ITP患者PD-1/PD-L1表達特點及其在Treg與Breg細胞之間的相互作用機制分析*

許騰 崔彥杰 李智偉 劉紅春 郝立君

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心,新疆 烏魯木齊 830001)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種主要由免疫介導的血小板破壞和血小板生成障礙性疾病[1-2]。瘀點是ITP主要的臨床表現,嚴重者可以出現內臟甚至顱內出血,出血的風險隨著年齡的增長而增加[3]。ITP的發(fā)病機制,包括免疫、遺傳和環(huán)境因素等,體內自身抗體和血小板抗原結合形成免疫復合物,單核巨噬細胞系統的Fc受體與自身抗體的Fc段結合,介導巨噬細胞吞噬和血小板破壞是ITP的典型發(fā)病機制[4-5]。然而,越來越多的研究表明[6-8],調節(jié)性Treg細胞和Breg細胞的免疫缺陷(包括數量減少和/或免疫抑制功能減弱),可能是導致機體對血小板抗原失去免疫耐受性從而造成ITP的重要發(fā)病機制。

程序性細胞死亡蛋白-1(Programmed cell death receptor-1,PD-1)屬于CD28/B7家族,是一種重要的負調節(jié)因子,主要在活化的T細胞、B細胞、單核細胞、NK細胞、樹突狀細胞(DC)和Treg細胞表面表達。程序性細胞死亡蛋白配體-1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)是PD-1的配體,主要在活化的Breg細胞上廣泛表達,對抑制炎癥和預防自身免疫性疾病方面有重要作用[9]。而Treg細胞和Breg細胞均是具有獨特免疫調節(jié)作用的免疫細胞亞群,可通過分泌IL-4、IL-10及TGF-β等多種細胞因子,使ITP患者機體內免疫系統發(fā)生平衡偏移,進而促進抑制性細胞因子的分泌等作用,維持外周免疫耐受,可參與多種變態(tài)反應性疾病及腫瘤免疫的發(fā)病[10]。已知PD-1/PD-L1信號通路激活可以增加T細胞凋亡,抑制T細胞活化和增殖以維持免疫耐受。而在ITP患者中檢測出PD-1和PD-L1低表達[11]。因此,PD-1/PD-L1信號通路在ITP的發(fā)病機制中可能具有重要作用。本研究旨在探索ITP患者中PD-1和PD-L1表達特點,以及PD-1/PD-L1信號通路調節(jié)Treg細胞和Breg細胞的可能潛在機制,以期為ITP臨床治療方向提供有價值的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月—2022年1月在我院治療的ITP患者106例作為觀察組。納入標準：①診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[12]中的標準。②年齡≥18歲。③疾病分期均為新診斷ITP。④患者及家屬知情同意。排除標準：①入院前已接受過血小板輸注、丙種球蛋白、激素等治療。②合并有急慢性感染、系統性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等其他疾病。③繼發(fā)性血小板減少癥。同時選取同期健康志愿者100例作為對照組。

1.2 方法

采取ITP患者和健康人群空腹血7 mL,其中2 mL乙二胺四乙酸(EDTA)進行抗凝,1 mL用于Breg細胞和Treg細胞檢測,1 mL用于檢測PD-1、sPD-1和PD-L1,5 mL血2000 r/min低溫離心10 min,收集血清后立即儲存于-80 ℃冰箱,用于檢測TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17。

1.2.1 流式細胞術檢測Breg細胞和Treg細胞 Breg細胞檢測管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC標記的CD38、PE標記的CD19和PerCP標記的CD45各20 uL,APC標記的CD245 uL。Treg細胞檢測管吸取100 uL全血,然后依次加入FITC標記的CD4、PE標記的CD127和PerCP標記的CD3各20 uL,APC標記的CD255 uL。將檢測管避光放置15 min后加入2 mL紅細胞裂解液,溶血10 min后離心去上清液,再加入2 mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌離心去上清液,加入500 uL PBS重懸。使用MACSQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德國)進行檢測,使用FlowJo10.5分析檢測數據,計算Breg細胞占CD19+細胞的百分比和Treg細胞占CD4+細胞的百分比。

