沒食子酸抑制人舌鱗癌SCC-9細胞增殖、凋亡及可能機制研究*

海樂 易必新 潘小紅

(1.湖南省藥品審核查驗中心, 湖南 長沙 410000;2.湖南省藥品檢驗研究院, 湖南 長沙 410000)

口腔頜面部惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的3%～5%,組織病理學類型多樣,以鱗狀細胞癌最多見,屬于世界范圍內(nèi)第六大常見的惡性腫瘤,其發(fā)生與多種內(nèi)、外因素有關,尤以吸煙、飲酒的危險性最大[1]?？谇活M面部惡性腫瘤的治療以手術為主,但預后效果欠佳,復發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,放化療效果也不理想[2]。因此,尋找一種對腫瘤敏感性高、不良反應少、療效好的藥物是亟待解決的問題。一般認為腫瘤的發(fā)生不僅與分化異常有關,與細胞凋亡機制也有密切關系[3]。沒食子酸(Gallic acid,GA)是一類多酚類化合物[4],可通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡在人腫瘤細胞系中發(fā)揮抗腫瘤作用,在藥理學方面具有安全性和高效性,已成為腫瘤預防及治療領域的熱點之一。迄今為止,GA對人口腔癌SCC-9細胞的影響少見報道,本研究觀察沒食子酸對SCC-9細胞增殖及凋亡的影響,探討其可能機制,為進一步闡明沒食子酸的抗腫瘤機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 沒食子酸購自Sigma公司,SCC-9人舌鱗癌細胞株來自中國科學院上海細胞所,噻唑藍(MTT)購自北京索來寶科技有限公司,膜聯(lián)蛋白V(Annxin V)/碘化丙錠(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司,細胞裂解液和BCA蛋白含量測定試劑購自江蘇碧云天公司,鼠抗人Cleaved-PARP、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8和Cleaved-caspase3一抗購自abcam公司,鼠抗人p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 將SCC-9人舌鱗癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞貼壁后,將細胞分為4組：對照組、低濃度沒食子酸組(30 μM GA組)、中濃度沒食子酸組(60 μM GA組)、高濃度沒食子酸組(90 μM GA組)。

1.3 MTT檢測細胞增殖 將SCC-9細胞以密度為5×104個細胞/孔,接種于24孔培養(yǎng)板上過夜,加入含沒食子酸(0、30、60和90 μM)培養(yǎng)液37 ℃下分別培養(yǎng)24和48 h,然后按照MTT試劑盒說明書進行操作,并使用酶標儀在563 nm處測量每個孔的吸光度。

1.4 流式細胞儀檢測SCC-9細胞周期 SCC-9細胞同“1.3方法”接種在培養(yǎng)皿上,并與沒食子酸(30、60和90 μM)共孵育24 h,收集細胞、重懸,4 ℃固定24 h 后離心去除固定液,在室溫下加入嗅化乙錠(PI)溶液避光染色15 min,使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 流式細胞儀檢測SCC-9細胞凋亡率 將SCC-9細胞同“1.3方法”接種到24孔板,待細胞貼壁后將細胞分組,按照FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,SCC-9細胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染色,混合液置于暗處室溫反應15 min,然后加入400 μLAnnexin V-結合緩沖液重懸1 h后,采用流式細胞儀進行細胞分析。

1.6 TUNEL法檢測SCC-9細胞凋亡 SCC-9細胞培養(yǎng)及分組同“1.3方法”,按照TUNEL法檢測試劑盒說明進行操作,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行檢測,顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞。

1.7 Western blot檢測SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達 收集各組SCC-9細胞,裂解后BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。電泳分離,PVDF膜轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗,4 ℃輕搖過夜,再加入HRP標記的二抗孵育2 h、顯色,采用凝膠成像技術進行分析。

2 結果

2.1 沒食子酸抑制人口腔癌SCC-9細胞增殖 培養(yǎng)24、48 h后,與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組SCC-9細胞增殖率逐漸下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖1。

圖1 MTT檢測SCC-9細胞增殖

2.2 沒食子酸誘導人口腔癌SCC-9細胞sub G1細胞周期阻滯 使用流式細胞儀對碘化丙啶(PI)染色后的細胞進行定量分析,與對照組比較,沒食子酸組SCC-9細胞的sub G1期DNA含量逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖2。

圖2 沒食子酸對SCC-9細胞周期的影響

2.3 沒食子酸誘導SCC-9細胞凋亡 與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組細胞晚期凋亡率逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖3。

