血清miR-31、miR-155和CCL26在潰瘍性結(jié)腸炎中預(yù)后不良的診斷價值*

陳國雁 尚精娟 李敏虹 張慧君 劉建峰

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200137)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性非特異性結(jié)直腸炎,其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢,發(fā)病確切機制仍不清,可能與免疫、遺傳和外源性因素刺激等密切相關(guān)[1-2]。由于病程長,復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重患甚至最終發(fā)展為結(jié)腸癌。因此,早期了解潰瘍性結(jié)腸炎的病情和嚴(yán)重程度,有利于早期臨床治療和對疾病的控制[3]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA,參與了疾病發(fā)生發(fā)展過程,有研究顯示miR-31和miR-155在潰瘍性結(jié)腸炎中呈高表達(dá),并與趨化因子配體26(CCL26)的調(diào)節(jié)具有一定的聯(lián)系[4]。現(xiàn)已知CCL26是趨化因子的成員之一,是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子[5]。然而潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26異常表達(dá)是否對復(fù)發(fā)具有預(yù)測作用仍不清楚。本研究通過對潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26表達(dá),觀察其在潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1月—2020年6月在我院收治的潰瘍性結(jié)腸炎患者119例,根據(jù)Mayo評分將其分為活動期組(評分3～12分)65例和緩解期組(評分≤2分)54例。其中活動期組,男性35例,女性30例,年齡(23～68)歲,平均(42.27±5.83)歲;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月,根據(jù)Mayo評分將活動期組患者分為輕度亞組(3～5分)25例、中度亞組(6～10分)22例和重度亞組(11～12分)18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合潰瘍性結(jié)腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];均行腸鏡和病理學(xué)檢查,臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫性和腫瘤性疾病;潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)出血、穿孔、狹窄和梗阻等并發(fā)癥;心、肝和腎等臟器功能不全;孕婦和哺乳期婦女;精神性疾病和智力下降者。另選擇同期在我院健康體檢者45例為對照組,其中男性23例,女性22例,年齡(25～65)歲,平均(43.01±4.28)歲。本研究各組患者均簽署知情同意書,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本收集 患者入院時抽取肘靜脈血約5 mL左右,在室溫下靜置約20 min,然后采用3000 r/min的離心機離心10 min,離心半徑為15 cm,去上清液約3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待測,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清CCL26的表達(dá)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測血清中miR-31、miR-155 mRNA表達(dá)水平 采用TaqMan miRNA試劑盒提取細(xì)胞總的RNA,采用實時定量熒光PCR檢測血清中的miR-31和miR-155表達(dá)。并根據(jù)目標(biāo)基因的mRNA序列,設(shè)計引物,用設(shè)計軟件Primer express 3.0軟件設(shè)計反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,miR-31擴增引物正向：5′-GGCATAGCTGTTGAACTGGG-3′;擴增引物方向：5′-CGATCGTCAGCATCACTAGC-3′;miR-155擴增引物正向：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′;擴增引物方向：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′;U6擴增引物正向：5′-GCGCTTGTGCTTGATCTAA-3′;擴增引物方向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反轉(zhuǎn)錄后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,采用實時定量PCR儀上間隙擴增,反應(yīng)條件為在85 ℃反應(yīng)3 min,在85 ℃反應(yīng)20 s,在42 ℃反應(yīng)40 s,總共循環(huán)35次,采用2-ΔΔCt表示miR-31和miR-155的相對表達(dá)量。

1.2.3 潰瘍性結(jié)腸炎患者內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度指數(shù)(UCEIS) 根據(jù)血管紋理、出血和糜爛和潰瘍進(jìn)行評分。血管紋理：正常為0分;斑塊狀消失為1分;全部消失為2分;出血：無出血為0分;黏膜滲血1分;腸腔內(nèi)輕度出血為2分;腸腔內(nèi)重度出血為3分。糜爛和潰瘍：正常為0分;糜爛為1分;淺表潰瘍?yōu)?分;深部潰瘍?yōu)?分。總分為0～8分,分?jǐn)?shù)越高病情越嚴(yán)重。

1.2.4 隨訪 通過對病史、電話、微信和門診等方式對患者進(jìn)行隨訪,每個患者均隨訪滿2年,主要了解患者是否有復(fù)發(fā)、結(jié)腸出血、中毒性巨結(jié)腸或者惡變?yōu)轭A(yù)后不良,否則為預(yù)后良好。

