探討坤泰膠囊治療卵巢早衰的作用機(jī)制*

于秋敏，伍娟娟

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西南寧 530200

2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530011

卵巢早衰（ POF，premature ovarian failure ）是婦科病中常見的生殖內(nèi)分泌疾病，好發(fā)于40歲以前的女性，以閉經(jīng)、促卵泡生成素（FSH）≥40mIU / mL、雌激素水平降低伴或不伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀為主[1]。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道[2]，隨著女性生活和工作壓力的逐漸升高，全球POF患病率呈逐年上升的趨勢，POF的全球發(fā)病率約0.9%～1.2%。治療POF，西醫(yī)常用激素補(bǔ)充療法，雖對患者的癥狀有改善作用，但停藥后易復(fù)發(fā)，且易增加女性患癌風(fēng)險(xiǎn)[3]。坤泰膠囊由古代醫(yī)家張仲景《傷寒雜病論》中的“黃連阿膠湯”加減而成；在臨床上，坤泰膠囊作為治療POF的一線中成藥運(yùn)用相當(dāng)廣泛[4]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討坤泰膠囊治療POF的主要藥物活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)以及相關(guān)通路，再用分子對接技術(shù)對得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心藥物成分進(jìn)行對接研究，對關(guān)鍵靶點(diǎn)-核心成分兩者結(jié)合能的結(jié)果進(jìn)行分析，為后續(xù)坤泰膠囊治療POF的作用機(jī)制提供臨床參考。

材料與方法

1 坤泰膠囊藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/），以口服利用度≥30%、且滿足類藥性≥0. 18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，檢索坤泰膠囊六味中藥的活性成分，因阿膠在該數(shù)據(jù)庫中未檢索到，則在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）補(bǔ)充檢索。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），進(jìn)行蛋白質(zhì)靶點(diǎn)名稱的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 POF疾病靶點(diǎn)的獲取方法

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）與OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫以“premature ovarian failure”為關(guān)鍵詞，進(jìn)行疾病靶點(diǎn)的檢索。

3 構(gòu)建“藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

將所得的藥物及其活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中，進(jìn)行“藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

4 獲取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)

將所得的藥物與疾病靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)，輸至Bioinformatics（https：//bioinformatics.com.cn/）中，得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)。

5 構(gòu)建“蛋白與蛋白相互作用（PPI）”網(wǎng)絡(luò)圖

將所得“交集靶點(diǎn)”，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），得到蛋白互作結(jié)果。所得的蛋白互作結(jié)果以“tsv”格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中，構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

6 GO富集分析及KEGG通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對“交集靶點(diǎn)”，進(jìn)行生物過程（BP ）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能 （ MF）及KEGG通路的分析。取GO富集分析中BP、CC、MF前10個(gè)數(shù)據(jù)結(jié)果和KEGG通路分析前20個(gè)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)可視化展示。

7 核心藥物活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得藥物活性成分的2D分子結(jié)構(gòu)，Chem3D軟件中優(yōu)化成3D結(jié)構(gòu)，作為配體；用Pymol軟件對核心靶點(diǎn)進(jìn)行去水、去殘積等處理，作為受體。用Autodock tools與Autodock Vina對核心藥物活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并計(jì)算出對應(yīng)的結(jié)合能值。最后，用Pymol軟件對結(jié)合能值排名前6的進(jìn)行可視化展示。

結(jié)果

1 坤泰膠囊藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)

在TCMSP與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中檢索，得到黃芩36個(gè)、茯苓15個(gè)、黃連14個(gè)、白芍13個(gè)、熟地黃2個(gè)及阿膠3個(gè)。最后將所得的藥物活性成分進(jìn)行去重，共88個(gè)藥物活性成分納入研究范圍。該88個(gè)藥物活性成分共得到219個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)，在Uniport數(shù)據(jù)庫中對219個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白名稱的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 POF疾病靶點(diǎn)的獲取結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫以“Relevance score>3.76”作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲疾病靶點(diǎn)5081個(gè)，篩選出2543個(gè)與疾病緊密相關(guān)的靶點(diǎn)。OMIM數(shù)據(jù)庫所獲得的疾病靶點(diǎn)491個(gè)，將兩數(shù)據(jù)庫所得的靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，最終得到疾病靶點(diǎn)2947個(gè)。

3 “藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，包括290個(gè)節(jié)點(diǎn)和959條邊，見圖1，利用軟件中“Network Analyzer”插件，進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，取度值排名前7的藥物活性成分作為坤泰膠囊的關(guān)鍵成分，見表1。

表1 關(guān)鍵藥物有效成分基本信息

圖1 “藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

4 藥物與疾病的交集靶點(diǎn)

通過Bioinformatics平臺，得到153個(gè)交集靶點(diǎn)，包括PTGS2、PTGS1、NOS1、PGR、NR3C2、TNF、IL6、CD14、LBP、PIK3CG等。交集靶點(diǎn)韋恩圖見圖2。

圖2 坤泰膠囊治療POF的共同靶點(diǎn)韋恩圖

5 “蛋白與蛋白相互作用（PPI）”網(wǎng)絡(luò)圖

經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以“tsv”格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中，進(jìn)行可視化展示，用CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出均滿足數(shù)值大于介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）中位數(shù)前10的節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，這些核心靶點(diǎn)可能是坤泰膠囊治療POF的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖3與表2。

表2 核心靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

圖3 “蛋白與蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 坤泰膠囊對POF作用靶點(diǎn)的GO富集分析圖

