山西、陜西等地，資源豐富，生于林緣或灌叢中，其根皮作為“五加皮”收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。糙葉五加味辛，性溫；具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、活血化瘀、壯筋骨等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、拘攣麻木、筋骨痞軟、水腫、跌打損傷、疝氣腹痛等[7-8]。本課題組[9-11]前期圍繞糙葉五加葉、莖、花、果實(shí)做了大量相關(guān)研究，已證明糙葉五加地上部分中分離的部分化合物具有抗神經(jīng)炎活性。為了更全面地了解糙葉五加各部分的藥理活性，本研究利用BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的體外炎癥模型對糙葉五加根的正己烷提取物（AH-RH）、醋酸乙酯提取物（AH-RE）、正丁醇提取物（AH-RB）進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和抗炎活性篩選，從活性較好的醋酸乙酯部位（AH-RE）分離得到17個(gè)化合物，分別鑒定為 (＋)-芝麻素（(＋)-sesamin，1）、松柏醛（coniferaldehyde，2）、acuminatolide（3）、芝麻素酮（sesaminone，4）、10-二十九烷醇（10-nonacosanol，5）、(±)--甲基-4-羥基癸酰胺（rac--methyl-4-hydroxydecanamide，6）、羅漢松脂素（matairesinol，7）、(1,2,5,6)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane（(1,2,5,6)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane，8）、1-辛烯（1-octene，9）、胡椒醇（piperitol，10）、(?)-松脂醇 [(?)-pinoresinol，11]、榕醛（ficusal，12）、丁香醛（syringaldehyde，13）、丁香脂醇（syringaresinol，14）、(?)-表丁香脂素[(?)-episyringaresinol，15]、原兒茶醛（protocatechuyl aldehyde，16）、原兒茶酸（protocatechuic acid，17），其中化合物3～10、12、15首次從五加科植物中分離得到，化合物2～12、15～16首次從糙葉五加中分離得到。進(jìn)一步對分離純化的化合物1和化合物13進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)和抗神經(jīng)炎活性研究，發(fā)現(xiàn)兩者都具有一定的抗神經(jīng)炎活性，為深入開發(fā)應(yīng)用糙葉五加資源及豐富治療神經(jīng)炎潛在藥物來源提供了理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與材料

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司）；超導(dǎo)核磁共振儀（德國Bruker公司）；暗箱三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；LC-10A高效液相色譜儀（日本島津公司）；LC-16P半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；多級閃蒸器（上海釩幟精密設(shè)備有限公司）；Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；瑞典Nouryon公司）；5C18-MS-II（250 mm×10 mm，5 μm；日本Cosmosil公司）；96孔板（海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材廠）。

1.2 藥品試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自GibcoBRL Co.；LPS、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮、唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、Griess試劑購自Sigma-Aldrich；正相色譜硅膠（200～300目）、薄層色譜硅膠H、薄層色譜硅膠G購自青島海洋化工有限公司；大孔樹脂（D-101，天津允開樹脂科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（上海山浦化工有限公司）；YMC Gel ODS-A-HG（50 μm，日本YMC公司）。紫鉚因（butein）為韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院及天然產(chǎn)物研究室自制（HPLC檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）。

1.3 藥材

糙葉五加根于2019年8月采自湖南省婁底市新化縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉向前教授鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加(Oliv.) Harms的根。

1.4 細(xì)胞株

小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞來源于韓國圓光大學(xué)Park Hyun教授實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 不同極性溶劑提取物的制備

取糙葉五加根干燥粉碎（10.0 kg），依次用正己烷、醋酸乙酯、正丁醇加熱回流提取，濾過，濾液減壓回收溶劑得正己烷提取物（AH-RH，89.5 g）、醋酸乙酯提取物（AH-RE，112.0 g）和正丁醇提取物（AH-RB，206.2 g），取 10 mg精密稱定。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞用高糖培養(yǎng)基DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，將培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期。

2.3 MTT法測定細(xì)胞毒性

采用 MTT 法，將對數(shù)生長期小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞接種于96孔板中（每孔1×105個(gè)細(xì)胞），置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫孵培養(yǎng)12 h后，給藥組分別加入不同質(zhì)量濃度的正己烷、醋酸乙酯、正丁醇提取物（終質(zhì)量濃度分別為50、100、200 μg/mL），加入LPS（1 μg/mL）進(jìn)行誘導(dǎo)，陽性對照組中加入LPS以及10 μmol/L的對照品紫鉚因（butein）。對照組均不加入受試藥物及LPS，但加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO，模型組加入LPS和培養(yǎng)液，空白組不含細(xì)胞只加入培養(yǎng)液。繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h后，取100 μL上清液，加入終質(zhì)量濃度為100 mg/mL的MTT，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5 h。形成的甲臜鹽使用酸化異丙醇溶解，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀540 nm處測定各孔吸光度（）值，以未處理組細(xì)胞（對照組）的值所對應(yīng)的細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對照－空白)

