轉(zhuǎn)抗蟲基因107楊對(duì)根際和內(nèi)源細(xì)菌群落的影響*

路文然,任亞超,趙津,王進(jìn)茂,郭甫鑫,張軍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,河北 保定071000;2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071000)

轉(zhuǎn)基因林木種植后對(duì)土壤微生物的影響是全面系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)基因林木對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能不可或缺的內(nèi)容。Edwards等[1-3]認(rèn)為在植物體內(nèi)復(fù)雜的微生物群落中,存在著一些相互作用的菌群,這些菌群之間緊密聯(lián)系,協(xié)同參與多種重要的代謝過程。因此,通過分析內(nèi)生菌相對(duì)豐度上的相關(guān)性,能夠了解微生物之間復(fù)雜的互作關(guān)系,有利于發(fā)掘潛在的功能菌群,可更有效地在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用微生物資源。綜合國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀,轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)對(duì)土壤微生物造成影響尚無定論[4]。金凌波等[5]研究表明,磷高效轉(zhuǎn)基因大豆(Glycinemax)的種植不會(huì)對(duì)根際土壤可培養(yǎng)微生物產(chǎn)生明顯影響。在巴西種植的轉(zhuǎn)Bt 抗蟲基因玉米(Zeamays)與非轉(zhuǎn)基因玉米相比,氨氧化細(xì)菌和古細(xì)菌群落的豐富度差異明顯,不過研究表明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主要受土壤類型和季節(jié)的影響,而受植物基因型的影響較小[6]。Zhang等[7-8]也認(rèn)為作物生育期、土壤理化性質(zhì)和土壤類型等是影響根際微生物結(jié)構(gòu)的主要因素。在轉(zhuǎn)基因楊樹(Populus)方面,李霞等[9]對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(P.nigra)、張雁等[10]對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因南林895楊、馬曉星等[11]對(duì)轉(zhuǎn)AtSnRK2C基因楊樹、呂秀華等[12]的研究結(jié)果中,均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)土壤微生物有負(fù)面影響。

楊樹不僅具有生長速度快、輪伐期短、生命力強(qiáng)、用途廣泛等特點(diǎn),還具有凈化空氣、涵養(yǎng)水源、保持水土、防風(fēng)固沙等生態(tài)作用[13],楊樹已成為解決我國木材供應(yīng)的重要用材樹種,為國家經(jīng)濟(jì)建設(shè)提供了大量木材,發(fā)揮了巨大的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益。土壤被稱為世界上最重要的能源之一,土壤生態(tài)系統(tǒng)與功能直接關(guān)系到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)健康。在轉(zhuǎn)基因植物的生長周期中,外源基因表達(dá)產(chǎn)物主要通過植株殘?bào)w和根系分泌物進(jìn)入土壤,根系生長與土壤接觸伴隨整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物生長周期[14]。美國 EPA(Environmental Protection Agency)將轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)影響列為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要組成部分,因此,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品釋放的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)之一就是對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的評(píng)估。此外,植物內(nèi)生菌與其宿主在長期進(jìn)化過程中形成一種共生或互生的關(guān)系,對(duì)植物的生長發(fā)育、病蟲害防治、植物抗性、生物修復(fù)等方面都有積極的作用,能顯著提高植物的產(chǎn)量和高度[15]。大量研究表明,植物內(nèi)生菌在植物生長發(fā)育過程起重要作用[16-22],楊樹不同生態(tài)位內(nèi)生菌菌群組成和形成機(jī)制尚不清楚,基因轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致受體植物自身一些代謝物的非預(yù)期變異而影響體內(nèi)環(huán)境,進(jìn)而影響植物內(nèi)生微生物定植。在微生物群落的研究方法中,高通量測序技術(shù)克服了平板培養(yǎng)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)等方法的不足,測序速度快、覆蓋度高,能夠全面解析復(fù)雜的微生物群落[23]。16S r DNA 相對(duì)分子量大小適中,突變率小,基于16Sr DNA 的高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物系統(tǒng)進(jìn)化、分類及多樣性研究中。

