結(jié)直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞突變類型分析

王婷婷，郭 丹，陸君陽，徐 徠，董海濤，林佃新，肖 毅*

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.醫(yī)學科學研究中心；2.臨床生物樣本庫；3.基本外科；4.口腔科，北京100730；5.萊鋼集團萊蕪礦業(yè)有限公司職工醫(yī)院 內(nèi)科，山東 濟南 271100

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumors,NETs)根據(jù)發(fā)病位置不同劃分NETs不同類型。NETs發(fā)病隱匿,往往惡性程度高。其中,胰腺NETs是胰腺癌中惡性程度非常高的腫瘤。而結(jié)腸直腸NETs是胃腸道中僅次于胰腺NETs發(fā)病率,第二常見的NETs,在美國每年的發(fā)病率約為0.3～1人/10萬人[1],在中國的發(fā)病率與之相近,在過去40年中,結(jié)腸直腸NETs的發(fā)病率有所增加[2]。近幾年,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)根據(jù)腫瘤增殖活性將神經(jīng)內(nèi)分泌瘤分為3種基本級別[3],包括NETs G1、G2和G3,其中G3也稱為神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrine carcinomas,NECs)[4-5]。分級標準包括組織學和增殖活性,主要以Ki67陽性指數(shù)和核分裂象數(shù)作為指標。其中G1:Ki67陽性指數(shù)<3%,核分裂象數(shù)<2個/10 HPF(high power field);G2: Ki67陽性指數(shù)為3%～20%,核分裂象數(shù)為2～20個/10 HPF;G3: Ki67陽性指數(shù)>20%,核分裂象數(shù)>20個/10 HPF。

目前,結(jié)直腸NETs的發(fā)病機制尚不十分清楚。目前已有研究對NECs的一些生物標志物和分子特征進行了分析,如p53的異常表達[6],Rb-p16通路的破壞[7],Wnt-β-catenin通路和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)[8],以及APC、KRAS和BRAF等的基因突變[3]。最近的研究表明,NECs與腺癌更為一致,可能與腺癌來源相同,而非高分化神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NETs G1和G2)[3,6,9]。這些報道大多基于病理結(jié)果得出這一結(jié)論,使用石蠟包埋樣本而非新鮮樣本推斷大腸NECs和腺癌的共同克隆起源[10]。目前通過全基因組或全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)對大腸NECs進行的研究很少(主要原因多數(shù)是樣本較難獲取)。因此,全基因組或全外顯子組水平上的高分化結(jié)直腸NETs的基因特征尚不清楚,全基因組水平上的NETs G1、NETs G2和低分化NECs G3之間的關(guān)系也不清楚。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展,各種突變類型也被解析出來,常見的基因突變類型包括:1)點突變;2)插入-缺失突變(insertion and deletion,InDel,長度小于50 bp);3)基因拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNV);4)反轉(zhuǎn)錄:指 RNA 分子通過反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄成 DNA,再插入到基因組中的過程;5) 染色體結(jié)構(gòu)變異(structural variation,SV,長度大于50 bp):包括大片段的插入(insertion,INS),缺失(deletion,DEL),染色體內(nèi)易位(intra-chromosomal translocation,ITX)、染色體間易位(inter-chromosomal translocation, CTX)和反轉(zhuǎn)(inversion,INV)等;6)染色體數(shù)目變異:指染色體數(shù)目增加或減少,可能導(dǎo)致基因副本數(shù)目的改變。

本研究通過招募結(jié)直腸NETs手術(shù)患者,術(shù)中取NETs和對照正常組織(癌旁組織),并進行全基因組測序(whole-genome sequencing,WGS),并進一步深入分析。發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸NETs突變類型包括:單核苷酸突變、InDel、CNV, 以及染色體結(jié)構(gòu)變異(包括INS、DEL、ITX、CTX和INV)等。本研究得出結(jié)論,結(jié)直腸NETs發(fā)生時,體細胞發(fā)生了大量的突變,尤其以染色體CTX變異最為顯著。本研究在WGS水平上分析了結(jié)直腸NETs的基因突變特征,有助于更好地理解結(jié)直腸NETs的發(fā)病機制,并為未來腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 患者招募及樣本取材

本項目所有患者相關(guān)流程均已由北京協(xié)和醫(yī)院倫理標準審查委員會批準(批準號:S-K431),共招募了9例結(jié)直腸NETs手術(shù)患者,所有患者都簽署了知情同意書。這些患者于2017年1月至2018年12月在北京協(xié)和醫(yī)院基本外科接受了手術(shù)切除,所有病例均按照WHO標準進行分類[4]。招募條件:符合結(jié)直腸NETs G1,NETs G2,NECs,以及杯狀細胞類癌(goblet cell carcinoid tumors,GCC)患者,腫瘤的定性和分級由2名及以上病理醫(yī)師進行確認,所有患者腫瘤病灶均為原發(fā)。術(shù)中取材,分別取結(jié)直腸NETs患者腫瘤和對應(yīng)的癌旁組織(病理學家通過病理切片證實的無腫瘤細胞的組織)。為了對患者信息進行保密,把患者信息(姓名和身份證)進行了模糊化處理,并分配了新的編號。

