益肺湯調(diào)控TGF-β1/Smad2通路抗肺纖維化機(jī)制研究

鄧祥麗,陳麗娟,邵 梅,吳 梅,楊 梅,吳海茵,馬信文,黃 芬

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650051;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650021)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是一種慢性、進(jìn)行性、年齡相關(guān)性的間質(zhì)性肺疾病,其病理特征為成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積(Extracellular matrix,ECM)、肺結(jié)構(gòu)破壞及其功能喪失,臨床主要表現(xiàn)為活動(dòng)性呼吸困難,呈進(jìn)行性加重,預(yù)后多不良,最終因呼吸衰竭而死亡[1-2]。PF好發(fā)于老年人,起病隱匿,屬肺系難治性疾病,其發(fā)病率逐年上升,中位生存期僅為3～5年[3]。目前,PF的臨床治療藥物主要是吡非尼酮、尼達(dá)尼布,但其療效有限,不良反應(yīng)也較為明顯[4]。因此,研究PF的發(fā)病機(jī)制,提供更多的治療方案,是目前PF亟待解決的問題。研究顯示,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是PF的重要啟動(dòng)因子,可激活下游多種Smads蛋白,其中Smad2和Smad3是兩個(gè)主要的下游調(diào)節(jié)劑[5-6]。通過激活Smad通路,介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞分化,且分泌大量α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ,Col Ⅰ)、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)等細(xì)胞外基質(zhì)(EJCM)成分,加速PF進(jìn)程[7-9]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)是重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng),近年來研究顯示RAS和肺損傷關(guān)系密切,其中血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是RAS中的重要效應(yīng)肽,在PF的發(fā)生、進(jìn)展過程中伴隨著Ang Ⅱ水平的升高[10-11]。

本研究團(tuán)隊(duì)基于多年臨床研究認(rèn)為肺脾兩虛、氣血失衡是PF的基本病機(jī),研創(chuàng)出益肺湯,治以健脾益肺、調(diào)氣活血,在PF患者治療過程中獲得了良好的療效反饋。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn),Ang Ⅱ誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,觀察TGF-β1/Smad2信號(hào)活化在益肺湯抑制肺纖維化中的作用,從調(diào)控TGF-β1/Smad2信號(hào)通路揭示益肺湯抗肺纖維化的機(jī)制,為該方的臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞:NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(批號(hào)BNCC339681,北納生物);SPF級(jí)C57小鼠[批號(hào)SCXK(湘)2016-0002,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司]40只,體重20～25 g,6～8周齡。

1.1.2 主要試劑及儀器:Ang Ⅱ(批號(hào)A9525,SIGMA);Rabbit Anti-alpha smooth Actin Polyclonal Antibody(批號(hào)bs-10196R,Bioss);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(批號(hào)ZB-2301,中杉金橋);Rabbit Anti-Smad2 Polyclonal Antibody (批號(hào)bs-0718R,Bioss);Goat Anti-Rabbit IgG Cy3,Conjugated(批號(hào)CW0159S,CWBIO);即用型DAPI染液(批號(hào)KGA215-50,凱基);Rabbit Anti-α-SMA (批號(hào)bs-10196R,Bioss);Rabbit Anti-FN(批號(hào)ab32419,abcam);Rabbit Anti-Col Ⅰ (批號(hào)AF7001,Affinity);Rabbit Anti-Smad2 (批號(hào)ab40855,abcam);潔凈工作臺(tái)(型號(hào)BBS-SDC,BIOBASE);顯微鏡(型號(hào)CX41,OLYMPUS);蛋白垂直電泳儀(型號(hào)DYY-6C,北京六一儀器廠);超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[型號(hào)Chemi DocTM XRS+,(上海)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益肺湯水煎液制備:益肺湯由炙桑白皮、桃仁、炒枳實(shí)、桔梗各12 g,生白術(shù)10 g,丹參18 g,甘草6 g組成,中藥材購于云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房;將中藥飲片進(jìn)行常規(guī)煎煮、過濾、真空減壓濃縮,濃縮至生藥含量3 g/ml濃度,分裝,-80 ℃環(huán)境下保存、備用。

1.2.2 含藥血清的制備:參照相關(guān)文獻(xiàn)制備益肺湯含藥血清[12-13]。40只SPF級(jí)C57小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,給予益肺湯灌胃,1次/d,連續(xù)給藥3 d,給藥劑量11.2 g/(kg·d)。末次給藥后1 h主動(dòng)脈取血,將所得血清用DMEM配成20%含藥血清溶液,靜置于4 ℃冰箱4 h后2500 r/min離心25 min,分離血清同組混合于56 ℃水浴滅活30 min,0.22 μm濾器過濾,分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組:參考成文媛等[14]前期實(shí)驗(yàn)研究,將40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+正常血清組、模型+含藥血清組,每組10只。正常對(duì)照組:同條件培養(yǎng)更換培養(yǎng)液但不做藥物干預(yù)及Ang Ⅱ處理;模型組:使用100 ng/μl的Ang Ⅱ 稀釋液處理細(xì)胞;模型+正常血清組:100 ng/μl的Ang Ⅱ誘導(dǎo)+正常組血清10%;模型+含藥血清組:100 ng/μl的Ang Ⅱ誘導(dǎo)+益肺湯含藥血清10%。接種細(xì)胞至50%匯合度時(shí)模型+正常血清組、模型+含藥血清組按照實(shí)驗(yàn)方案加入血清,處理48 h后,將模型組、模型+正常血清組、模型+含藥血清組換成含有0.1%FBS的培養(yǎng)基饑餓處理24 h,再按照實(shí)驗(yàn)方案,用100 ng/μl的Ang Ⅱ進(jìn)行誘導(dǎo)。給藥24 h后,給至下游檢測。

