改良型富血小板纖維蛋白促進脂肪移植存活的最適混合比例實驗研究*

劉翔宇 彭海濤 尹海林 田超 文銀亭 賀紅林 丁娜 袁怡君 李均

(川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院1.燒傷整形美容外科;2.婦科,四川 南充 637000)

百年前自體脂肪移植(Autologous fat transplantation,ADSCs)就已應(yīng)用于臨床[1],其臨床應(yīng)用常因脂肪組織移植塊缺血壞死及感染等因素而受到限制。吸脂術(shù)于上個世紀80年代問世,研究發(fā)現(xiàn)顆粒脂肪較塊狀脂肪的移植成活率大大提高[2]。Zuk等[3]于2001年首次詳細描述了ADSCs用于臨床的治療潛能,并推測其可能是一種改善皮膚結(jié)構(gòu)的方法。自體顆粒脂肪具有廣泛的來源、極小的排斥反應(yīng)、自然的外觀、柔軟的手感等特點,是理想的軟組織填充物。因此,自體脂肪移植術(shù)成為目前應(yīng)用最廣泛的整形美容外科技術(shù)之一[4]。但脂肪細胞移植的結(jié)果不可預料且多變,其移植后易吸收、存活率低且不穩(wěn)定仍是嚴重制約脂肪移植技術(shù)開展的主要原因[5-6]。富血小板纖維蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)作為富血小板血漿(Platelet-rich plasma,PRP)之后的新一代濃縮血小板血液制品,多項研究證實PRF持續(xù)釋放多種生長因子的時間長達4周[7-9]。據(jù)相關(guān)研究報道,富血小板纖維蛋白與自體脂肪顆粒的比重從1：2到1：25不等,跨度大且均有促進效果[10-12]。有學者通過實驗發(fā)現(xiàn)在移植術(shù)后的8到12周移植的脂肪顆粒與機體逐漸建立血供,而在12周以后將生成較為成熟的血管;且當上述比重達到1：10時,PRF促進脂肪移植物存活的效果達到最佳,1：5及1：15亦有一定的促進效果但都不及1：10[13]。在2014年Ghanaati等[14]降低了離心轉(zhuǎn)速并增加了離心時間,制成了改良型富血小板纖維蛋白(Advanced Platelet-rich Fibrin,A-PRF),避免了較大的離心力使血小板及白細胞的生物結(jié)構(gòu)遭到破壞,解決了PRF制備中發(fā)生的離心力過大導致部分WBC、PLT及各成分分布不均的不足,提高了A-PRF促進再生的潛能。近來有研究表明A-PRF在提高脂肪細胞存活率、減少炎癥因子作用及增加毛細血管生成率等方面均優(yōu)于PRF[15]。本實驗擬研究A-PRF促進脂肪移植物存活的最佳混合比例,達到脂肪存活率的最大化,以保證在損耗最小的情況下最大化發(fā)揮脂肪及血液等組織的作用并取得預期的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 本研究的脂肪組織及血液樣品都來自于2021年12月—2022年2月在南充市中心醫(yī)院整形美容外科行腹部抽脂術(shù)的患者。準入條件：年齡25～35歲,身體健康,無既往病史,半年來無影響實驗的長期藥物服用病史。樣本的獲取均告知并取得患方同意并簽字確認。

1.2 實驗動物 6周齡雌性SPF級BALA去胸腺裸鼠(下文稱“裸鼠”),購于川北醫(yī)學院動物實驗中心,飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中,所有實驗操作按川北醫(yī)學院動物實驗中心要求進行。本研究通過川北醫(yī)學院倫理委員會審核通過(倫理號：NSMC[2021]139號)。

1.3 實驗試劑 胎牛血清、I型膠原酶、F12培養(yǎng)基、裂紅素、雙抗(鏈霉素、青霉素)、0.25%胰蛋白酶購自BI公司,蘇木素染液、伊紅染液、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)、6孔細胞培養(yǎng)板購自于美國Corning公司,0.5%戊巴比妥鈉溶液由川北醫(yī)學院動物實驗中心配制提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 制備移植物 ①患者取平臥位,予以全身麻醉,消毒鋪巾,以利多卡因腫脹溶液進行腹部腫脹麻醉滿意后將3 mm直徑的抽脂針頭與30 mL的空針注射器相連接,手動于腹壁脂肪層進行放射狀分層抽吸,得到混合抽取物,無菌生理鹽水多次沖洗至無明顯血液,挑除纖維組織及肌肉組織,將處理好的脂肪組織裝至注射器內(nèi)備用。②在患者肘上5 cm處綁上壓脈帶,肘窩消毒,標記并于正中靜脈抽取血液,采集20 mL血液于無菌真空靜脈采血管中并立即以1500 r/min,離心14 min,得到的A-PRF凝膠靜置于靜脈采血管中。③從采血管中提取A-PRF凝膠并切碎,分別按A-PRF與脂肪的體積比為1：6、1：8、1：10、1：12、1：14將上述凝膠加入脂肪移植物中并充分混勻,分別裝于1 mL注射器中待用;另取僅含脂肪顆粒分裝于1 mL注射器中待用。