1.2.5 觀察指標(biāo)比較及分析 比較各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的變化;分析各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的關(guān)系及影響潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良的單因素和多因素分析;評估血清miR-31、miR-155和CCL26水平在2年內(nèi)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生預(yù)后不良的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 活動期組65例,其中男性35例,女性30例,年齡(23～68)歲,平均(42.27±5.83)歲;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月;病變部位：直腸20例,乙狀結(jié)腸21例,左半結(jié)腸13例和全結(jié)腸11例;緩解期組54例,其中男性26例,女性28例,年齡(22～66)歲,平均(41.96±4.78);病程(4～33)月,平均(22.75±4.06)月;病變部位：直腸16例,乙狀結(jié)腸18例,左半結(jié)腸12例、全結(jié)腸8例;對照組45例,其中男性23例,女性22例,年齡(25～65)歲,平均(43.01±4.28)歲。3組在年齡和性別等基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,具有可比性(P<0.05)。

2.2 3組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比較 潰瘍性結(jié)腸炎活動期組血清miR-31、miR-155和CCL26水平明顯高于緩解期組和對照組(P<0.05),而緩解期組明顯高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 各組血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比較

2.3 血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的關(guān)系 血清miR-31、miR-155和CCL26水平隨著潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的增加而升高(P<0.05),見表2。

表2 血清miR-31、miR-155和CCL26水平與潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的關(guān)系

2.4 潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)預(yù)后不良的單因素分析 根據(jù)隨訪預(yù)后的不同分為預(yù)后良好組(40例)和預(yù)后不良組(25例),UCEIS評分>6分的比例預(yù)后不良組明顯高于預(yù)后良好組(P<0.01),而血清miR-31、miR-155和CCL26水平預(yù)后不良組明顯高于預(yù)后良好組

差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表3。

表3 潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)預(yù)后不良的單因素分析

2.5 潰瘍性結(jié)腸炎影響預(yù)后不良的多因素分析 將具有單因素分析具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)UCEIS評分、miR-31、miR-155和CCL26水平,根據(jù)是否出現(xiàn)預(yù)后不良進(jìn)行二元Logistics 回歸,發(fā)現(xiàn)UCEIS評分>6分,血清miR-31、miR-155和CCL26水平升高是發(fā)生潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 潰瘍性結(jié)腸炎影響預(yù)后不良的多因素分析

2.6 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)預(yù)后不良的診斷效能 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在診斷潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生預(yù)后不良具有較高的診斷效能,根據(jù)是否發(fā)生預(yù)后不良將上述指標(biāo)進(jìn)行二元Logistics回歸得y=1.45×XmiR-31+1.69×XmiR-155+1.32×XCCL26-26.76為聯(lián)合檢測指標(biāo),聯(lián)合檢測的靈敏度為80%,特異度為99.4%,AUC為0.963明顯高于單個指標(biāo)miR-31(z=2.727,P=0.006)、miR-155(z=3.012,P=0.003)和CCL26(z=2.091,P=0.036),而三個指標(biāo)之間的AUC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表5、圖1。

圖1 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)預(yù)后不良的AUC比較

表5 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)預(yù)后不良的診斷效能

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是腸道內(nèi)免疫耐受失衡,病變主要累及結(jié)腸黏膜層和黏膜下層,目前診斷主要依靠結(jié)腸鏡和相關(guān)評分量表的評估[7]。最為常見的腸鏡下UCEIS評分能夠反映疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[8],主要反映血管紋理、出血和糜爛和潰瘍的嚴(yán)重程度,相對在內(nèi)鏡直視下對潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評估,具有相對準(zhǔn)確和快速評估等特點[9]。本研究結(jié)果顯示UCEIS評分在潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良組明顯高于預(yù)后良好組,并發(fā)現(xiàn)UCEIS評分是潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良的獨立影響因素。但由于潰瘍性結(jié)腸炎具有反復(fù)發(fā)作,對病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的評估采用UCEIS評分具有一定局限性和患者的依從性較差[10-11]。因此,臨床上尋找簡單易行,已經(jīng)獲得的指標(biāo)在評價潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)后具有重要的臨床價值。

