氧化應(yīng)激在慢性阻塞性肺疾病中的生物標志物研究及中藥預(yù)測*

朱金燕，胡華鵬，云艷嬌，劉明

1 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明 650500

2 昆明市中醫(yī)醫(yī)院 云南昆明 650011

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一種復(fù)雜的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣流受限不完全可逆、氣道慢性炎癥及肺氣腫破壞為主要特征，且與吸入有害顆?；驓怏w及異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]?，F(xiàn)COPD以藥物治療為主，如糖皮質(zhì)激素、祛痰藥及支氣管擴張藥等，然而臨床療效并未令人滿意，且具有容易引起不良反應(yīng)，如感染和免疫抑制[2]，故進一步明確發(fā)病機制，尋找新的干預(yù)手段是必要的。COPD屬于中醫(yī)“肺脹”范疇，作為一種進行性發(fā)展疾病，中醫(yī)中藥在改善患者肺功能、減輕臨床癥狀、控制炎癥反應(yīng)、提高生活質(zhì)量等方面有較好的療效與優(yōu)勢[3-4]。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)，以氧化為主導(dǎo)，可導(dǎo)致細胞功能障礙和組織損傷[5]。吸煙作為引起COPD最常見的危險因素，香煙煙霧是誘發(fā)患者氣道內(nèi)氧化應(yīng)激的主要原因。煙霧中的氧化劑會分解肺部結(jié)締組織，致肺泡支架結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)肺氣腫[6]；此外氧化劑還可通過損害肺泡巨噬細胞的吞噬能力來延遲炎癥的消退[7]。近年來越來越多的研究強調(diào)了氧化應(yīng)激在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的重要性[8-10]。但針對COPD中的氧化應(yīng)激差異基因的研究較少，基于此本研究綜合運用生物信息學(xué)分析，探索氧化應(yīng)激對COPD的發(fā)展作用，同時鑒定中心基因和治療中藥，以對疾病的診療提供新的見解。

材料與方法

1 數(shù)據(jù)下載與預(yù)處理

從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載COPD系列矩陣文件及平臺文件，選取基因集GSE10006作為實驗組，基因集GSE76925作為驗證組。數(shù)據(jù)集具體信息見表1。

表1 GEO數(shù)據(jù)集具體信息

2 獲取氧化應(yīng)激差異表達基因

使用R語言中的“l(fā)imma”包，設(shè)置adj.P value＜0.05，|logFC|>1.0，篩選疾病組與正常組間的差異表達基因（DEG）。同時，從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取氧化應(yīng)激基因，保留Relevance score≥7的基因。最后，計算兩者交集確定氧化應(yīng)激差異表達基因（DEOSGs）。

3 富集分析

使用R語言的“org.Hs.eg.db”及“clusterProfiler”包對1.2中得到的DEOSGs分別進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。選擇從MSigDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.gseamsigdb.org/gsea/downloads.jsp）下載的“c2.cp.kegg.v7.5.1.entrez.gmt”和“c5.bp.v7.5.1.entrez.gmt”子集合作為參考基因集進行基因集變異分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）分析，設(shè)置排列檢驗1000次，P＜0.05。

4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將DEOSGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。使用Cytoscape軟件（版本3.9.1）中的CytoHubba插件、MCODE插件獲得候選中心基因；其中CytoHubba采用MCC算法，MCODE使用了默認參數(shù)（Degree Cutoff=2、Node Score Cutoff=0.2、K-Core=2和Max Depth=100）。

5 中心基因鑒定

基于驗證組評估候選中心基因的準確性；使用“l(fā)imma”包對候選基因進行差異分析，結(jié)果以P＜0.05為標準；同時使用R中“pROC包”分析受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），評估候選基因在COPD診斷中的作用，以曲線下面積（Areas Under Curve，AUC）>0.65為標準。評估兩者結(jié)果確定中心基因。