1.4.2 ADSCs分離培養(yǎng)及劃痕實驗 預熱搖床至37 ℃,將20 mL脂肪組織于超凈臺中轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,加入2 mL 0.1% Ⅰ型膠原酶混合均勻,將混合好的脂肪組織置于37 ℃恒溫搖床中震蕩40 min,40 min后取出離心管于超凈臺中加入10 mL胎牛血清終止消化,加入2 mL裂紅素靜置3 min,置于26 ℃離心機內(nèi)1000 r/min,離心10 min,丟棄上清液,將 F12完全培養(yǎng)基(其中含有體積分數(shù)為10%的胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素)加入其中重懸細胞沉淀后接種至培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)瓶放置于37 ℃恒溫,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng),待細胞融合至80%以上后傳代,取第三代ADSCs加入1 mL 0.25% 胰酶37 ℃消化、完全培養(yǎng)基終止消化、1500 r/min離心10 min,用無血清的F12培養(yǎng)基將細胞團制成細胞懸液,第三代ADSCs以1×106個/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,當細胞爬滿后,以200 μL移液管尖于培養(yǎng)板底層的細胞劃出一條水平的無細胞的空白區(qū)域,用PBS洗滌兩次,以1：6、1：8、1：10、1：12、1：14為濃度梯度于每孔加入A-PRF凝膠,分別記為1：6、1：8、1：10、1：12、1：14組,放入37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于0、48、72 h分別于顯微鏡下觀察細胞遷移率并記錄。遷移面積=(培養(yǎng)48、72 h的遷移面積-培養(yǎng)0 h的遷移面積)/培養(yǎng)0 h的空白面積。

1.4.3 隨機分組 隨機將60只6周齡SPF級雌性裸鼠分為5個組,每組12只,分組后將裸鼠以12只/籠飼養(yǎng)于23 ℃、晝夜12 h/12 h、自由進食及飲水的SPF環(huán)境中,飼養(yǎng)一周后進行建模。具體如下：裸鼠稱重,每只裸鼠腹腔以50 mg/kg注射為0.5%的戊巴比妥鈉溶液,75%的酒精將裸鼠背部皮膚消毒3次,鋪無菌單,1 mL的空針注射器連接注脂針,以多點、多層次、多方向注射的方式在術(shù)區(qū)分別均勻注射0.2 mL A-PRF與顆粒脂肪的混合物(A-PRF與脂肪的體積比為1：6、1：8、1：10、1：12、1：14),分別記為1：6、1：8、1：10、1：12、1：14組。

1.4.4 測量體積保留率及質(zhì)量保留率 在移植后的第4、8、12周,每組以斷頸法處死3只裸鼠,裸鼠臀部皮膚以75%酒精消毒3次,鋪無菌單,于脊柱中線做豎直切口并全層掀起裸鼠皮膚,以血管鉗逐層鈍性分離到移植物附近,將移植物連同包膜完整取出。將樣本放置于1 mL注射器甲中,以注射器甲抽取1 mL生理鹽水,使用注射針頭將注射器甲內(nèi)的生理鹽水推入到1 mL的注射器乙中,讀取注射器乙內(nèi)的生理鹽水量,該樣本的體積=1 mL-注射器乙內(nèi)生理鹽水體積,反復測量3次,最終取平均值。體積保留率=移植物取出后的體積/移植物植入前的體積 ×100%。質(zhì)量保留率：以精密電子天平稱重并記錄下樣本取出后即刻的質(zhì)量,反復測量3次,最終取平均值。質(zhì)量保留率=移植物取出后的質(zhì)量/移植物植入前的質(zhì)量×100%。