107楊是由中國林科院張綺紋研究員等從我國1984年引自意大利的“美洲黑楊×歐洲黑楊” (P.deltoides×P.nigra)無性系中選育而成。其材性良好,干型優(yōu)美,樹冠窄,側(cè)枝細(xì),葉滿冠,抗病蟲,抗風(fēng)折,是重要的林業(yè)資源,在林業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位。本研究利用Illumina測序技術(shù),對(duì)3 a生未轉(zhuǎn)基因107楊、轉(zhuǎn)Cry1Ac和Cry3A基因107楊高抗株系DB1和DB15樹干韌皮部、根系及根際土壤進(jìn)行16S V4 區(qū)測序,解析107楊根際土壤、根部、韌皮部細(xì)菌群組成與結(jié)構(gòu)差異,獲得全面的微生物信息,探討轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)根際土壤及內(nèi)源細(xì)菌群落可能造成的影響,以期為轉(zhuǎn)基因林木產(chǎn)業(yè)化的自然生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2022年7月進(jìn)行樣品的采集,選定2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系DB1、DB15和對(duì)照株系(CK)為樣本,每個(gè)小區(qū)選定3株,3次重復(fù)。同時(shí)在樹高1.5 m處采集樹干韌皮部樣品,用滅菌手術(shù)刀輕輕刮開樹皮表面,切取厚1 mm,20×10 cm大小的韌皮部裝入無菌塑封袋中,置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。于采集韌皮部的同一株系,沿樹基部從東、西、南、北4個(gè)方向挖掘深度約30 cm,防止挖斷主根,待根系暴露后用無菌剪刀剪取須根,將根系周圍大塊土壤輕輕抖落后將根系及根系附帶土壤裝入無菌密封袋中。所有采集好的樣品置于干冰環(huán)境中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。樣品信息見表1。

表1 樣品及編號(hào)

1.2 樣品處理

根際土樣品:使用滅菌的細(xì)軟毛刷,輕輕刷掉根系表面的土壤,去除土壤表面毛根并通過1 mm滅菌濾篩,將過篩后的土壤置于50 mL試管中。根系樣品:用無菌水清洗根系表面土8次,將洗凈的根系放于15 mL PBSE中,使用超聲波在50～60 Hz超聲30 s,重復(fù)2次,用無菌吸水紙吸干根系表面水分后,用無菌手術(shù)刀將樣品分成1～2 cm片段,裝入無菌塑封袋。韌皮部樣品:根據(jù)研究選取10 g新鮮植物組織,用無菌水沖洗2遍,后置于無菌塑封袋中。采集韌皮部樣品組織放于50 mL離心管中并置于液氮中保存,干冰條件運(yùn)輸。以上所有處理好的樣品置于-80 ℃保存。

1.3 16S rDNA 測序

16S rDNA為原核生物的核糖體特征編碼序列,常用于細(xì)菌以及古細(xì)菌的物種分類以及進(jìn)化關(guān)系研究。從樣本中提取基因組DNA后,用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增rDNA的保守區(qū),引物序列信息見表2。

表2 引物序列信息

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,采用Quanti Fluor TM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,與測序接頭連接,構(gòu)建測序文庫,Hiseq2500 PE250上機(jī)測序。通過測序得到raw reads之后,過濾低質(zhì)量reads,然后進(jìn)行組裝和過濾,以保證利用最有效數(shù)據(jù)聚類,依次進(jìn)行物種注釋、α多樣性分析、β多樣性分析。在有效分組的情況下進(jìn)行組間差異比較及差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚類分析及稀釋性曲線

聚類分析及稀釋曲線又稱OTU,即分類操作單元。根據(jù)不同的相似度水平,對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分,通常來說,如果有效序列大于97%,即定義為一個(gè)OTU,每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)一種代表序列。使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的UCLUST對(duì)序列(Tags)在97%的相似度水平下進(jìn)行類聚、獲得OTU,并基于細(xì)菌和真菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。方差分析結(jié)果顯示(圖1),不同部位之間轉(zhuǎn)基因DB1、DB15株系與對(duì)照株系之間有顯著差異,相同部位之間只有轉(zhuǎn)基因DBs15株系與對(duì)照株系之間有顯著差異。