6 免疫浸潤分析

運用CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）進行分析，采用反卷積算法處理標記基因表達值，設(shè)置P＜0.05，評估正常和COPD肺組織中22種免疫細胞的比例。

7 中心基因與免疫細胞的相關(guān)性分析

為了進一步明確中心基因與免疫細胞的關(guān)系，我們運用R語言中的 “ggExtra”和“ggpubr”包，設(shè)置P＜0.05，進行中心基因的表達與免疫細胞相對比例的相關(guān)性研究。

8 中藥預(yù)測

通過Coremine（https：//coremine.com/medical/）數(shù)據(jù)庫對中心基因進行中藥預(yù)測，設(shè)置P＜0.05。并用Cytoscap 3.9.1構(gòu)建“靶點-中藥”網(wǎng)絡(luò)。使用《中國藥典》2020年版對預(yù)測中藥進行性味、歸經(jīng)統(tǒng)計整理，并將結(jié)果使用雷達圖展示。

結(jié)果

1 DEGs與DEOSGs獲取

共獲得104個DEGs，其中上調(diào)基因65個，下調(diào)基因39個，根據(jù)校正后的P值，將差異程度較大的前25個上調(diào)和下調(diào)基因用熱圖展示（圖1A），并通過火山圖展示所有差異基因（圖1A）。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得824個氧化應(yīng)激基因，通過韋恩分析得到13個氧化應(yīng)激差異表達基因（圖1C），其中上調(diào)基因9個，下調(diào)基因4個（圖1D）。

圖1 DEGs與DEOSGs相關(guān)結(jié)果A：DEGs的聚類熱圖；B：DEGs分布火山圖；C：維恩圖，顯示DEOSGs；D：DEOSGs分布火山圖

2 富集分析結(jié)果

為了分析差異表達的氧化應(yīng)激基因的潛在生物學(xué)功能，我們進行了GO、KEGG富集分析?？偣哺患?16個生物過程（BPs），21個細胞成分（CCs），81個分子功能（MFs）和24個KEGG途徑。GO結(jié)果表明DEOSGs主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖、血液微粒子、質(zhì)膜等（圖2A、B）；KEGG結(jié)果提示DEOSGs與動脈硬化、利什曼病及AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用等通路相關(guān)（圖2C、D）。為進一步探索DEOSGs與COPD相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)信息途徑，我們進行了GSEA分析，最終在吞噬體、急性炎癥反應(yīng)、乳腺癌、Wnt信號傳導(dǎo)途徑等通路上得到富集（圖4）。

圖2 GO與KEGG富集結(jié)果（A和B：GO分子功能富集結(jié)果；C和D：KEGG通路富集結(jié)果）

3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與候選中心基因的鑒定

將DEOSGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫后，得到由13個節(jié)點和25條連線組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖3A所示。通過Cytoscape軟件的CytoHubba插件提取了網(wǎng)絡(luò)中中介值排名前10的基因（圖3B），分別為：CCL2、PPARG、ITGAM、FN1、FOS、EGR1、ALOX5、NOS2、TREM2、CYP1A1，圖中基因顏色越深，代表該基因中介值越高，在網(wǎng)絡(luò)中越處于核心位置。使用MCODE插件尋找關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，選取網(wǎng)絡(luò)分數(shù)最高（5.600）的模塊作為目標子網(wǎng)絡(luò)，其由6個節(jié)點和28條連線組成（圖4），包含基因是：FN1、FOS、PPARG、ITGAM、EGR1、CCL2。因此CCL2、PPARG、ITGAM、FN1、FOS、、EGR1為候選中心基因。

圖3 GSEA富集分析結(jié)果

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

4 中心基因的鑒定

GSE76925作為驗證數(shù)據(jù)集進行差異分析及ROC曲線分析，設(shè)置P＜0.05，AUC≥0.65，結(jié)果見圖5，可見FN1及PPARG通過了兩種驗證方式，將其納入中心基因，表明它們對COPD患者診斷能力具有較強特異性和敏感性。