1.4.5 脂肪移植物染色 將取出的脂肪移植物完成質(zhì)量及體積測量后迅速置于體積分數(shù)為10%的甲醛溶液中固定,將標本24 h脫水、修剪、浸蠟、包埋、切片、行蘇木精-伊紅染色、封片,最后鏡檢。根據(jù)結(jié)構(gòu)完整性、囊腔/空泡的占比、炎癥反應(yīng)程度、間質(zhì)纖維化程度這四個指標以0～5分進行評分：0分為無,1分為輕度,2分為輕度至中度,3分為中度,4分為中度至重度,5分為重度。在每個鏡下視野均行3次打分取其均值,最終計算出5個鏡下視野的均值。CD31 染色各組脂肪組織切片,統(tǒng)計100倍鏡下視野下的血管總數(shù),選取十組不同視野下的血管數(shù),計算其血管密度,比較移植后血管生長情況。采用Halo數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)分析出各圖像中陽性面積所占比例。其中藍色代表蘇木素染細胞核,而棕黃色代表DAB中的陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 5組細胞遷移率比較 第24小時5組細胞遷移率變化均不明顯;第48小時1：12組的細胞遷移率明顯大于其他4組(P<0.05);第72小時1：12組的細胞遷移率明顯大于其他各組,1：10組與1：14組的遷移率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);1：12組的遷移率與其他各組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1及表1。

表1 5組細胞遷移率

圖1 5組細胞遷移率

2.2 5組裸鼠脂肪組織體積保留率比較 在移植后第4周,1：12組的體積保留率明顯高于其他4組(P<0.05);在移植后第8周,1：10組、1：12組、1：14組的體積保留率明顯高于1：6組、1：8組,1：10組與1：14組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),1：12組的體積保留率最高,與其他各組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在移植后的第12周,1：10組、1：12組、1：14組的體積保留率明顯高于1：6組、1：8組,1：10組與1：14組體積保留率相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 5組體積保留率

2.3 5組裸鼠脂肪組織質(zhì)量保留率比較 在移植后第4周,1：10組、1：12組的質(zhì)量保留率明顯高于1：6組、1：8組、1：14組,1：12組的質(zhì)量保留率與其他4組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在移植后第8周,1：12組、1：14組的質(zhì)量保留率明顯高于1：6組、1：8組、1：10組(P<0.05),1：12組的質(zhì)量保留率與其他4組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在移植后第12周,1：10組、1：12組與1：14組質(zhì)量保留率均明顯優(yōu)于1：6組、1：8組,1：12組的質(zhì)量保留率與其他4組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 5組質(zhì)量保留率

2.4 5組裸鼠脂肪組織HE染色結(jié)果及評分 HE染色結(jié)果顯示,1：12組的結(jié)構(gòu)完整性與其他組無明顯差異,囊腔/空泡占比、炎癥反應(yīng)程度、間質(zhì)纖維化程度均優(yōu)于其他4組,見圖2。將總標本按照取材時間分為4、8、12周組,與8周組相比,12周組脂肪組織病理評分略微降低,但差異不顯著(P>0.05),與4周組相比,12周組脂肪組織病理評分明顯降低(P<0.05);8周組脂肪組織病理評分有所降低(P<0.05),見表4。提示4周組脂肪組織病理改變程度相對較重,8周組和12周組脂肪組織病理改變程度均相對較輕,可見脂肪移植物于移植后第8周已經(jīng)趨于穩(wěn)定。

表4 脂肪組織病理評分分)

圖2 5組脂肪組織HE染色(200×)

2.5 5組CD31染色結(jié)果 與1：6組相比,1：12組人脂肪組織CD31蛋白含量明顯升高(P<0.05),1：8組、1：10組、1：14組人脂肪組織CD31蛋白含量均無明顯變化(P>0.05)。與1：8組相比,1：12組人脂肪組織CD31蛋白含量明顯升高(P<0.05),1：10組、1：14組人脂肪組織CD31蛋白含量均無明顯變化(P>0.05);與1：10組相比,1：12組人脂肪組織CD31蛋白含量明顯升高(P<0.05),1：14組人脂肪組織CD31蛋白含量無明顯變化(P>0.05);與1：12組相比,1：14組人脂肪組織CD31蛋白含量明顯降低(P<0.05), 見圖3、表5。

表5 CD31陽性面積占比

圖3 5組脂肪組織CD31染色結(jié)果(40×)