1.2 二代測序

使用Illumina測序平臺進行全基因組測序[11],測序在諾禾致源公司完成,腫瘤的平均深度為60倍,對照(癌旁)樣本的平均深度為35倍。

1.3 生物信息學和統(tǒng)計學分析

使用SAMtools(v1.0)、muTect(1.1.4版)、Strelka(v1.0.13版)、crest(v 0.0.1版)和control-FREEC(v6.7版)分別檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、體細胞單核苷酸變異(single nucleotide variants,SNVs)、體細胞插入缺失突變(InDel)、結(jié)構(gòu)變異(包括INS、DEL、ITX、CTX和INV等)檢測,以及拷貝數(shù)變異(CNV)檢測等分析。使用NMF(版本0.22)進行突變譜和突變特征分析。使用Student t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗評估了兩組之間的顯著差異。SMG分析采用卷積試驗(CT)。

2 結(jié)果

2.1 患者特征

本研究的整體過程(圖1)。本項目招募了9例患者,包括7例切除的結(jié)直腸NETs、1例結(jié)直腸NEC和1例GCC。長期以來,關(guān)于GCC與NETs或腺癌的關(guān)系一直存在爭議,這次選了一位GCC患者作為對照。9例患者的基本臨床病理信息見表1。9例患者的瘤體組織和癌旁對照提取DNA后,用于WGS全基因組測序。

圖1 研究流程圖Fig 1 Overview of the study workflow

表1 結(jié)直腸NETs患者的臨床病理信息Table 1 Clinicopathological information for the colorectal NETs patients

2.2 疾病突變特征

WGS測序發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸NETs突變類型包括: SNP、InDel(長度在50 bp以下)、CNV,以及SV(長度在50 bp以上),包括: INS、DEL、ITX(發(fā)生在同一條染色體內(nèi))、CTX(發(fā)生在兩條同源或非同源染色體之間)和INV等。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸NETs發(fā)生時,瘤體細胞發(fā)生了大量的突變(圖2),尤其以染色體易位CTX變異最為顯著,并且跟G1相比,G2級別的結(jié)直腸NETs染色體CTX變異更多(表2)。跟癌旁對照相比,結(jié)直腸NETs中檢測發(fā)現(xiàn)大量染色體結(jié)構(gòu)變異(表2),平均變異數(shù)目11 382個,這些變異主要集中在細胞周期及調(diào)控相關(guān)通路或腫瘤抑制相關(guān)通路,尤其引起ATM、MEN1等重要調(diào)控基因變異,繼而引發(fā)相關(guān)蛋白表達異常。

表2 體細胞染色體結(jié)構(gòu)變異統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of somatic variation

The first circle of each ring from outside to inside, sequencing coverage map; In the second circle, the green dot indicates the density of SNP / indel; In the third circle, CNV results, red indicates that the number of copies increases, blue indicates that the number of copies is missing, and green indicates that the number of copies is normal; In the fourth circle, SV results, where CTX(orange), INS(green), DEL(gray), ITX(pink) and INV(blue).

3 討論

本研究通過收集結(jié)直腸NETs和其癌旁組織對照,并進一步利用WGS測序,分析了不同級別結(jié)直腸NETs中突變類型,并進一步統(tǒng)計了瘤體細胞結(jié)構(gòu)性變異的種類特點,有助于更好理解結(jié)直腸NETs發(fā)病的可能機制,為未來腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。通過對多種突變類型包括SNP、InDel、CNV,以及SV(INS、DEL、ITX、CTX和INV等)分析,發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸NETs發(fā)生時,基因組序列變異明顯,尤其以染色體易位CTX變異最為顯著,并且跟G1相比,G2級別的結(jié)直腸NETs染色體CTX變異更多,這些變異主要集中在細胞周期及調(diào)控相關(guān)通路或腫瘤抑制相關(guān)通路。提示易位等染色體大范圍的變異,在結(jié)直腸NETs發(fā)生中可能起重要作用。研究顯示,在胰腺NETs中,4條信號通路基因突變變化最明顯,包括 DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)重塑、端粒維持,以及mTOR信號激活,這些突變可能和胰腺NETs臨床分型相關(guān)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)染色體易位CTX 變異和結(jié)直腸NETs的不同分級相關(guān),跟高分化的G1相比,G2級別的結(jié)直腸NETs染色體CTX變異更多。

此項研究中也有一些局限性。結(jié)腸直腸NETs項目的研究難點在于,大多數(shù)結(jié)腸直腸NETs都是在結(jié)腸鏡檢查時發(fā)現(xiàn)的,腫瘤較小(大多數(shù)直徑不超過10 mm)?；顧z組織優(yōu)先用于病理檢查,收集新鮮的結(jié)直腸NETs樣本異常困難。本研究僅收集了8例結(jié)腸直腸NETs/NECs和1例GCC患者的瘤體和對應(yīng)癌旁組織進行WGS測序,樣本量偏小,也是本研究的主要局限所在。