實(shí)驗(yàn)組為給藥組、模型組或陽性對照組

2.4 對NO的抑制作用

采用Griess法檢測各提取物對LPS誘導(dǎo)下的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO的抑制作用。取對數(shù)生長期的小膠質(zhì)（BV-2）細(xì)胞，以約1×105個(gè)/接孔種于96孔板中，在37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行給藥處理。設(shè)定對照組、模型組、陽性對照組及給藥組，陽性對照組和給藥組分別加入100 μL butein及不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)在該條件下進(jìn)行培養(yǎng)1 h后，除對照組外（加入等體積DMSO），其余各組均加入100 μL LPS（1 μg/mL）進(jìn)行刺激，溫孵12 h后，吸取各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液（100 μL）與相同體積的Griess試劑以十字交叉法混勻，在室溫下避光反應(yīng)5～10 min，在540 nm處使用酶標(biāo)儀測定混合物的值，計(jì)算NO含量。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

NO含量＝1－(給藥－對照)/對照

2.5 提取與分離

干燥的糙葉五加根（10.0 kg）粉碎后，用醋酸乙酯加熱回流提取2次（2 h/次），合并2次提取液并減壓回收溶劑，濃縮得到醋酸乙酯部位（112.0 g）浸膏。

醋酸乙酯部位（110.0 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜依次以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→1∶1）、二氯甲烷-甲醇（200∶1→1∶1）梯度洗脫進(jìn)行初分，2個(gè)洗脫系統(tǒng)分別得到15個(gè)組分（Fr. 1.1～1.15）和13個(gè)組分（Fr. 2.1～2.13）。

其中Fr. 1.8（石油醚-醋酸乙酯5∶1）經(jīng)過反復(fù)重結(jié)晶和純化得到化合物1（41.4 mg）；Fr. 1.11（石油醚-醋酸乙酯1∶1）經(jīng)過反相硅膠柱色譜（20%～100%甲醇梯度洗脫）得到8個(gè)亞組分Fr. 1.11.1～1.11.8，F(xiàn)r. 1.11.4經(jīng)反相硅膠柱色譜（40%甲醇等度洗脫）得到化合物2（2.5 mg），F(xiàn)r. 1.11.5（45%甲醇等度洗脫）和Fr. 1.11.8（70%甲醇等度洗脫）分別經(jīng)過半制備液相進(jìn)一步純化得到化合物3（6.6 mg）和4（1 mg）；Fr. 1.12（石油醚-醋酸乙酯1∶1）經(jīng)過反相硅膠柱色譜（30%～100%甲醇梯度洗脫）得到5個(gè)亞組分Fr. 1.12.1～1.12.5，F(xiàn)r. 1.12.3經(jīng)過半制備液相（60%甲醇等度洗脫）得到化合物5（6.4 mg）和6（6.7 mg），F(xiàn)r. 1.12.4（56%甲醇等度洗脫）和Fr. 1.12.5（50%甲醇等度洗脫）分別經(jīng)過半制備液相進(jìn)一步分離純化得到化合物7（24.7 mg）和8（1.6 mg）；Fr. 1.13（石油醚-醋酸乙酯1∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（30%～100%甲醇梯度洗脫），得2個(gè)亞組分Fr. 1.13.1～1.13.2，這2個(gè)亞組分再分別經(jīng)過半制備液相色譜（50%和60%甲醇等度洗脫）得到化合物9（0.4 mg）和10（11.9 mg）；Fr. 1.14（石油醚-醋酸乙酯1∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（20%～100%甲醇梯度洗脫），得2個(gè)亞組分Fr. 1.14.1～1.14.2，其中Fr. 1.14.1經(jīng)半制備液相色譜（56%甲醇等度洗脫）進(jìn)一步純化得到化合物11（3.3 mg）；Fr. 1.15（石油醚-醋酸乙酯1∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（10%～100%甲醇梯度洗脫），得4個(gè)亞組分EFr. 1.15.1～1.15.4，其中EFr. 1.15.2經(jīng)半制備液相色譜（60%甲醇等度洗脫）進(jìn)一步純化，得到化合物12（0.2 mg）。