圖5 坤泰膠囊對POF KEGG通路分析圖

6 GO富集分析及KEGG通路分析

GO富集分析檢索到1012個(gè)條目，分別選富集靶點(diǎn)排名前10的進(jìn)行可視化。BP得778個(gè)條目，包括雌二醇的反應(yīng)、缺氧的反應(yīng)等；CC得84個(gè)條目，包括膜筏、細(xì)胞外、細(xì)胞液等；MF得150個(gè)條目，涉及酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合等。KEGG通路分析檢索到169條通路，選富集前20的通路進(jìn)行可視化，見圖6，其主要涉及癌癥通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等信號通路。

圖6 分子對接結(jié)果可視化

7 核心藥物活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

選前5的核心藥物活性成分與前8的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，對接的結(jié)合能信息表見表3。結(jié)合能信息表均＜-5.0 kcal/mol，體現(xiàn)了分子對接的配體與受體能穩(wěn)定的結(jié)合，表明了坤泰膠囊的核心藥物活性成分能很好的與預(yù)測的核心靶點(diǎn)結(jié)合在一起。對結(jié)合能值排名前6的分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化展示，見圖6。

表3 坤泰膠囊核心活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對坤泰膠囊治療POF的藥物及潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，從而證實(shí)坤泰膠囊對POF起到治療作用，揭示了坤泰膠囊通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路對POF的作用機(jī)制。

“藥物-活性成分-相關(guān)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，按拓?fù)浞治鲋卸戎祬?shù)篩選出槲皮素、β-谷固醇、山萘酚、豆甾醇、黃芩素、黃芩苷作為坤泰膠囊治療POF的核心藥物成分。槲皮素、β-谷固醇與豆甾醇均有抗衰老、抗抑郁、抗氧化等藥理活性[5-6]，均能調(diào)控 PI3K/Akt信號通路，對卵巢起到抗氧化、抗細(xì)胞衰老等作用進(jìn)而減慢或抑制卵巢細(xì)胞的衰老過程，促進(jìn)卵巢各級卵泡的生長發(fā)育[7-8]，使顆粒細(xì)胞繁殖，抑制細(xì)胞凋亡，保持卵巢功能的活性[9-10]，從而發(fā)揮對卵巢功能的調(diào)節(jié)作用[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，山萘酚在一定程度上能改善癌SKOV-3細(xì)胞在體外的增殖，使卵巢癌細(xì)胞凋亡，恢復(fù)卵巢的再生功能[13-14]。黃芩素與黃芩苷均屬黃酮類化合物，有抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤等藥理作用[15]，有實(shí)驗(yàn)證明，二者能提高抗氧化酶的濃度，抑制小鼠卵巢組織細(xì)胞損害的程度，從而對卵巢組織起到保護(hù)作用[16-17]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行CytoNCA拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)坤泰膠囊能通過TP53、AKT1、MAPK1、TNF、IL6等核心靶點(diǎn)對POF發(fā)揮治療作用。TP53能通過刺激ASK1信號通路使卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡，促使卵巢卵泡的產(chǎn)生和發(fā)育，減輕卵巢早衰的癥狀[18-19]。AKT1能激活卵巢組織內(nèi)自噬細(xì)胞從而抑制卵巢的衰老，延長卵巢細(xì)胞壽命，反映了AKT1基因蛋白影響POF的進(jìn)展[20]。TNF與IL6均屬炎性因子，而POF的發(fā)生常常與炎性因子密切相關(guān)[21]；刁瑞英等人通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，POF患者血清中TNF、IL6等炎性因子水平偏高，用坤泰膠囊治療POF患者，能通過調(diào)節(jié)TNF與IL6等炎癥因子來改善自身免疫紊亂，調(diào)節(jié)患者內(nèi)分泌系統(tǒng)，起到改善卵巢中卵泡的功能[22]。

通過GO富集分析和KEGG信號通路分析，證實(shí)坤泰膠囊能通過參與多種生物過程及調(diào)控多條信號通路對POF的進(jìn)展發(fā)揮作用。KEGG信號通路分析結(jié)果中PI3K-Akt、TNF及IL-17等信號通路與POF緊密聯(lián)系，PI3K-Akt信號通路參與卵巢卵母細(xì)胞的生長、原始細(xì)胞的發(fā)育及顆粒細(xì)胞增殖與分化等過程，在卵泡的生長發(fā)育與卵巢損傷的恢復(fù)起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[23-24]。實(shí)驗(yàn)證明，坤泰膠囊能調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的激素水平，下調(diào)Fasl蛋白與上調(diào)TNF蛋的mRAN的表達(dá)，從而促使卵巢功能得到修復(fù)，起到保護(hù)卵巢的作用[25-26]。IL-17信號通路屬于炎癥通路，坤泰膠囊聯(lián)合激素貫序療法能通過IL-17信號通路及調(diào)控Th17細(xì)胞平衡，對POF起到治療作用[27-28]。由此可知，坤泰膠囊可通過多條通路途徑改善卵巢早衰患者的卵巢功能變化，從而維持卵巢的生理功能。分子對接結(jié)果表明，坤泰膠囊的核心藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的平均結(jié)合能為-9.01kcal/mol，該結(jié)果證實(shí)了坤泰膠囊的藥物活性成分能與核心靶點(diǎn)蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力，揭示了主要藥物活性成分對核心靶點(diǎn)蛋白有一定的激活或抑制作用，坤泰膠囊從而起到對POF起的治療作用。

綜上所述，坤泰膠囊治療卵巢早衰能通過相關(guān)藥物活性成分、核心靶點(diǎn)及相關(guān)通路對改善卵巢功能、延長卵巢細(xì)胞壽命、減輕卵巢早衰癥狀、調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平等起到一定的作用。本文闡明了坤泰膠囊治療卵巢早衰的藥理作用機(jī)制，不足之處在于缺少實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，但本文能為臨床研究、實(shí)驗(yàn)研究以及中藥的開發(fā)提供一些新思路。