姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

王萍 蔣玲琳 廖存香

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院血液病中心,重慶 400038;2.中國人民解放軍75750部隊(duì)衛(wèi)生所,廣西 柳州 545606)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一種高度異質(zhì)性的造血惡性腫瘤,其特征是骨髓中存在過度增殖和積累的未成熟髓系細(xì)胞[1]。盡管AML的診斷和治療取得了極大進(jìn)展,但其發(fā)病率和死亡率仍然很高[2]。目前,傳統(tǒng)化療方法是AML治療的主要手段,但其無法根除白血病干細(xì)胞(Leukemia stem cells,LSCs),而LSCs是AML患者耐藥和復(fù)發(fā)的根源[3]。因此,探索新的AML治療策略是當(dāng)前研究的重要課題。阿扎胞苷是一種去甲基化藥物,在低劑量下可以抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,并逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默[4],可用于新診斷的老年AML患者[5]。姜黃素可抑制組蛋白去乙?；覆⒄T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并具有對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小的特點(diǎn)[6]。有研究報(bào)道,姜黃素可增強(qiáng)沙利度胺誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡作用[7]。但姜黃素是否會(huì)影響阿扎胞苷對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞KG-1α的增殖抑制作用尚不清楚。故本研究旨在探討姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)KG-1α細(xì)胞增殖抑制的作用,并進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制,為AML治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 人急性髓系白血病細(xì)胞KG-1α購自廣州賽庫生物公司,姜黃素、阿扎胞苷購自美國Sigma公司,RPMI-1640購自美國Gibco公司,胎牛血清購自德國PAN-Seratech公司,CCK-8試劑購自上海MedChemExpress公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購自日本Takara公司,兔抗人CDK2、p27KIP1、γH2A.X抗體購自沈陽萬類生物,兔抗人p-AKT購自美國CST公司,Caspase-3抗體購自美國Immunoway公司,小鼠抗人β-actin抗體購自天津三箭生物公司,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA試劑盒、青-鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)公司,酶標(biāo)儀為美國Thermo scientific公司產(chǎn)品,流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品,凝膠成像儀為法國Vilber Lourmat公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) KG-1α細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),并置于37 ℃,5% CO2的飽和濕度的孵箱中,每2～3 d傳代一次。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以3×103個(gè)/100 μL接種于96孔板中,姜黃素濃度：1、5、10、20、40 μmol/L;阿扎胞苷濃度：5、10、20、40、80 μmol/L。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,藥物處理后,分別培養(yǎng)24、48和72 h。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μL/孔 CCK-8溶液,37 ℃孵育3 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度(OD)值。增殖抑制率(%)=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,將1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,予以不同濃度藥物處理48 h。然后收集細(xì)胞,PBS清洗細(xì)胞兩次。對(duì)于細(xì)胞周期檢測(cè),細(xì)胞用預(yù)冷的75%乙醇在4 ℃固定過夜,加入含RNA酶(100 μg/mL)的碘化丙啶(PI),室溫避光孵育30 min。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：用500 μL PBS重懸細(xì)胞,加入PI和Annexin V-FITC/7-AAD各5 μL,室溫避光孵育15 min。最后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 用RIPA裂解液(含1 mM PMSF)提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,按每孔40 μg上樣,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,再用5%脫脂奶粉在室溫封閉蛋白條帶2 h,4 ℃孵育相應(yīng)一抗,過夜。TBS-T洗膜3次后,條帶在室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。TBS-T洗膜3次后,用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行凝膠成像。條帶灰度值用Fusion軟件分析,β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示,姜黃素和阿扎胞苷均能抑制KG-1α細(xì)胞生長,且這種作用呈時(shí)間濃度依賴性,處理48 h后,聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對(duì)照組和各單藥組(P<0.05),見圖1。CompuSyn計(jì)算不同濃度姜黃素和阿扎胞苷的CI值結(jié)果顯示,5 μmol/L姜黃素和40 μmol/L阿扎胞苷的CI值最小,見表1。故選擇此聯(lián)合方案進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度姜黃素和阿扎胞苷的聯(lián)合指數(shù)

圖1 姜黃素和阿扎胞苷對(duì)KG-1α細(xì)胞增殖的影響

2.2 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)細(xì)胞周期的影響 KG-1α細(xì)胞可被阿扎胞苷阻滯于G2/M期,而姜黃素對(duì)其細(xì)胞周期無明顯影響,但聯(lián)合用藥組S期細(xì)胞百分比高于對(duì)照組和各單藥組(P<0.05),見圖2。

圖2 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)KG-1α 細(xì)胞周期的影響

2.3 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 單用姜黃素和阿扎胞苷處理48 h后,細(xì)胞凋亡率無明顯變化,而聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和各單藥組(P<0.05),見圖3。

圖3 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)KG-1α細(xì)胞凋亡的影響

2.4 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白以及AKT通路蛋白表達(dá)的影響 藥物處理48 h后,與對(duì)照組相比,聯(lián)合用藥組的p27KIP1、Caspase-3和DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2A.X的蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05),而聯(lián)合用藥組的CDK2的蛋白表達(dá)水平顯著降低,同時(shí)低于姜黃素組(P<0.05);此外,聯(lián)合用藥組p-AKT表達(dá)水平也較對(duì)照組明顯降低(P<0.05),見圖4。