Fr. 2.4（二氯甲烷-甲醇100∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（30%～100% 甲醇梯度洗脫），得2個(gè)亞組分Fr. 2.4.1～2.4.2，其中EFr. 2.4.1經(jīng)半制備液相色譜（50%甲醇等度洗脫）分離得到化合物13（1.6 mg），F(xiàn)r. 2.4.2 經(jīng)半制備液相（50%甲醇等度洗脫）得到化合物14（10.5 mg）和15（1.4 mg）；Fr. 2.7（二氯甲烷-甲醇100∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（30%～100%甲醇梯度洗脫），得2個(gè)亞組分EFr. 2.7.1～2.7.2，EFr. 2.7.1經(jīng)半制備液相（42%甲醇等度洗脫）得到化合物16（2.5 mg）；Fr. 2.8（二氯甲烷-甲醇50∶1）經(jīng)反相硅膠柱色譜（30%～100%甲醇梯度洗脫），得3個(gè)亞組分EFr. 2.8.1～2.8.3，其中EFr. 2.8.2經(jīng)半制備液相（48%甲醇等度洗脫）得到化合物17（4.8 mg）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針晶（醋酸乙酯）。1H-NMR (500 MHz, C3D6O): 6.90 (2H, d,= 1.7 Hz, H-2, 2?), 6.87 (2H, dd,= 8.0, 1.7 Hz, H-6, 6?), 6.80 (2H, d,= 7.9 Hz, H-5, 5?), 5.97 (4H, s, -OCH2O-×2), 4.68 (2H, d,= 4.1 Hz, H-7, 7?), 4.20 (2H, dd,= 9.1, 7.0 Hz, H-9α, 9?α), 3.82 (2H, dd,= 9.2, 3.8 Hz, H-9β, 9?β), 3.10～3.02 (2H, m, H-8, 8?)；13C-NMR (125 MHz, C3D6O): 148.8 (C-4, 4?), 147.8 (C-3, 3?), 136.8 (C-1, 1?), 120.1 (C-6, 6?), 108.7 (C-5, 5?),107.3 (C-2, 2?), 101.9 (-OCH2O-×2), 86.4 (C-7, 7?), 72.2 (C-9, 9?), 55.3 (C-8, 8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物1為 (＋)-芝麻素。

化合物2：黃色結(jié)晶粉末。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 9.64 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 7.57 (1H, d,= 15.8 Hz, H-3), 7.38 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2?), 7.21 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6?), 6.92 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5?), 6.65 (1H, dd,= 15.8, 7.7 Hz, H-2), 3.93 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 193.9 (C-1), 154.0 (C-3), 150.8 (C-4?), 148.9 (C-3?), 127.5 (C-1?), 127.1 (C-2), 124.8 (C-6?), 116.2 (C-5?), 111.6 (C-2?), 56.4 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物2為松柏醛。

化合物3：無色針晶（甲醇-水）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 6.84 (1H, s, H-6), 6.79 (2H, s, H-2, 3), 5.97 (2H, s, -OCH2O), 4.60 (1H, d,= 6.8 Hz, H-7), 4.53～4.46 (1H, m, H-9β), 4.38～4.28 (2H, m, H-9?β, 9α), 4.19 (1H, dd,= 9.4, 3.7 Hz, H-9?α), 3.43 (1H, td,= 8.9, 3.8 Hz, H-8), 3.13～3.04 (1H, m, H-8?)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有13個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的13個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 178.2 (C-7?), 148.4 (C-5), 147.9 (C-4), 132.9 (C-1), 119.8 (C-2), 108.5 (C-3), 106.5 (C-6), 101.4 (-OCH2O-), 86.2 (C-7), 70.2 (C-9), 69.9 (C-9?), 48.5 (C-8), 46.2 (C-8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物3為acuminatolide。

化合物4：淡黃色粉末。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 7.53 (1H, dd,= 8.2, 1.7 Hz, H-6), 7.45 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.97 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2?), 6.89 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.84 (1H, dd,= 7.9, 1.5 Hz, H-6?), 6.78 (1H, d,= 7.9 Hz, H-5?), 6.07 (2H, s, 3, 4-OCH2O-), 5.96 (2H, s, 3?, 4?-OCH2O-), 4.60 (1H, d,= 9.0 Hz, H-7?), 4.29～4.24 (1H, m, H-9β), 4.16～4.14 (2H, m, H-9α), 4.14～4.12 (1H, m, H-8),3.73 (1H, dd,= 11.2, 4.8 Hz, H-9?β), 3.65 (1H, dd,= 11.2, 5.8 Hz, H-9?α), 2.89 (1H, m, H-8?)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 196.3 (C-7), 170.9 (C=O), 152.4 (C-4), 148.7 (C-3), 148.2 (C-3?), 147.7 (C-4?), 134.0 (C-1?), 131.5 (C-1), 124.9 (C-6), 120.6 (C-6?), 108.4 (C-2), 108.3 (C-5), 108.2 (C-5?), 107.3 (C-2?), 102.2 (-OCH2O-), 101.2 (-OCH2O-), 84.2 (C-7?), 71.1 (C-9), 63.2 (C-9?), 50.3 (C-8?), 49.6 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物4為芝麻素酮。

化合物5：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 3.67 (1H, s, H-10), 0.89 (6H, t,= 6.6 Hz, CH, H-1, 29)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 71.1 (C-10), 37.1 (C-9, 11), 31.6 (C-3, 27), 24.9 (C-8, 12), 22.5 (C-2, 28), 14.0 (C-1, 29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物5為10-nonacosamnol。

化合物6：黃色粉末。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.86 (1H, t,= 17.2 Hz, -NH), 3.69 (1H, s, H-4), 2.86 (1H, dd,= 18.0, 6.7 Hz, -OH), 2.54 (1H, dd,= 18.0, 3.9 Hz, H-1?), 2.35 (3H, m, H-2), 1.66 (4H, m, H-3), 1.56～1.49 (2H, m, H-5), 1.43～1.28 (8H, m, H-6～9), 0.91 (3H, t,= 6.8 Hz, H-10)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 174.8 (C-1), 71.8 (C-4), 37.7 (C-5), 33.2 (C-3), 32.2 (C-2), 31.6 (C-8), 29.0 (C-7), 28.9 (C-10), 27.8 (C-1?), 25.2 (C-6), 22.5 (C-9), 14.0 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物6為 (±)--甲基-4-羥基癸酰胺。