圖5 通過驗證的2個中心基因相對表達量和ROC曲線

5 免疫細胞浸潤分析

利用CIBERSORT算法，我們首先計算了COPD組和正常組樣品在22種免疫細胞浸潤的比例（圖6A）。其中，活化的肥大細胞與中性粒細胞之間正相關(guān)性最強（r＝0.54）；活化的肥大細胞與未活化的肥大細胞之間負相關(guān)性最強（r＝-0.49）（圖6B）。差異表達顯示，與正常組相比，未活化的肥大細胞在COPD組織中的浸潤程度明顯增高；活化的肥大細胞浸潤較低（圖6C）。因此，活化的肥大細胞與未活化的肥大細胞可能是潛在的核心免疫細胞，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

圖6 CIBERSORT分析結(jié)果

6 中心基因與免疫細胞的相關(guān)性分析

將得到的兩個中心基因與22種免疫細胞進行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)，中心基因與9種免疫細胞存在相關(guān)性。其中M0巨噬細胞、M2巨噬細胞與FN1呈正相關(guān)；初始B細胞、漿細胞、濾泡輔助性T細胞與FN1呈負相關(guān)。嗜酸性粒細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞與PPARG呈正相關(guān)；未活化的肥大細胞、未活化的CD4+記憶性T細胞、漿細胞、調(diào)節(jié)性T細胞與PPARG呈負相關(guān)。具體見圖7。

圖7 2個中心基因的表達水平與9種免疫細胞相對比例的相關(guān)性（P＜0.05）

7 中藥及化合物預(yù)測與分子對接

通過檢索Coremine數(shù)據(jù)庫，預(yù)測具有潛在干預(yù)COPD氧化應(yīng)激的中藥，符合P＜0.05的有桑葉、天南星、人參、澤瀉、木香、蓖麻子、丹參、大黃等43味中藥，見表2，根據(jù)P值的大?。≒值越小則關(guān)聯(lián)性越強），排名前5的有人參、大黃、天南星、木香、蘄蛇，見表2、圖8。將43味中藥導(dǎo)入Cytoscape3.9.1構(gòu)建“靶點-中藥”網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進行性味歸經(jīng)統(tǒng)計分析，其中四氣以溫、寒、微溫、微寒為主；五味以甘、苦、辛為主；主要歸肝、肺、脾、胃、腎經(jīng)，見圖9。

圖8 基因-中藥網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 性味、歸經(jīng)統(tǒng)計圖

表2 預(yù)測中藥匯總表

討論

COPD是全球第三大死因，盡管過去十年在診斷和治療選擇方面取得了重大進展，但每年仍有24多萬人死于這種使人衰弱的疾病[11]。鑒于缺乏有價值的生物標志物，早期診斷COPD非常困難的，這種現(xiàn)象進一步導(dǎo)致不良的臨床結(jié)果。最近愈來愈多的文獻表明，氧化應(yīng)激和多種肺系疾病相關(guān)，如急性肺損傷、肺癌和肺囊性纖維化等[12-14]。然而有關(guān)氧化應(yīng)激與COPD的生物信息學(xué)研究并不突出。在本文章中，我們獲取了13個DEOSGs，證實了COPD中確實存在氧化應(yīng)激，并與免疫反應(yīng)有關(guān)。

富集分析提示，DEOSGs主要與激素水平的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、對缺氧的反應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與先前發(fā)現(xiàn)的COPD相關(guān)因素一致。先前的研究已經(jīng)注意到氧化應(yīng)激是COPD的主要發(fā)病驅(qū)動機制之一，由于香煙煙霧和空氣污染中的外源性活性氧以及肺部炎癥和結(jié)構(gòu)細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧增多，會造成氣道上皮細胞損傷，誘導(dǎo)平滑肌細胞增生，致肺功能下降[15]。涉及通路“脂質(zhì)與動脈粥樣硬化”、“糖尿病并發(fā)癥中的AGE信號通路”、“IL-17信號通路” 等，動脈粥樣硬化和COPD作為相互影響的全身性炎癥性疾病，有研究表明COPD在動脈粥樣硬化性動脈疾病患者中非常普遍，脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路可能是干預(yù)兩者的核心通路[16]。GSEA分析從整體上提示，Wnt信號通路在COPD中起重要作用。有研究[17]發(fā)現(xiàn)使用GSK3抑制劑激活Wnt通路，可以減弱香煙煙霧誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷從而治療COPD。