圖3 沒食子酸對SCC-9細胞凋亡的影響

2.4 4組SCC-9細胞凋亡情況比較 與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組陽性細胞凋亡數(shù)逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖4。

圖4 TUNEL法檢測各組SCC-9細胞凋亡

2.5 沒食子酸誘導SCC-9細胞中Caspase活化及PARP的裂解 與對照組比較,中、高濃度食子酸組SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖5A。與對照組比較,低、中和高濃度沒食子酸組SCC-9細胞中p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖5B。

圖5 沒食子酸對SCC-9細胞中凋亡及MAPK信號通路的影響

3 討論

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主、有序死亡,也是機體清除不必要受損細胞的一種病理生理過程[5-6],因此凋亡可作為腫瘤治療的一種治療策略。沒食子酸(GA)是一種天然多酚類化合物,具有多種生物學活性,如抗炎、抗氧化等作用[7],還能選擇性抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡[8]。但目前關于GA對口腔癌作用的具體機制尚不完全清楚,并且缺乏多種藥理作用之間相關性研究。

本研究MTT檢測結果顯示,相同作用時間下,隨著GA濃度增加,SCC-9細胞的增殖率逐漸下降,具有藥物濃度相關性;而相同作用濃度下,48 h作用時間的SCC-9細胞增殖率低于24 h,說明其抑制效果具有時間相關性。流式細胞儀和TUNEL檢測結果提示,GA參與了細胞凋亡調(diào)控,藥物濃度的增加能誘導SCC-9細胞sub、G1細胞周期阻滯,從而晚期凋亡率逐漸增加、抑制其增殖,且凋亡具有濃度依賴性。

Caspases蛋白酶激活級聯(lián)反應在凋亡各個階段發(fā)揮重要作用[9]。細胞內(nèi)凋亡信號轉(zhuǎn)導涉及兩條基本途徑：外源性通路和內(nèi)源性通路[10]。外源性凋亡信號可誘導形成死亡誘導信號復合物,激活細胞膜近端的Caspase-8等,然后剪切活化執(zhí)行型Caspase(如Caspase-3),同時活化的Caspase-8還可以剪切活化PARP,進而誘導細胞凋亡[11];內(nèi)源性通路也稱為線粒體途徑,線粒體膜電位變化和線粒體內(nèi)外膜通透性增加引導釋放細胞色素C,隨后與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結合,激活Caspase-9,啟動caspase級聯(lián)反應,誘導細胞凋亡[12]。PARP是真核細胞中的DNA修復酶,可識別結構損傷的片段DNA[13]。Caspase-3一旦被激活,即可誘導PARP發(fā)生斷裂,使細胞進入凋亡途徑[14]。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,中、高濃度沒食子酸組SCC-9細胞中Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表達增加,提示沒食子酸可能通過細胞外傳導途徑活化Caspase-8,進一步激活下游效應因子Caspase-3,誘導細胞凋亡;沒食子酸還可能通過線粒體途徑,促進凋亡刺激因子與Apaf-1形成多聚復合物,激活Caspase-9,進而激活下游的 Caspase-3,誘導PARP發(fā)生剪切,進入凋亡途徑。

MAPK是一絲席氨酸蛋白激酶家族,p38、ERK 1/2、JNK是MAPK家族的主要成員,其中JNK、p38 MAPK 信號通路活化與細胞凋亡有關[15]。研究表明,活化的MAPK通過級聯(lián)反應將外界信號傳遞給細胞核,調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、分化和凋亡[16-17]。文獻報道[18],人肝癌和早幼粒細胞白血病細胞中,甘草黃酮通過JNK1/2途徑激活Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3導致細胞凋亡;ERK 1/2級聯(lián)是一種經(jīng)典的細胞內(nèi)信號通路,ERKl/2磷酸化是功能活動的標志,能介導細胞的增殖、分化和死亡多種病理生理過程[19-20]。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),沒食子酸組p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-P38蛋白表達較對照組逐漸增加(P<0.05),提示沒食子酸可能通過磷酸化JNK、p38、ERK1/2途徑激活下游信號因子Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3,發(fā)揮促進SCC-9細胞凋亡、抑制其增殖的作用,這與本研究MTT結果基本一致。

4 結論

沒食子酸具有抑制SCC-9細胞增殖、誘導凋亡作用,這與其可以通過激活MAPK/ERK信號通路,活化下游Caspase信號因子,誘導PARP發(fā)生斷裂,促使細胞進入凋亡途徑有關,提示沒食子酸可作為一種潛在的口腔癌治療劑。