化合物7：淡黃色油狀物。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 6.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5?), 6.69 (1H, d,= 2.2 Hz, H-5), 6.68 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2?), 6.58 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6?), 6.57 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 4.10 (1H, dd,= 8.8, 7.3 Hz, H-9a), 3.91～3.86 (1H, m, H-9b), 3.80 (3H, s, 3?-OCH3), 3.79 (3H, s, 3?-OCH3), 2.93 (1H, dd,= 14.0, 5.3 Hz, H-7?a), 2.68～2.60 (2H, m, H-8?), 2.54 (1H, d,= 2.4 Hz, H-7), 2.53～2.50 (1H, m, H-8)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有20個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的20個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 179.0 (C-9?), 148.3 (C-3?), 148.3 (C-3), 146.2 (C-4?), 146.0 (C-4), 131.1 (C-1), 130.5 (C-1?), 122.9 (C-6?), 122.0 (C-6), 115.7 (C-5), 115.6 (C-5?), 113.7 (C-2?), 113.0 (C-2), 71.6 (C-9), 56.2 (3-OCH3), 56.2 (3?-OCH3), 47.0 (C-8?), 42.2 (C-8), 38.4 (C-7), 35.1 (C-7?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18-19]，故鑒定化合物7為羅漢松脂素。

化合物8：1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 6.92 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2?), 6.89 (2H, m, H-5?), 6.81 (2H, m, H-6?), 6.73 (1H, m, H-2??), 4.66 (2H, dd,= 25.4, 4.8 Hz, H-2, 6), 4.21 (2H, m, H-4a, 8a), 3.81 (2H, m, H-4b, 8b), 3.06 (2H, m, H-1, 5)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有19個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的19個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 147.9 (C-3?), 146.9 (C-4?), 143.8 (C-3??), 142.1 (C-4??), 136.1 (C-1?), 133.6 (C-1??), 119.2 (C-6?), 117.5 (C-6??), 114.4 (C-5??), 113.6 (C-2??), 107.8 (C-5?), 106.4 (C-2?), 101.1 (O-CH2-O), 85.6 (C-2), 85.5 (C-6), 71.5 (C-4), 71.1 (C-8), 54.6 (C-1), 54.3 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，故鑒定化合物8為(1,2,5,6)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylene-dioxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo[3,3,0] octane。

化合物9：白色結(jié)晶（甲醇-水）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 5.54 (2H, s, H-1), 3.98 (1H, s, H-2), 3.67 (1H, s, H-3)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有8個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的8個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 143.3 (C-2), 114.0 (C-1), 36.7 (C-3), 31.9 (C-6), 29.7 (C-5), 29.4 (C-4), 22.7 (C-7), 14.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21]，故鑒定化合物9為1-辛烯。

化合物10：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 6.93～6.84 (2H, m, H-2, 6?), 6.83-6.76 (2H, m, H-5, 3?), 6.71 (2H, d,= 8.0 Hz, H-6, 2?), 5.97 (2H, s, -OCH2O), 4.65 (2H, dd,= 24.9, 4.7 Hz, H-7, 7?), 4.22 (1H, d,= 6.3 Hz, H-9β), 4.17 (1H, d,= 6.3 Hz, H-9?β), 3.83～3.76 (3H, m, -OCH3), 3.04 (2H, brs, H-8, 8?)。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 148.8 (C-4?), 147.8 (C-4), 145.9 (C-3?), 145.2 (C-3), 137.0 (C-1?), 134.5 (C-1), 120.1 (C-6), 118.4 (C-2?), 114.2 (C-5?), 108.7 (C-5), 107.3 (C-2), 102.0 (-OCH2O-), 86.5 (C-7), 86.4 (C-7?), 72.4 (C-9), 72.0 (C-9?), 55.5 (-OCH3), 55.2 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[22]，故鑒定化合物10為胡椒醇。

化合物11：無色油狀物。1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 6.95 (2H, d,= 1.9 Hz, H-2, H-2?), 6.81 (2H, dd,= 8.1, 2.0 Hz, H-6, 6?), 6.77 (2H, d,= 8.1 Hz, H-5, 5?), 4.71 (2H, d,= 4.4 Hz, H-7, 7?), 4.23 (2H, dd,= 9.1, 6.9 Hz, H-9a, 9?a), 3.86 (6H, s, 2×-OCH3), 3.77 (2H, dd,= 9.1, 3.7 Hz, H-9b, 9?b), 3.19～3.08 (2H, m, H-8, 8?)。13C-NMR (125 MHz, CD3OD), 149.1 (C-3, 3?), 147.3 (C-4, 4?), 133.8 (C-1, 1?), 120.1 (C-6, 6?), 116.1 (C-5, 5?), 110.9 (C-2, 2?), 87.5 (C-7, 7?), 72.6 (C-9, 9?), 56.4 (2×-OCH3), 55.4 (C-8, 8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[23]，故鑒定化合物11為 (?)-松脂醇。