圖1 轉(zhuǎn)基因107楊與對(duì)照楊的OTU數(shù)量柱狀圖

稀釋性曲線是利用已測得序列中已知的OTU的相對(duì)比例,來計(jì)算抽取n個(gè)(n小于測得 tags序列總數(shù))tags 時(shí)的α多樣性指數(shù)期望值,然后根據(jù)一組n值與其相對(duì)應(yīng)的α多樣性指數(shù)期望值做出曲線。稀釋性曲線用于評(píng)估序列數(shù)量是否足以覆蓋所有類群,并間接反映樣品中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí),說明測序數(shù)量漸進(jìn)合理,反之則需要增加測序數(shù)據(jù)。如圖2所示:每條曲線代表一個(gè)樣品,用不同顏色標(biāo)記。27個(gè)樣品的稀釋性曲線隨著測序量的增加,所能得到的稀釋性曲線逐漸趨于飽和,表明取樣基本合理。

圖2 轉(zhuǎn)基因107楊與對(duì)照楊微生物群落多樣性的稀釋性曲線

2.2 物種注釋及相對(duì)豐度

根據(jù)不同層級(jí)分類水平上不同樣品的物種組成情況,用堆疊圖的形式,直觀展示不同樣品在各個(gè)分類層級(jí)水平上的物種豐度的變化情況。無法注釋到該水平的tags則被歸類到Unclassified類別。由圖3可知,各樣品的優(yōu)勢細(xì)菌群落相同,主要分布于以下10個(gè)門:變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetacia)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)。10個(gè)門類細(xì)菌在所有細(xì)菌中所占百分比達(dá)97%,其中變形菌門為根部樣品中的優(yōu)勢菌門,占比40.7%～58.8%。酸桿菌門和變形菌門為根際土壤樣品中的優(yōu)勢菌門,占比16.6%～21.9%。藍(lán)藻菌門和變形菌門為韌皮部樣品中的優(yōu)勢菌門,占54.8%～59.2%。整體上看,轉(zhuǎn)基因株系DB1、DB15菌類組成與對(duì)照株系CK極其相似,但各類細(xì)菌的數(shù)量存在差異。對(duì)照的根部變形菌門細(xì)菌數(shù)量高于轉(zhuǎn)基因株系,對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系藍(lán)藻細(xì)菌數(shù)量無明顯差異;轉(zhuǎn)基因株系根部放線菌門細(xì)菌數(shù)量高于對(duì)照株系;轉(zhuǎn)基因株系根際土各類細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照基本無差異。

圖3 微生物物種組成及分布(門水平)

微生物數(shù)目或種類發(fā)生變化,通常會(huì)導(dǎo)致樣本性質(zhì)發(fā)生改變。為了觀測不同環(huán)境中物種的變化情況,可以對(duì)物種在不同環(huán)境下的豐度進(jìn)行聚類分析。物種豐度作為觀測微生物指標(biāo)的重要變量,可以通過繪制微生物物種豐度聚類熱圖來觀察不同樣本的分布情況。對(duì)CK株系和轉(zhuǎn)基因DB1和DB15株系的不同樣品物種豐度的聚類分析(圖4)可以看出,27個(gè)樣品中物種豐度較高的細(xì)菌有24個(gè)門,不同株系的根際土樣本形成一個(gè)分支,韌皮內(nèi)微生物和根內(nèi)微生物形成一個(gè)分支,但是根內(nèi)微生物又獨(dú)立形成一個(gè)分支,表明大部分根內(nèi)微生物、韌皮內(nèi)微生物和根際土微生物分別聚類到一起。其中,只有CKp-1沒有與其它韌皮內(nèi)微生物聚類到一起,而與根內(nèi)微生物聚在一起,說明除CKp-1外,其余不同株系的相同部位微生物物種豐度差異不顯著。梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、棲熱菌門(deinococcus-thermus)、擬桿菌門(Bacteriodetes)在韌皮部豐度最高,而放線菌門(Actinobacteria)在根內(nèi)豐度最高,其余細(xì)菌在根際土內(nèi)豐度最高。聚類結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因107楊對(duì)微生物物種豐度沒有影響。