通過進一步差異分析和ROC曲線分析，確定了2個中心基因。纖維連接蛋白1（FN1）屬于FN家族的成員，是一種存在于細胞外中的糖蛋白，參與多種細胞生物學(xué)過程[18-19]。近年來，有研究表明FN1可影響人體免疫微環(huán)境，可以作為早期檢測氣道重塑的生物標志物[20]。Pei[21]等觀察到FN1與香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的氣道上皮細胞的糖皮質(zhì)激素抵抗密切相關(guān)。PPARG是一類由配體調(diào)節(jié)的核激素受體[22]。Zhao[23]等研究發(fā)現(xiàn)PPARG在肺腺癌患者體內(nèi)表達下調(diào)，激活PPARG可能是治療肺腺癌的有效治療策略；且有動物實驗表明PPARG細胞具有顯著的活性氧，提示PPARG會參與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。此前鮮有FN1、PPARG與COPD之間的相關(guān)報道，這些研究增加了中心基因的可信度，并提示FN1、PPARG可作為COPD的生物標志物及治療靶點。此外，我們發(fā)現(xiàn)肥大細胞在COPD與普通人群中存在差異，而PPARG與肥大細胞呈負相關(guān)，這為進一步研究提供了基礎(chǔ)。

COPD屬于中醫(yī)“肺脹”“喘證”“咳嗽”等范疇，病位在肺，與脾腎相關(guān)，本虛、肺氣郁結(jié)或復(fù)感外邪是其發(fā)病的主要機制。通過對COPD氧化應(yīng)激相關(guān)的中心基因進行中藥預(yù)測，結(jié)果提示人參、大黃、天南星、木香、蘄蛇等5味中藥可能是針對COPD患者具有突出治療作用的靶向中藥。Sun等[25]通過體外實驗證明人參的活性成分人參皂苷Rg1可減輕氧化應(yīng)激損傷；薛偉棟等[26]發(fā)現(xiàn)木香的有效成分木香烴內(nèi)酯可通過抑制p53 信號通路從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。四氣五味結(jié)果提示，藥物多寒溫并用，甘苦互施，COPD患者在穩(wěn)定期、后期以本虛為主，而甘能補能緩，主入脾經(jīng)，補后天之本。歸經(jīng)主歸肝、肺、脾經(jīng)，由于COPD患者咳嗽咳痰經(jīng)久不愈，致使肺臟虛損，子盜母氣，則脾臟受累，運化失職，致痰飲內(nèi)生，病久則累及至腎，致腎不納氣?！抖「嗜梳t(yī)案》指出：“肺若懸鐘，撞之則鳴，水虧不能涵木，木叩金鳴”，日久腎病及肝，母病及子，則肝腎陰虛，虛火上炎犯肺發(fā)為病?？梢姳狙芯克A(yù)測中藥與受廣泛認可的COPD的中醫(yī)治療用藥基本相符，為臨床選藥提高新的配伍。

綜上，本研究肯定了氧化應(yīng)激在COPD中的作用，通過相關(guān)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了13個DEOSGs，最終鑒定了2個中心基因，并預(yù)測了相關(guān)治療中藥。然而本研究仍存在一定的局限性，首先本研究樣本量較小，且沒有考慮種族差異和細胞多樣性，其次受回顧性分析的限制，我們?nèi)狈ρ芯繑?shù)據(jù)中重要臨床信息的分析。未來需要更大規(guī)模的前瞻性研究來驗證我們的結(jié)論。