化合物12：淡黃色油狀物。1H-NMR (500 MHz, C3D6O): 9.84 (1H, s, H-7?), 7.53 (1H, dd,= 1.5, 1.0 Hz, H-2?), 7.43 (1H, d,= 1.5 Hz, H-6?), 7.06 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.83 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.80 (1H, dd,= 8.1, 2.2 Hz, H-6), 5.70 (1H, d,= 6.8 Hz, H-7), 3.93 (3H, s, 3?-OCH3), 3.85 (2H, d,= 5.1 Hz, H-9), 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.63 (1H, m, H-8)。13C-NMR和DEPT數(shù)據(jù)證實(shí)了18個(gè)碳的存在。13C-NMR (125 MHz, C3D6O): 191.0 (C-7?), 154.9 (C-4?), 148.5 (C-4), 147.7 (C-3?), 145.8 (C-5?), 133.4 (C-1), 132.4 (C-1?), 131.2 (C-3), 121.5 (C-2?), 119.8 (C-6), 115.8 (C-5), 113.3 (C-6?), 110.6 (C-2), 89.9 (C-7), 64.2 (C-9), 56.3 (-OCH3), 56.3 (-OCH3), 53.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[24-25]，故鑒定化合物12為榕醛。

化合物13：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 9.82 (1H, s, -CHO), 7.24 (2H, s, H-2, 6), 3.92 (6H, s, -OCH3×2)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有9個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 191.1 (-CHO), 149.0 (C-3, 5), 143.2 (C-4), 129.1 (C-1), 107.8 (C-2, 6), 56.7 (OCH3×2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[26]，故鑒定化合物13為丁香醛。

化合物14：淡黃色油狀物。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 7.11 (2H, s, 4, 4?-OH), 6.68 (4H, s, H-2, 2?, 6, 6?), 4.67 (2H, d,= 2.9 Hz, H-7, 7?), 4.29～4.16 (2H, m, H-9, 9?), 3.82 (12H, s, OCH3-3, 3?, 5, 5?), 3.10 (2H, s, H-8, 8?)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示結(jié)構(gòu)中有22個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O), 148.7 (C-3, 3?, 5, 5?), 136.2 (C-4, 4?), 133.3 (C-1, 1?), 104.5 (C-2, 2?, 6, 6?), 86.8 (C-7, 7?), 72.4 (C-9, 9?), 56.7 (3, 3?-OCH3, C-5, 5?), 55.3 (C-8, 8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[27-28]，故鑒定化合物14為丁香脂醇。

化合物15：白色粉末。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 7.08 (2H, d,= 13.3 Hz, H-2?, 6?), 6.69 (2H, s, H-2, H-6), 4.83 (1H, d,= 5.9 Hz, H-7), 4.36 (1H, d,= 7.0 Hz, H-7?), 4.13 (1H, d,= 9.5 Hz, H-9a), 3.86 (2H, dd,= 9.7, 3.5 Hz, H-9b, 9?b), 3.83 (12H, s, H-3, 3?, 5, 5?-OMe), 3.22 (1H, t,= 8.7 Hz, H-8)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示結(jié)構(gòu)中有22個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 148.7 (C-3?, 5?), 148.6 (C-3, 5), 136.3 (C-1?), 135.7 (C-4?), 133.4 (C-4), 130.4 (C-1), 104.5 (C-2?, 6?), 104.1 (C-2, 6), 88.7 (C-7?), 82.8 (C-7), 71.6 (C-9), 70.2 (C-9?), 56.7 (3, 3?, 5, 5?-OMe), 55.7 (C-8?), 50.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[29]，故鑒定化合物15為 (?)-表丁香脂素。

化合物16：灰白色粉末。1H-NMR (500 MHz, C3D6O), 9.78 (1H, s, -CHO), 7.36 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 7.34 (1H, d,= 1.9 Hz, H-6), 7.00 (1H, d,= 7.9 Hz, H-5)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有7個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的7個(gè)碳原子。13C-NMR (125 MHz, C3D6O), 191.2 (-CHO), 152.3 (C-4), 146.4 (C-3), 131.0 (C-1), 125.5 (C-6), 116.1 (C-2), 115.1 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[30-31]，故鑒定化合物16為原兒茶醛。

化合物17：褐色結(jié)晶性粉末。1H-NMR (600 MHz, C3D6O): 7.53 (1H, s, H-2), 7.48 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 6.90 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5)。13C-NMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)提示有7個(gè)碳信號，分別對應(yīng)結(jié)構(gòu)中的7個(gè)碳原子。13C-NMR (150 MHz, C3D6O): 167.8 (-COOH), 150.7 (C-4), 145.5 (C-3), 123.7 (C-6), 123.1 (C-1), 117.5 (C-2), 115.7 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[32]，故鑒定化合物17為原兒茶酸。