圖4 樣品門水平的微生物物種相對(duì)豐度

2.3 擴(kuò)增子—α多樣性分析

α多樣性是指微生物在特定生物環(huán)境或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種數(shù)目的多樣性情況,主要利用不同生境內(nèi)微生物種類與分布兩個(gè)參數(shù)來計(jì)算。其中超1指數(shù)(Chao1)、基于豐度的覆蓋估計(jì)指數(shù)(Abundance-based Coverage Estimator,簡稱ACE)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)是常用的α多樣性指數(shù)。Chao1、ACE 指數(shù)主要反應(yīng)樣本的物種豐富度信息,數(shù)值越大,多樣性越高;Simpson、Shannon綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度,數(shù)值越大,多樣性越高。如表3所示,轉(zhuǎn)基因株系DB1和DB15在韌皮內(nèi)、根內(nèi)和根際土內(nèi),微生物在香農(nóng)指數(shù)上與對(duì)照株系不存在差異;轉(zhuǎn)基因株系DB1和DB15在韌皮內(nèi)和根際土內(nèi),微生物在辛普森指數(shù)上與對(duì)照株系不存在差異,只有在根內(nèi)存在差異。對(duì)照株系韌皮部和根部微生物的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)低于轉(zhuǎn)基因株系,說明對(duì)照株系韌皮部內(nèi)和根內(nèi)微生物豐富度和均勻度較低,其他指數(shù)無顯著差異?？傮w而言,韌皮內(nèi)生菌群落中物種的數(shù)量最低,而根際土和根內(nèi)樣品群落中的物種數(shù)量較高,根際土樣品中細(xì)菌群落表現(xiàn)出最高的物種多樣性。

表3 各樣品α多樣性指數(shù)

2.4 等級(jí)豐度曲線分析

將樣品中的OTUs按相對(duì)豐度(或者包含的序列數(shù)目)由大到小排序得到對(duì)應(yīng)的排序編號(hào),再以O(shè)TUs的排序編號(hào)為橫坐標(biāo),OTUs中的相對(duì)豐度(也可用該等級(jí)OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量)為縱坐標(biāo),將這些點(diǎn)用折線連接,即繪制得到等級(jí)豐度曲線(Rank Abundance)。該曲線可直觀地反映樣品中包含的分類豐富度和均勻度,即在水平方向,分類的豐度由曲線的寬度來反映,分類的豐富度越高,曲線在橫軸上的跨度越大;在垂直方向曲線的平滑程度,反映了樣品中分類的均勻程度,曲線越平緩,物種分布越均勻。由圖5可以看出,韌皮內(nèi)微生物在水平方向主要分布1 200～2 800之間,根內(nèi)微生物在水平方向分布在2 800～4 800之間,根際土微生物主要分布在6 000～9 600,根際土微生物在橫軸上的跨度最大,豐富度最高且在垂直方向上最平緩,說明物種分布均勻程度最高。對(duì)照組韌皮內(nèi)微生物在垂直方向最陡,物種分布均勻度最低。說明在3個(gè)不同采樣部位之間,微生物群落的豐富度和均勻度存在一定的差異和規(guī)律,但是在轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系中沒有明顯的差異。

圖5 樣品微生物群落多樣性等級(jí)豐度曲線

2.5 生境間的多樣性分析

通過主坐標(biāo)分析(PCoA,Principal Co-ordinates Analysis)來研究不同樣品間微生物群落的相似性。該方法通過一種不受約束的降維方法找到主坐標(biāo)與樣本間的距離,從而判斷群落相似性,結(jié)果如圖6所示,主坐標(biāo)PCo1坐標(biāo)軸的解釋度為53.3%,PCo2坐標(biāo)軸的解釋度為26.43%,兩個(gè)主坐標(biāo)軸的總解釋度達(dá)到79.73%,說明PCoA聚類圖可以很好地反映出細(xì)菌多樣性差異。韌皮部、根際土和根內(nèi)樣本間并未出現(xiàn)聚類現(xiàn)象,說明樣品具有良好的重復(fù)性。從PCo1維度上看,韌皮部可以與根、根際土更好地分離出來,說明根內(nèi)和根際土壤微生物群落組成更相似,與韌皮部微生物群落組成差異較大。