1.2.2 流式細胞術檢測PD-1 使用APC標記的CD3,Percp標記的CD4,FITC標記的CD8和PE標記的PD-1單克隆抗體。對于PD-L1檢測,使用PerCp標記的CD11c,PE標記的PD-L1和PE-cy7標記的HLA-DR單克隆抗體。將樣品在室溫下在黑暗中孵育15 min,然后用PBS洗滌2次,重懸,并在MACSQuant流式細胞儀(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德國)上進行分析。流式細胞儀提供的MACSQuant軟件用于數據分析。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 檢測sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17 取出儲存于-80 ℃冰箱的血樣本,將50 uL稀釋的標準樣品和待測樣品依次加入每個孔中,然后加入50 uL生物素標記的抗體。在37 ℃孵育1 h后,用磷酸鹽緩沖液吐溫-20(PBST)洗滌孔3次。之后,加入80 uL親和鏈霉素-HRP并在37 ℃下孵育30 min。用PBST洗滌3次后,將底物A和B各50 uL加入反應孔中,并在37 ℃下孵育10 min。然后通過加入50 uL終止液停止反應。用酶標儀測量OD 450值。sPD-1、TGF-β、IL-4、IL-10和IL-17抗體購自abcam公司。酶標儀為美國Molecu-lar公司SPECTCA MAX190。

1.3 病情程度判斷 輕度患者：血小板(PLT)≥50×109/L;中度患者：30×109/L≤PLT<50×109/L;重度患者：PLT<30×109/L[11]。本次研究ITP輕度患者32例,中度患者44例,重度患者30例。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、BMI一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較 觀察組Breg細胞百分比、Treg細胞百分比、TGF-b、IL-10和IL-4水平明顯低于對照組(P<0.05);觀察組Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率、sPD-1和IL-17水平明顯高于對照組(P<0.05);兩組sPD-L1水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較

2.3 觀察組不同病情患者Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較 觀察組重度患者Breg細胞百分比、Treg細胞百分比明顯低于輕度和中度患者(P<0.05),而Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率明顯高于輕度和中度患者(P<0.05);觀察組中度患者Breg細胞百分比、Treg細胞百分比明顯低于輕度患者(P<0.05),而Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率明顯高于輕度患者(P<0.05);觀察組不同病情患者TGF-β、sPD-1、sPD-L1、IL-10、IL-4和IL-17水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 觀察組不同病情患者Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較

2.4 相關性分析 將Breg細胞百分比、Treg細胞百分比等指標進行相關分析,結果顯示,Treg細胞表面PD-1陽性率與Breg細胞表面PD-L1陽性率呈正相關(r=0.466,P<0.05),見圖1。

圖1 相關分析圖

2.5 觀察組治療前后Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較 與治療前相比,觀察組治療后Breg細胞百分比、Treg細胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平有所升高(P<0.05),而Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率、sPD-1和IL-17水平有所降低(P<0.05),治療前后 sPD-L1水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 觀察組治療前后Treg細胞百分比、Breg細胞百分比等比較

3 討論

ITP的發(fā)病主要集中于歐美地區(qū),且可發(fā)生于任何年齡段,兒童期及老年期為ITP發(fā)病的高峰期[13]。ITP是由機體免疫失衡引起的自身免疫性疾病,包括免疫介導的血小板破壞,伴有不同程度的出血[14]。ITP的發(fā)生機制多樣復雜,涉及多個方面。在ITP的免疫發(fā)病機制中,T細胞仍處于中心階段,在抗血小板自身免疫的啟動、傳遞和維持中起著重要作用[15]。T細胞需要雙信號才能激活：T細胞抗原受體特異性識別抗原呈遞細胞呈遞的抗原肽,并為T細胞活化提供第一信號;然后,相應的受體與抗原呈遞細胞上的共刺激分子結合,提供第二激活信號。此外,T細胞活化過程中還存在負反饋調節(jié)機制,PD1/PD-L1通路即其中之一[16]。PD-1/PD-L1通路的慢性刺激可導致效應T細胞耗竭和功能障礙,防止過度免疫損傷,對維持信號通路免疫穩(wěn)態(tài)起重要的調節(jié)作用[17]。PD-1/PD-L1信號通路在ITP、多發(fā)性硬化、系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[18]。