3.2 糙葉五加根提取物抗神經(jīng)炎活性篩選研究

3.2.1 糙葉五加根各提取物在LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞模型下的細(xì)胞毒性 為了明確糙葉五加根AH-RH、AH-RE、AH-RB對BV-2細(xì)胞的影響，通過MTT法測定不同濃度的糙葉五加根各提取物有無細(xì)胞毒性，以確定安全的藥物濃度。MTT實(shí)驗(yàn)表明（圖1），各組受試藥物的不同質(zhì)量濃度均能提高由LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥所降低的細(xì)胞活力，且細(xì)胞存活率均大于60%，因此，可將50、100、200 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度梯度。

與對照組相比：#P＜0.05 ##P＜0.01；與LPS組相比：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同。

3.2.2 糙葉五加根各提取物對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的影響 炎癥反應(yīng)的發(fā)生伴隨著大量NO的生成，因此，NO被廣泛用作判斷炎癥反應(yīng)是否發(fā)生的篩選指標(biāo)。本研究以LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO為模型對糙葉五加根各粗提物進(jìn)行抗炎活性初篩，結(jié)果如圖2所示，與對照組比較，模型組NO濃度顯著升高；與模型組相比，各粗提物均可顯著降低NO水平，其中AH-RE的抑制效果最佳，當(dāng)AH-RE的藥物濃度為100 μg/mL時(shí)，NO水平最低（2.099 μmol/L）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對AH-RE部位分離純化的化合物進(jìn)行探討和研究，進(jìn)一步明確其發(fā)揮抗神經(jīng)炎作用的主要活性成分。

3.3 糙葉五加根中化合物1和13的抗神經(jīng)炎活性驗(yàn)證

根據(jù)上述各粗提物抗神經(jīng)炎活性初步篩選結(jié)果，對活性較好的AH-RE部位進(jìn)一步分離純化得到17個(gè)化合物，其中分離得到的化合物1、13分別被鑒定為芝麻素（sesamin）和丁香醛（syringaldehyde）。芝麻素是從芝麻中提取出來的一種木脂素，現(xiàn)代研究表明，芝麻素具有抗氧化、抗衰老、調(diào)血脂、抗高血壓等作用[33-35]；丁香醛是一種黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抗高血糖等多種生理活性[36-37]。本課題組前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，從糙葉五加果實(shí)中分離的木脂素類對小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的產(chǎn)生具有良好的抑制作用[38]。有研究指出，多酚類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物能夠通過血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[39-40]。因此，本研究以分離自糙葉五加根AH-RE部位的化合物芝麻素和丁香醛為主要研究對象，基于LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞作為抗神經(jīng)炎活性篩選模型，分別對兩者所設(shè)定的藥物濃度區(qū)間進(jìn)行了細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)并測定了其對由LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用，初步挖掘芝麻素和丁香醛的抗神經(jīng)炎的潛在活性能力。

圖2 糙葉五加根各提取物對NO抑制作用(, n = 3)

3.3.1 芝麻素和丁香醛在LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞模型下的細(xì)胞毒性 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知（圖3、4），在5～80 μmol/L下，與對照組相比，芝麻素和丁香醛以此工作濃度梯度對BV-2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)會對該細(xì)胞系的細(xì)胞活力產(chǎn)生一定影響但存活率均大于50%，因此，可將5～80 μmol/L的藥物濃度設(shè)置為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度梯度。

3.3.2 芝麻素和丁香醛對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知（圖5、6），與對照組相比，模型組的NO水平明顯升高，與模型組相比，不同濃度（5～80 μmol/L）的芝麻素和丁香醛對BV-2細(xì)胞處理后，NO水平均呈劑量相關(guān)性下降，表明芝麻素和丁香醛均能抑制NO的生成，意味著芝麻素和丁香醛對神經(jīng)炎可能有一定的治療作用。

4 討論

《湖南省中藥地方標(biāo)準(zhǔn)》將糙葉五加根以“五加皮”收載，是一種具有祛風(fēng)濕、滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀之功效的抗風(fēng)濕藥物。本課題組已圍繞糙葉五加葉、花、果實(shí)、根莖等做了大量研究，表明糙葉五加具有良好的抗炎活性。結(jié)合本研究前期對各粗提物的抗炎實(shí)驗(yàn)的初步篩選，表明糙葉五加根醋酸乙酯提取物有更好的抗炎效果。因此，本研究進(jìn)一步就糙葉五加根AH-RE的化學(xué)成分進(jìn)行毒性、抗神經(jīng)炎作用方面的研究。通過常規(guī)分離手段，共分離得到17個(gè)化合物，包括10個(gè)木脂素類、3個(gè)酚類、1個(gè)苯丙素類、3個(gè)其他類化合物。為了進(jìn)一步明確糙葉五加根抗神經(jīng)炎的主要活性成分，結(jié)合本課題組前期的研究成果，選取分離自抗炎活性最佳的AH-RE部位中的化合物芝麻素和丁香醛，利用LPS刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的體外炎癥模型對其進(jìn)行抗炎活性驗(yàn)證，結(jié)果表明，證明芝麻素和丁香醛具有一定的抗炎活性，可作為潛在的抗神經(jīng)炎藥物進(jìn)行開發(fā)。通過此實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對糙葉五加的化學(xué)成分和藥理活性有了更全面的認(rèn)識，明確其抗神經(jīng)炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為糙葉五加根的合理使用及深層次的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

圖3 芝麻素對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的影響(, n = 3)

圖4 丁香醛對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的影響(, n = 3)

圖5 芝麻素對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的影響(, n = 3)

圖6 丁香醛對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的影響(, n = 3)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Heneka M T, Kummer M P, Latz E. Innate immune activation in neurodegenerative disease [J]., 2014, 14(7): 463-477.