miR-31作為miRNA的成員之一,參與了機體免疫應(yīng)答多個環(huán)節(jié),與多種感染性疾病和自身免疫性疾病具有重要作用,在維持機體免疫平衡的穩(wěn)態(tài)具有重要作用[12-13],并發(fā)現(xiàn)miR-31在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的診療和預(yù)后具有密切關(guān)系,可能成為臨床監(jiān)測疾病的靈敏指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示潰瘍性結(jié)腸炎患者活動期患者血清miR-31表達(dá)明顯高于穩(wěn)定期患者,并且隨著疾病嚴(yán)重程度升高而升高,說明miR-31參與了潰瘍性結(jié)腸炎疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-31炎性腸病的研究中發(fā)現(xiàn)通過促進(jìn)Th1的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,抑制Th2細(xì)胞因子的過度轉(zhuǎn)錄,從而達(dá)到維持Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡。在潰瘍性結(jié)腸炎的組織中發(fā)現(xiàn)miR-31表達(dá)出現(xiàn)明顯升高,具有促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎疾病的發(fā)生發(fā)展[15-16]。在克羅恩病的研究中發(fā)現(xiàn)miR-31/IL-25信號軸的調(diào)節(jié),從而達(dá)到對Th1/Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控,并且阻斷miR-31的表達(dá)有助于克羅恩病的治療[17]。本研究結(jié)果顯示預(yù)后不良組患者血清miR-31表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好組,并且發(fā)現(xiàn)血清miR-31表達(dá)水平升高是2年內(nèi)出現(xiàn)預(yù)后不良的獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-31表達(dá)水平>6.72時,在預(yù)測潰瘍性結(jié)腸炎2年內(nèi)發(fā)生預(yù)后不良具有較高的診斷價值,其靈敏度為72%,特異度85%,AUC為0.820說明血清miR-31表達(dá)水平是潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后的重要指標(biāo)。

miR-155位于人體染色體22號,為非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄區(qū)的第三個外顯子內(nèi),在單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞活化時均有較高表達(dá),而將其敲除后T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能出現(xiàn)明顯受損,說明miR-155在淋巴細(xì)胞的發(fā)育和免疫功能的激活具有重要作用[18]。在潰瘍性結(jié)腸炎的研究發(fā)現(xiàn)血清或者組織出現(xiàn)miR-155的高表達(dá),并認(rèn)為miR-155在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中具有重要臨床意義[19-20]。本研究證實潰瘍性結(jié)腸炎活動期患者血清miR-155表達(dá)明顯高于穩(wěn)定期患者和對照組,并且發(fā)現(xiàn)隨著潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重升高而升高,說明miR-155表達(dá)水平是潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組血清miR-155表達(dá)明顯高于預(yù)后良好組,并認(rèn)為血清miR-155水平升高是潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良的獨立風(fēng)險因素。有研究顯示潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜呈高表達(dá),并促進(jìn)NF-κB信號通路的激活,介導(dǎo)機體釋放大量的炎癥因子參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展過程,在動物實驗中腸道灌入miR-155抑制劑后,結(jié)腸黏膜炎癥明顯降低[21-22]。本組研究發(fā)現(xiàn)血清miR-155水平>2.66時,其診斷潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后不良的靈敏度80%,特異度為70%,AUC為0.778說明在潰瘍性結(jié)腸炎診斷預(yù)后不良具有較高的效能。

CCL26屬于CC家族成員之一,是由77個氨基酸組成,其與CC趨化因子-3結(jié)合后,激活機體的嗜酸性粒細(xì)胞釋放組胺和炎癥因子,參與機體的過敏和炎癥反應(yīng),作為急慢性炎癥的評價指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示血清CCL26水平在潰瘍性結(jié)腸炎活動期組明顯緩解期組,并且隨著病情嚴(yán)重程度的升高而升高,并且發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良患者血清CCL26水平明顯高于預(yù)后良好患者,并且發(fā)現(xiàn)血清CCL26水平升高是預(yù)后不良的獨立危險因子。本研究顯示當(dāng)血清CCL26>9.66 pg/mL時,在預(yù)測潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生預(yù)后不良的靈敏度為80%,特異度為85%,AUC為0.886,說明CCL26在預(yù)測潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生預(yù)后不良具有較高的診斷效能。本研究還顯示聯(lián)合檢測miR-31、miR-155和CCL26水平在預(yù)測潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生預(yù)后不良具有更高的診斷效能,其靈敏度為80%,特異度為99.4%,AUC為0.963明顯優(yōu)于miR-31、miR-155和CCL26單個檢測水平,說明三者存在某種互補性,可能與均參與了潰瘍性結(jié)腸炎的病理生理過程有關(guān)。

4 結(jié)論

miR-31、miR-155和CCL26與潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度有關(guān),聯(lián)合檢測有助于提高對潰瘍性結(jié)腸炎2年內(nèi)發(fā)生預(yù)后不良的診斷價值。