1.2.4 免疫組化檢測α-SMA:取4%的多聚甲醛進(jìn)行樣本固定15 min,PBS浸洗培養(yǎng)皿3次,打孔,0.5%Triton X-100(PBS配制)進(jìn)行室溫通透20 min。加入新鮮配制的3%雙氧水,室溫孵育10 min,PBS充分淋洗。培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA,37 ℃封閉30 min。滴加一抗α-SMA(1∶200)至培養(yǎng)皿內(nèi),4 ℃孵育過夜。PBS浸洗玻片后滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液,37 ℃孵育30 min,洗滌后DAB顯色,蘇木精復(fù)染,封片鏡檢。

1.2.5 免疫熒光檢測Smad2:用4%的多聚甲醛固定樣本15 min,PBS浸洗培養(yǎng)皿,0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。PBS浸洗,滴加5% BSA,37 ℃封閉30 min。滴加一抗NSE(1∶200),4 ℃孵育過夜。PBS浸洗后滴加熒光二抗Cy3(1∶200),37 ℃孵育30 min,PBS浸洗,滴加DAPI避光孵育5 min,PBS沖洗,封片鏡檢。

1.2.6 Western blot檢測α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2:將各組細(xì)胞加入200 μl的RIPA細(xì)胞裂解液,充分冰上裂解30 min后,12000 r/min離心10 min,吸取上清液,提取細(xì)胞蛋白。按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠,蛋白變性,上樣,凝膠電泳1～2 h后,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30～50 min,3%的脫脂牛奶封閉液封閉1 h。PVDF膜孵育一抗,4 ℃過夜,TBST洗膜;二抗溶液中室溫孵育1～2 h,再次洗膜。加入ECL發(fā)光液,進(jìn)行顯影成像。Quantity One分析各條帶灰度值。

1.2.7 ELISA檢測TGF-β1:參照TGF-β1試劑盒說明書,空白孔調(diào)零,用450 nm波長進(jìn)行各孔的吸光度(OD值)測量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的濃度、OD值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,根據(jù)此方程式,計(jì)算出樣品濃度,然后乘以稀釋倍數(shù),即可獲得樣品實(shí)際濃度。

2 結(jié) 果

2.1 益肺湯對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果見圖1。棕褐色表示α-SMA蛋白。使用100 ng/μl的Ang Ⅱ?qū)?xì)胞造模后發(fā)現(xiàn)α-SMA蛋白表達(dá)略上調(diào),使用益肺湯含藥血清干預(yù)48 h后造模,α-SMA蛋白表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)上調(diào),但是上調(diào)的程度低于模型組。

圖1 免疫組化檢測α-SMA(蘇木精染色,×200)

2.2 益肺湯對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞Smad2蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光檢測結(jié)果見圖2。紅色熒光表示Smad2蛋白。使用100 ng/μl的Ang Ⅱ?qū)?xì)胞造模后發(fā)現(xiàn)Smad2蛋白表達(dá)上調(diào),使用益肺湯含藥血清干預(yù)48 h后造模,Smad2蛋白表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)上調(diào),但是上調(diào)的程度低于模型組。

圖2 免疫熒光檢測Smad2(DAPI染色,×200)

2.3 益肺湯對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果見表1(圖3)。與正常對(duì)照組比較,模型組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,模型+含藥血清組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2顯著降低(均P<0.05)。

表1 各組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達(dá)比較

圖3 Western blot檢測α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2蛋白水平

2.4 益肺湯對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響 ELISA檢測結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組比較,模型組TGF-β1水平顯著升高(P<0.05),與模型組比較,模型+含藥血清組TGF-β1水平低于模型組(P<0.05)。