Treg是CD4+T細胞的一個特殊亞群,可通過抑制免疫系統的激活,從而維持體內平衡和對自身抗原的耐受性,并在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[19]。Breg細胞是一種特殊的B細胞亞群,可以促進CD4+CD25-T細胞轉化為Treg細胞,并促進其分化[20]。Treg細胞和Breg細胞可以細胞之間的直接相互作用和細胞因子(如IL-10和TGF-β)的產生來抑制CD4+T細胞或CD8+T細胞的活化和增殖,并通過與效應T細胞和單核細胞的直接相互作用發(fā)揮調節(jié)作用[21-22]。免疫應答失衡和免疫耐受性喪失,在ITP的發(fā)病機制中也起重要作用[23]。輔助性T細胞(Th)亞群協調不同的免疫應答并介導不同細胞因子(IL-4)的活性,異常的Th細胞活性可能導致慢性炎癥和自身免疫性疾病[24]。本研究結果顯示,ITP患者治療后Breg細胞百分比、Treg細胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均有所升高(P<0.05),提示Breg細胞、Treg細胞數量及其異常功能等細胞免疫紊亂是ITP的重要機制?？紤]Breg細胞、Treg細胞明顯減少,使得分泌IL-10和TGF-β減少,從而減弱了對CD4+T細胞或CD8+T細胞的活化和增殖的抑制作用,破壞了Th1/Th2和CD4+/CD8+平衡狀態(tài),同時減少了Treg細胞的產生,使機體免疫耐受機制減弱[25]。本研究發(fā)現,觀察組Breg細胞百分比、Treg細胞百分比、TGF-β、IL-10和IL-4水平均明顯降低(P<0.05),且Breg細胞百分比、Treg細胞百分比的降低程度與ITP的嚴重程度呈正比(P<0.05)。

PD-1/PD-L1信號通路的激活抑制T細胞的增殖和細胞因子的產生,在調節(jié)免疫平衡和維持外周免疫耐受中起重要作用。PD-1和PD-L1有兩種形式,即分泌形式(sPD-1和sPD-L1)和膜結合形式[26]。可溶性程序性細胞死亡蛋白-1(sPD-1)是通過細胞膜表面PD-1磷酸水解獲得的PD-1的可溶性形式,在免疫相關性疾病中高表達,被認為會阻斷PD-1/PD-L1信號通路[27]。而可溶性程序性細胞死亡蛋白配體-1(sPD-L1)可以通過保留IgV結構域來刺激PD-1,并能促進PD-1/PD-L1信號通路,從而抑制T細胞增殖和活化[28-29]。由Th17細胞分泌的IL-17,作用于不同的靶細胞,觸發(fā)炎癥介質的釋放,介導炎癥反應、自身免疫性疾病、腫瘤、移植排斥反應等疾病的發(fā)生[30-31]。本研究發(fā)現,觀察組Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率、sPD-1和IL-17水平均明顯升高(P<0.05),sPD-L1水平變化未見明顯差異(P>0.05)。Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率與ITP的嚴重程度呈正比。Treg細胞表面PD-1陽性率與Breg細胞表面PD-L1陽性率呈正相關。ITP患者治療后Treg細胞表面PD-1陽性率、Breg細胞表面PD-L1陽性率、sPD-1和IL-17水平降低(P<0.05),治療前后sPD-L1水平變化未見明顯差異(P>0.05)。提示PD-1/PD-L1信號通路及免疫應答失衡是ITP發(fā)生發(fā)展的重要機制。考慮sPD-1的產生增加,促進了PD-1/PD-L1信號通路的阻斷。雖然Treg細胞和Breg細胞表面的PD-1/PD-L1陽性率增加,但IL-17水平仍然升高,加強作用于不同的靶細胞,觸發(fā)炎癥介質的釋放,因此PD-1/PD-L1通路被有效阻斷,使T細胞過度增殖活化和促進細胞因子的產生,從而造成機體免疫耐受減弱和免疫應答失衡。

4 結論

ITP患者Treg細胞表面PD-1和 Breg細胞表面PD-L1陽性率明顯升高,與患者病情嚴重程度呈正相關,同時Treg細胞表面PD-1和 Breg細胞表面PD-L1表達之間存在相關性,可進一步研究。