3 討論

自體脂肪移植會對組織增大產(chǎn)生持續(xù)的影響,因此,脂肪組織被整形外科醫(yī)師認為是理想的軟組織填充物。由于脂肪組織具有數(shù)量巨大、便于收集、機體損害小、不易過敏等優(yōu)點,自體脂肪移植成為美容和組織重建手術(shù)中常用的治療手段,常用于修復軟組織缺損、面部年輕化和隆胸等[16-17]。然而脂肪移植的結(jié)果多種多樣且依賴于術(shù)者的技術(shù)[18-19]。最近的研究表明,早期移植物中新生血管的生成在提高移植組織的質(zhì)量和體積保留中起著關(guān)鍵作用[20]。通過收集患者自己的血液,離心將其制備成血小板濃縮物有望解決脂肪移植物存活率低下的問題。

PRP作為最早的富集血小板血液制品[21]。據(jù)相關(guān)研究表明,PRP通過刺激增加多種血管生成因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)和激活內(nèi)皮細胞的遷徙,從而刺激生成新生血管來提高移植物的存活率[22]。PRF被稱為第二代富集血小板血液制品,據(jù)報道其許多方面都優(yōu)于PRP[8,20-24]。PRF制備較PRP簡單,只需一個離心步驟,其不需要添加外源性抗凝物質(zhì)來促進纖維蛋白的自然聚合。PRF在離心的過程中形成了一種高密度且結(jié)構(gòu)均一的三維立體纖維蛋白結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)有利于血小板與細胞因子結(jié)合及組織細胞遷徙和生長,具有良好的抗炎和促再生修復作用。PRF內(nèi)部形成纖維蛋白支架,血小板、白細胞及其相應(yīng)的細胞因子以及血漿內(nèi)的其他成分均以纖維蛋白支架為載體吸附其上,其特殊結(jié)構(gòu)使得細胞因子的釋放時間顯著延長至28天,對脂肪移植物的作用時間較PRP明顯延長。Kobayashi等[7]研究發(fā)現(xiàn)A-PRF釋放的生長因子數(shù)量明顯高于PRF和其他亞型的PRF,認為調(diào)整離心參數(shù)增加了A-PRF含有的細胞量,特別是其中白細胞的數(shù)量,其內(nèi)有更多的白細胞相關(guān)的成分,而各類細胞及生長因子的來源之一正是白細胞。常堯仁[25]發(fā)現(xiàn)A-PRF的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散、空間網(wǎng)格大、交聯(lián)程度低,因此A-PRF的纖維蛋白網(wǎng)中存在更多的免疫細胞。柳芳等[15]將脂肪顆粒分別添加PRF及A-PRF后移植于兔的背部,發(fā)現(xiàn)A-PRF在提高脂肪細胞存活率、降低炎癥反應(yīng)及促毛細血管生成等方面均強于普通型PRF。

脂肪和血液等組織都是彌足可貴的臨床資源,A-PRF廣泛用于臨床的首要條件是明確其促進脂肪移植物存活的最適濃度。在相關(guān)研究中,混合比例不盡相同,但每制備1.5～4 mL A-PRF就需要10～20 mL靜脈血液,進行大量脂肪填充時需要消耗大量血液來制備A-PRF。因此,我們急需找到A-PRF能提高移植脂肪存活率的最適混合占比。本研究結(jié)合已有的實驗結(jié)果,嘗試采用細胞遷移率、質(zhì)量及體積保留率、新生血管生成、間質(zhì)化纖維程度及CD31蛋白表達率等參數(shù)來評估脂肪移植物的存活情況。在進行體外脂肪移植實驗時使用了免疫缺陷小鼠作為移植載體,分析并比較了1：6、1：8、1：10、1：12、1：14五個混合占比來進行實驗。結(jié)果表明,1：12混合比例對脂肪移植物存活的促進效率最高。免疫組化顯示1：12混合比例組脂肪標本的囊腔/空泡占比、間質(zhì)化纖維程度較其他組均為最低,細胞遷移率、移植物體積及質(zhì)量保留率、CD31蛋白表達程度均優(yōu)于其他組別并伴有大量新生毛細血管。但本研究存在樣本量偏少、未進行人體試驗等不足,研究結(jié)果可能存在一定偏倚,有待通過大樣本研究進一步討論。

4 結(jié)論

改良型富血小板纖維蛋白促進脂肪移植存活的最適混合比例是1：12,其促進脂肪移植物存活的機制可能是減輕移植物炎癥反應(yīng)、刺激移植物新生血管生成及減少間質(zhì)化纖維程度。