表2 各組TGF-β1表達(dá)比較

3 討 論

PF是一種嚴(yán)重的、不可逆的彌漫性肺間質(zhì)性疾病,是多種間質(zhì)性肺病的終末期改變,預(yù)后較差,發(fā)病率、病死率較高[15-16]。PF中醫(yī)病名多歸于“肺痿”“肺痹”范疇,病位在肺,與脾相關(guān)?！爸T氣者,皆屬于肺”,肺主呼吸之氣,脾主運(yùn)化水谷精氣,此謂“肺為主氣之樞,脾為生氣之源”。脾為后天之本,氣血生化之源,肺脾皆為多氣多血之臟。肺脾經(jīng)絡(luò)相連,五行相生,緊密聯(lián)系,共主氣血生成、運(yùn)行[17-18]。肺脾兩虛,氣血生化不足,肺葉失養(yǎng),則痿弱不用;氣機(jī)失調(diào),氣血失和,津留成痰,血滯成瘀,痰瘀膠結(jié),痹阻肺絡(luò),虛實(shí)夾雜,惡性循環(huán),導(dǎo)致病情纏綿難愈?！皻馔ㄑ?何患不除”,氣血以流暢、平衡為貴,調(diào)理氣血,平衡陰陽,則疾患消除[19]。

本研究團(tuán)隊(duì)立足于氣血,聯(lián)系肺脾相關(guān)理論,從肺脾同治、氣血同調(diào)出發(fā),研創(chuàng)益肺湯。方中炙桑白皮甘寒入肺經(jīng),有瀉肺平喘、利水消腫之功;白術(shù)、枳實(shí)出自《脾胃論》中枳術(shù)丸,借五行相生的理論,培土生金,正如《石室秘錄》云:“治肺之法,正治甚難,當(dāng)轉(zhuǎn)以治脾,脾氣有養(yǎng),則土自生金”;“熱在上焦,因咳為肺痿”,形成肺痿的中間環(huán)節(jié)是虛熱熏灼于肺,肺失清肅而咳,加丹參、桃仁以清熱活血,氣血同治,以奏“疏其血?dú)?令其條達(dá)而致和平”之效;桔梗、甘草寬胸理氣,止咳化痰,且桔梗為“舟楫之藥”,可引諸藥入肺經(jīng)。全方共奏健脾益肺、調(diào)氣活血之功,具有臟腑兼顧、宣降結(jié)合、氣血同調(diào)之特點(diǎn),體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念?；诒菊n題前期臨床研究,益肺湯可有效改善PF患者癥狀,延緩PF進(jìn)展。

持續(xù)的炎癥反應(yīng)、損傷誘發(fā)機(jī)體啟動(dòng)抗炎、反復(fù)修復(fù),導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞,α-SMA、Col Ⅰ、FN等細(xì)胞外基質(zhì)在肺內(nèi)堆積,破壞肺結(jié)構(gòu),促進(jìn)PF發(fā)生[20]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,亦是肌成纖維細(xì)胞具有收縮活性的基礎(chǔ),參與合成Col Ⅰ、FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分,其含量可作為判定PF程度的間接指標(biāo)[21-23]。本研究顯示,WB和免疫熒光顯示,造模后,α-SMA、FN、Col Ⅰ的相對(duì)表達(dá)均顯著升高。含藥血清干預(yù)48 h后造模,α-SMA、FN、Col Ⅰ的相對(duì)量較模型組均下降。本研究結(jié)果表明,益肺湯可下調(diào)α-SMA、FN、Col Ⅰ的表達(dá),抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)NIH-3T3增殖,降低細(xì)胞外基質(zhì)水平,從而改善PF。大量研究結(jié)果顯示,TGF-β通路是調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖、活化,促進(jìn)PF發(fā)展的主要信號(hào)通路,其中TGF-β1參與調(diào)控細(xì)胞增生、分化、凋亡、黏附以及運(yùn)動(dòng),是促進(jìn)ECM過度產(chǎn)生、抑制降解的關(guān)鍵細(xì)胞因子[24-27]。相關(guān)研究表明,肺成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)受TGF-β的調(diào)控,TGF-β1刺激后,細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)上調(diào),且TGF-β1劑量水平與PF進(jìn)展呈正相關(guān)[28]。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示,α-SMA、TGF-β1是導(dǎo)致PF的重要因素,并可能協(xié)同參與其形成。TGF-β1可促進(jìn)Col Ⅰ、FN等ECM合成、過度沉積,促使成纖維細(xì)胞過度增殖,肌成纖維細(xì)胞大量產(chǎn)生,最終出現(xiàn)肺纖維化[29]。TGF-β1激活Smad信號(hào)通路,Smad蛋白家族是TGF-β1下游的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器,其中Smad2是Smad家族中的主要活化蛋白之一,磷酸化的Smad2與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體,進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄促纖維化基因,導(dǎo)致ECM大量積聚,促使纖維化的形成[30-31]。相關(guān)研究亦表明,通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路異常激活可改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化病變[32]。本研究顯示,Ang Ⅱ誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad2表達(dá)升高,益肺湯降低了TGF-β1、Smad2的表達(dá),表明益肺湯可通過調(diào)控TGF-β1/Smad2信號(hào)通路,抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)NIH-3T3的轉(zhuǎn)化,從而阻止PF進(jìn)展。

綜上所述,益肺湯通過調(diào)控TGF-β1/Smad2信號(hào)通路,下調(diào)Col Ⅰ、α-SMA、FN的表達(dá),抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而發(fā)揮其抗肺纖維化的作用。