[2] de Waal G M, Engelbrecht L, Davis T,. Correlative light-electron microscopy detects lipopolysaccharide and its association with fibrin fibres in Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and type 2 diabetes mellitus [J]., 2018, 8(1): 16798.

[3] Guo Y S, Liang P Z, Lu S Z,. Extracellular αB-crystallin modulates the inflammatory responses [J]., 2019, 508(1): 282-288.

[4] 王超, 張篤偉, 徐沖. 神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系探究 [J]. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志, 2017, 4(4): 655.

[5] Park T, Chen H Z, Kevala K,. N-docosahexaenoylethanolamine ameliorates LPS-induced neuroinflammation via cAMP/PKA-dependent signaling [J]., 2016, 13(1): 284.

[6] Wang J, Li L X, Wang Z,. Supplementation of lycopene attenuates lipopolysaccharide-induced amyloidogenesis and cognitive impairments via mediating neuroinflammation and oxidative stress [J]., 2018, 56: 16-25.

[7] 馮勝, 劉向前, 張偉蘭, 等. RP-HPLC法測定糙葉五加不同部位中刺五加苷B和E [J]. 中草藥, 2011, 42(6): 1144-1146.

[8] Zhang X D, Liu X Q, Kim Y H,. Chemical constituents and their acetyl cholinesterase inhibitory and antioxidant activities from leaves of: Potential complementary source against Alzheimer’s disease [J]., 2014, 37(5): 606-616.

[9] 李小軍, 金官佑, 張曉丹, 等. 糙葉五加果實(shí)乙酸乙酯萃取部位化學(xué)成分及抗炎活性研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2020, 32(3): 427-434.

[10] 李小軍, 吳賢哲, 金倫喆, 等. 糙葉五加花化學(xué)成分及其抗炎活性 [J]. 中成藥, 2019, 41(8): 1856-1862.

[11] 李小軍, 金官佑, 吳賢哲, 等. 糙葉五加莖化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(5): 1055-1060.

[12] Kassim N K, Rahmani M, Ismail A,. Antioxidant activity-guided separation of coumarins and lignan from(Rutaceae) [J]., 2013, 139(1/2/3/4): 87-92.

[13] 馬永鵬, 張紅霞, 孫果, 等. 勐臘毛麝香化學(xué)成分研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(8): 1376-1381.

[14] Zhang W J, Wang Y, Geng Z F,. Antifeedant activities of lignans from stem bark ofDC. against[J]., 2018, 23(3): 617.

[15] 殷軍, 劉志惠, 王勇, 等. 綿萆薢中兩個(gè)新二芳基庚酮類化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2006, 8(2): 16-19.

[16] Zhang W, Lou H X, Li G Y,. A new triterpenoid fromBroth [J]., 2003, 5(3): 189-195.

[17] Shimotori Y, Nakahachi Y, Inoue K,. Synthesis of optically active γ-lactones via lipase-catalyzed resolution [J]., 2007, 22(5): 421-429.

[18] 王威, 劉小紅, 高華, 等. 東北鐵線蓮地上部位化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2014, 45(17): 2440-2446.

[19] Sun Y, Liu Y, Sun Y P,. Lanicepsides C-E from the aerial part ofOsbeck [J]., 2020, 37: 95-100.

[20] Urata H, Nishioka Y, Tobashi T,. First chemical synthesis of antioxidative metabolites of sesamin [J]., 2008, 56(11): 1611-1612.

[21] Couperus P A, Clague A D H, van Dongen J P C M,.13C chemical shifts of some model olefins [J]., 1976, 8: 426-431.

[22] Liu H Y, He H P, Yang X W,. Chemical constituents of the flowers of[J]., 2007, 19: 423-426.

[23] In S J, Seo K H, Song N Y,. Lignans and neolignans from the stems ofand their neuroprotective and anti-inflammatory activity [J]., 2015, 38(1): 26-34.

[24] Li Y C, Kuo Y H. Four new compounds, ficusal, ficusesquilignan A, B, and ficusolide diacetate from the heartwood of[J]., 2000, 48(12): 1862-1865.

[25] Zhang P M, Zhang C, Zeng K W,. Lignans and flavonoids from[J]., 2018, 27(6): 429-435.

[26] 任慧, 徐巧林, 董麗梅, 等. 南美蟛蜞菊中的酚酸類化學(xué)成分 [J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2015, 23(4): 469-473.

[27] Wang L Q, You X Z, Zhou L,. Lignans fromMarkgr. f. Megalocarpua [J]., 2009, 45(3): 424-426.