圖4 姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷對(duì)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白以及AKT通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

阿扎胞苷目前主要用于骨髓增生異常綜合征和AML的治療,具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡的作用,但并非所有患者均能受益于阿扎胞苷,部分患者可出現(xiàn)耐藥[8]。姜黃素具有多種抗腫瘤活性,并且能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[9-11]。KG-1α是一種具有LSCs特性的AML細(xì)胞系,高表達(dá)CD34,缺失CD38抗原,可作為研究LSCs較好的替代模型[12]。然而,姜黃素能否增強(qiáng)阿扎胞苷對(duì)KG-1α細(xì)胞的影響并不明確。

本研究發(fā)現(xiàn),姜黃素和阿扎胞苷可抑制KG-1α細(xì)胞增殖,并呈時(shí)間濃度依賴性。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)藥物不同濃度組合的聯(lián)合效應(yīng)也不同,部分聯(lián)合方案甚至存在拮抗效應(yīng),這可能與藥物代謝方式和作用靶點(diǎn)相互影響有關(guān)。經(jīng)CompuSyn軟件計(jì)算可知,5 μmol/L姜黃素和40 μmol/L阿扎胞苷對(duì)KG-1α細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用最明顯。

單用阿扎胞苷處理KG-1α細(xì)胞后,細(xì)胞周期主要被阻滯于G2/M期。這與Logan等[13]研究結(jié)果類似,阿扎胞苷可將人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞阻滯于G2/M期。Deng等[14]也發(fā)現(xiàn),阿扎胞苷可誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞阻滯于G2/M期。單用姜黃素處理后,KG-1α的細(xì)胞周期分布無明顯變化。而在Zhou等[15]的研究中,姜黃素可誘導(dǎo)AML細(xì)胞系OCI-AML5和ML-2的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,這種差異可能是因?yàn)榇搜芯渴褂玫募?xì)胞系和姜黃素劑量與我們的不一致。本研究發(fā)現(xiàn),阿扎胞苷和姜黃素共處理可將KG-1α細(xì)胞阻滯于S期,提示兩者在細(xì)胞周期方面存在協(xié)同作用,同時(shí)說明姜黃素可增強(qiáng)KG-1α細(xì)胞對(duì)阿扎胞苷敏感性可能和阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。本研究結(jié)果與Shi等[16]研究結(jié)果類似,姜黃素與柚皮素聯(lián)用可通過阻滯細(xì)胞周期于S期從而抑制AML細(xì)胞系THP-1增殖。

阿扎胞苷具有去甲基化作用,可通過重新表達(dá)腫瘤抑制基因,從而促使白血病細(xì)胞死亡[17]。此外,姜黃素也有去甲基化作用,但其與阿扎胞苷的作用機(jī)制不同。阿扎胞苷可摻入DNA,與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1共價(jià)結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。姜黃素則是通過破壞DNMT1的合成,抑制酶活性,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,阿扎胞苷和姜黃素對(duì)KG-1α細(xì)胞凋亡無明顯影響,而當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)細(xì)胞凋亡水平顯著增高,表明姜黃素與阿扎胞苷促進(jìn)KG-1α細(xì)胞凋亡具有協(xié)同效應(yīng),而這種效應(yīng)可能與兩者均具有去甲基化作用有關(guān)。這與Martín等[20]研究結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷可顯著促進(jìn)AML細(xì)胞系(HL-60、U937)凋亡。

研究顯示,單用姜黃素和去甲基化藥物均能顯著下調(diào)白血病細(xì)胞中AKT磷酸化水平[15,21]。AKT在AML中經(jīng)常被過度激活,其磷酸化是AML患者總體生存期的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后不良因素[22]。據(jù)報(bào)道,AKT參與多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,包括細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成[23]。CDK2能被AKT正向調(diào)節(jié)[24],當(dāng)Cyclins/CDK2復(fù)合物形成受抑時(shí),細(xì)胞周期可被阻滯于S期[25]。p27可抑制Cyclins/CDK2復(fù)合物的形成,并受到AKT的負(fù)調(diào)控[24]。此外,AKT受抑后可激活Caspase-3的表達(dá)并促進(jìn)AML細(xì)胞的凋亡[26]。組蛋白H2A.X第139位絲氨酸磷酸化形成γH2A.X,γH2A.X是DNA雙鏈損傷標(biāo)志物[27]。有文獻(xiàn)報(bào)道,AKT可負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中H2A.X磷酸化水平進(jìn)而影響細(xì)胞生存[28-29]。本研究結(jié)果顯示,姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷可顯著下調(diào)AKT磷酸化和CDK2表達(dá)水平,上調(diào)p27KIP1、Caspase-3和γH2A.X的蛋白表達(dá)水平,表明姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷抑制KG-1α細(xì)胞增殖可能與下調(diào)AKT磷酸化水平調(diào)控其下游分子相關(guān)。

4 結(jié)論

姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷通過阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮協(xié)同抗KG-1α細(xì)胞增殖的效應(yīng),這可能與調(diào)控AKT信號(hào)通路有關(guān)。本研究為姜黃素聯(lián)合阿扎胞苷治療AML,特別是耐藥和復(fù)發(fā)患者,提供了一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù),但其具體分子機(jī)制和作用療效還需進(jìn)一步探索。