圖6 微生物分類群落PCoA分析

2.6 非加權(quán)配對(duì)平均法的聚類分析

非加權(quán)配對(duì)平均法分析(UPGMA,Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)是一種常用的聚類分析方法?；贐eta多樣性分析得到的4種距離矩陣,通過R語言的Pheatmap包對(duì)樣品進(jìn)行UPGMA分類樹分類,以判斷各樣品間物種組成的相似性。圖7是基于bray計(jì)算方法得到的樣品層次聚類樹,其中越相似的樣本將擁有越短的共同分支。由圖7可知,根內(nèi)、韌皮部微生物樣品優(yōu)先形成一個(gè)分支,根際土微生物樣品單獨(dú)聚類在一起,根內(nèi)、韌皮部微生物再分別聚類到一起,即相同采樣部位間微生物物種組成差異不顯著。韌皮部微生物分支最短,物種相似度最高,其次為根際土微生物,根部物種組成分支最長,相似性最低,說明韌皮部和根際土物種組成相似度要略高于根部內(nèi)微生物物種組成。

圖7 樣品微生物UPGMA聚類分析

2.7 指示物種分析

指示物種(biomarker)是指對(duì)分組等特征有指示作用的物種。指示物種的分析方法很多,比如韋恩圖,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),LEfSe等。此外,還有不依賴檢驗(yàn)的隨機(jī)森林模型、Indicator value計(jì)算等方法[24-25]。

2.7.1 韋恩圖分析

利用韋恩(Venn)圖可以展示樣品之間共有、特有OTU數(shù)目,直觀地表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況。結(jié)合OTU所代表的物種,可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。對(duì)3種不同部位樣品的微生物進(jìn)行韋恩圖分析,根據(jù)不同組分間OTU與物種豐度比值的分析,明確樣品間共同存在或者特有的微生物數(shù)量及種類,結(jié)果如圖8所示。

圖8 樣本細(xì)菌OTU物種韋恩圖(門水平)

3個(gè)株系間韌皮部內(nèi)微生物共有的物種數(shù)為28個(gè),DB1獨(dú)有物種1個(gè),DB15獨(dú)有物種1個(gè);根內(nèi)共有的物種數(shù)為31個(gè),對(duì)照組獨(dú)有1個(gè),DB15獨(dú)有2個(gè),DB1獨(dú)有3個(gè);根際土共有34個(gè)物種,只有DB15獨(dú)有3個(gè)物種,為螺旋毛蟲(Spirochaetota)。轉(zhuǎn)基因107楊DB1、DB15株系和對(duì)照楊共有微生物物種數(shù)均占總數(shù)的70%以上,3個(gè)部位獨(dú)有的物種數(shù)量所占比例的總數(shù)均沒超過20%,表明3個(gè)部位樣品中的微生物種類差異較小。上述分析可以看出轉(zhuǎn)基因楊樹和非轉(zhuǎn)基因楊樹樣品中的微生物種類差異較小。

2.7.2 富集三元圖分析

當(dāng)對(duì)照組有3個(gè)分組時(shí),基于Kruskal-Wallis檢驗(yàn)的差異分析結(jié)果,以三元圖(R語言ggtern包)展示各分組顯著富集(P<0.05)的物種數(shù)量,物種的相對(duì)豐度等信息,三元圖用于展示3個(gè)組間物種差異檢驗(yàn)結(jié)果,通過不同顏色表示物種所富集到的分組,直觀展示每個(gè)分組中組間顯著差異的物種。如圖9所示,通過三元相關(guān)圖(目水平)分析得知,3個(gè)株系的韌皮內(nèi)微生物顯著富集的物種只有1個(gè)目,放線菌目(Actinomycetes),集中富集在轉(zhuǎn)基因株系DB15中;3個(gè)株系的根內(nèi)微生物顯著富集的物種有4個(gè)類群,均集中富集在轉(zhuǎn)基因株系中,藍(lán)藻門(Cyanophyta)、酸桿菌目(Acidobacteriales)和多囊菌目(Polyangiales)顯著富集在DB1株系中,黃單胞菌目(Xanthomonadales)顯著富集在DB15株系中;3個(gè)株系的根際土微生物顯著富集的物種共10個(gè)目,只有巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)和熱土厭氧棒菌(Anaerobaculumthermoterrenum)顯著富集在對(duì)照株系中?？傮w而言,相同株系不同部位間細(xì)菌群落組成和豐度在根和韌皮內(nèi)差異較小,而與韌皮部群落組成差異較大,其中根際土微生物最豐富。