[28] Bisoli E, Freire T V, Yoshida N C,. Cytotoxic phenanthrene, dihydrophenanthrene, and dihydrostilbene derivatives and other aromatic compounds from[J]., 2020, 25(14): 3154.

[29] 梁瑞蘭, 史國茹, 庾石山. 大風(fēng)子中木脂素類化學(xué)成分研究 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(7): 1397-1402.

[30] Li H B, Zhou C X, Pan Y X,. Evaluation of antiviral activity of compounds isolated fromand[J]., 2005, 71(12): 1128-1133.

[31] 粟杰, 馮艷, 林炳鋒, 等. 刺五加化學(xué)成分的分離與鑒定[J]. 中草藥, 2021, 52(16): 4783-4788.

[32] Dao P T A, Hai N X, Nhan N T,. Study on DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation inhibitory activities of Vietnamese medicinal plants [J]., 2012, 18(1): 1-7.

[33] Ruankham W, Suwanjang W, Wongchitrat P,. Sesamin and sesamol attenuate H2O2-induced oxidative stress on human neuronal cells via the SIRT1-SIRT3-FOXO3a signaling pathway [J]., 2021, 24(2): 90-101

[34] Dalibalta S, Majdalawieh A F, Manjikian H. Health benefits of sesamin on cardiovascular disease and its associated risk factors [J]., 2020, 28(10): 1276-1289.

[35] Ali B H, Al Salam S, Al Suleimani Y,. Ameliorative effect of sesamin in cisplatin-induced nephrotoxicity in rats by suppressing inflammation, oxidative/nitrosative stress, and cellular damage [J]., 2020, 69(1): 61-72.

[36] 呂強(qiáng)華. 丁香醛對沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的抑制作用及機(jī)制 [D]. 長春: 吉林大學(xué), 2020.

[37] Bozkurt A A, Mustafa G, Tar?k A,. Syringaldehyde exerts neuroprotective effect on cerebral ischemia injury in rats through anti-oxidative and anti-apoptotic properties [J]., 2014, 9(21): 1884-1890.

[38] 唐思琪, 羅姣, 黃浩, 等. 糙葉五加正丁醇萃取部位抗炎活性成分研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2021, 33(4): 598-606.

[39] 潘春杏. 氧化白藜蘆醇對LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制 [D]. 廣州: 廣東工業(yè)大學(xué), 2021.

[40] 徐靜嫻. 白藜蘆醇對脂質(zhì)炎癥刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的體外研究 [D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2021.

Chemical constituents of roots ofisolated based on BV-2 microglia model

CHEN Yang, XIAO Jin, JIANG Shiqin, LUO Jiao, LIU Xiangqian

School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To study the chemical constituents and anti-neuritis activity of the root of.A neuroinflammation model was established using lipopolysaccharide (LPS)-induced BV-2 microglial cells, and cytotoxicity was measured using MTT method. The n-hexane, ethyl acetate, and n-butanol extracts from the roots ofwere screened for activity to determine the active site. Based on the screening results, the optimal active site was further separated and purified using column chromatography, D101 macroporous resin, and semi-preparative solution methods. Based on the physicochemical properties and obtained spectral data, the structure of compound was identified.The best activity was observed in the ethyl acetate extract site, from which 17 compounds were isolated and identified as (＋)-sesamin (1), coniferaldehyde (2), acuminatolide (3), sesaminone (4), 10-nonacosanol (5), rac--methyl-4-hydroxydecanamide (6), matairesinol (7), (1,2,5,6)-6-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-(3,4-methylenedioxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3,3,0]octane (8), 1-octene (9), piperitol (10), (?)-pinoresinol (11), ficusal (12), syringaldehyde (13), syringaresinol (14), (?)-episyringaresinol (15), protocatechuyl aldehyde (16), protocatechuic acid (17), respectively. The isolated sesamin and syringaldehyde can reduce the release of NO in BV-2 microglia induced by LPS in a dose-dependent manner at cell tolerance concentrations (5—80 μmol/L).Compounds 3—10, 12, 15 were isolated from family Araliaceae for the first time. Compounds 3—10, 12, 15 were isolated from theMiq. for the first time. Compounds 2—12, 15—16 were isolated fromfor the first time. The monomeric compounds sesamin and syringaldehyde in the roots ofhave potential anti-neuroinflammatory activities.

(Oliv.) Harms; anti-neuroinflammatory activity;Miq; lignans; sesamin; syringaldehyde

R284.1

A

0253 - 2670(2024)08 - 2533 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.004

2023-10-07

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2024JJ7357）；湖南省科技廳普惠性政策與創(chuàng)新環(huán)境建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2022ZK4039）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)“十四五”重點(diǎn)學(xué)科-生物工程學(xué)科（校行發(fā)規(guī)字 [2023] 2號）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（QL20220186）

陳 楊，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锘钚猿煞盅芯?。Tel: 16673229122 E-mail: 2200840698@qq.com

通信作者：劉向前，男，博士生導(dǎo)師，教授。Tel: 13308439949 E-mail: lxq0001cn@163.com。

[責(zé)任編輯 王文倩]