圖9 微生物群落富集三元圖

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

許多研究表明,變形菌門一般為各土壤樣品中的優(yōu)勢菌門[26-27],在土壤中變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌、厚壁菌門、放線菌、酸桿菌門、藍(lán)藻菌門、綠彎菌門等是較為常見的菌門,一般在林地土壤中可占總比例的90%以上,這與本研究的結(jié)果一致。轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系在菌類物種組成門水平下沒有明顯差異,而相同株系不同部位樣品之間的物種組成存在一定的差異。影響植物體內(nèi)微生物種類和數(shù)量變化的因素有多種,首先是植物生長環(huán)境的穩(wěn)定性和復(fù)雜性,有研究認(rèn)為根際生境由于可提供大量的內(nèi)在碳源,如糖類、氨基酸、有機(jī)酸等,因而成為更加復(fù)雜的微生物棲息地[28],受到外界環(huán)境影響也就更大了。有研究揭示植物基因型是根際菌群落形成的一個(gè)重要決定性因素[29-30],大量的研究證明土壤類型、種植年限和田地的異質(zhì)性等因素,要比外源基因插入植物會(huì)更多地干擾根相關(guān)微生物群落的組成[31-32],其次是植物自身的生長需要,內(nèi)生菌普遍存在于高等植物中,植物內(nèi)生菌可以刺激植物生長或提高宿主植物的自然抗性[33-34]。本研究中轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照間微生物存在少量差異物種,通過統(tǒng)計(jì)分析,僅有個(gè)別菌種顯著富集,且富集物種豐度極低。不同種類的植物,甚至是生長在相同環(huán)境的同種類植物都會(huì)具有獨(dú)特的內(nèi)生菌類型[35-37],多種因素共同影響著植物體內(nèi)微生物群落的組成。

本研究中轉(zhuǎn)抗蟲基因107楊的根系與韌皮部內(nèi)生細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)差異相對(duì)較小,在物種均勻度方面也沒有表現(xiàn)出明顯差異。Shannon指數(shù)分析說明了轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系差異不大,不同部位之間差異較顯著;Simpson指數(shù)在根際土壤、根部和韌皮部之間都沒有顯著差異,物種分布均勻,多樣性高;轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系之間也沒有顯著差異。

3.2 結(jié)論

對(duì)轉(zhuǎn)基因107楊DB1、DB15株系和對(duì)照株系的不同部位(韌皮部、根、根際土)的微生物群落進(jìn)行高通量測序分析可知,在根際土壤、根部和韌皮部轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照之間的細(xì)菌群落組成沒有表現(xiàn)出明顯差異,不同部位之間差異顯著。韌皮部和根部的細(xì)菌群落組成相似度極高,二者與根際土壤的細(xì)菌群落組成差異較大。根際土壤和韌皮部細(xì)菌的豐富度高于根部。多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)抗蟲基因107楊內(nèi)生細(xì)菌種類豐富,沒有對(duì)韌皮、根、根際土中的微生物群落多樣性產(chǎn)生影響。綜上所述說明轉(zhuǎn)基因楊樹未對(duì)自身和土壤中的細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著的影響。研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因楊樹的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)提供了參考,同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因楊樹環(huán)境釋放后的自然生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了更加系統(tǒng)的認(rèn)識(shí),對(duì)其生物安全性全面、系統(tǒng)的研究有待進(jìn)一步深入。