基于一測(cè)多評(píng)結(jié)合熵權(quán)逼近理想解排序法對(duì)綿馬貫眾炭的質(zhì)量評(píng)價(jià)

董雙濤，徐麗霞，高建平，李寶霞*

1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031

2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 晉中 030600

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨DryopteriscrassirhizomaNakai 的干燥根莖和葉柄殘基，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、河北及內(nèi)蒙古等地[1-2]，所含化學(xué)成分有間苯三酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)和苯丙素類(lèi)等[3-6]。綿馬貫眾炭由綿馬貫眾炮制加工而成[7]，收澀止血，臨床上常用于治療崩漏下血、衄血、吐血、便血、外傷出血等多種出血證[8-9]。綿馬貫眾炭收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，但質(zhì)量控制僅局限于性狀、薄層鑒別及浸出物測(cè)定等常規(guī)項(xiàng)，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)落后。中藥成分復(fù)雜，易受產(chǎn)地、炮制方法和采收時(shí)間影響，為保證臨床療效，建立科學(xué)合理質(zhì)量評(píng)價(jià)模式對(duì)綿馬貫眾炭整體質(zhì)量評(píng)控具有重要意義。本研究收集16 批綿馬貫眾藥材，按《中國(guó)藥典》2020 年版綿馬貫眾炭項(xiàng)下的炮制方法依法炮制，采用一測(cè)多評(píng)（QAMS）法同時(shí)測(cè)定綿馬貫眾炭中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷含量，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析和EW-TOPSIS 法建立綿馬貫眾炭質(zhì)量研究模型，綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地所得綿馬貫眾炭的整體質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

1 材料

1.1 試藥

對(duì)照品大豆素（批號(hào)111502-202304，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）和異槲皮素（批號(hào)111809-202205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；山柰素（批號(hào)PRF9022621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、圣草次苷（批號(hào)PRF9121402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、偽綿馬素（批號(hào)PRFM8042518，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）和綿馬貫眾素ABBA（批號(hào)PRFM220725-01，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%）來(lái)源于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司； 對(duì)照品白綿馬素 AA （ 批號(hào)RFSB14102203029，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）來(lái)源于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；二去甲基偽綿馬素AA（批號(hào)P27A11S122507，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）和去甲氧基莢果蕨素（批號(hào)Z27J11S103919，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）來(lái)源于上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品白綿馬素AP（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）、綿馬酸ABA（批號(hào)CFS202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.5%）來(lái)源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；綿馬貫眾經(jīng)山西藥科職業(yè)學(xué)院李寶霞副教授鑒定為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨D.crassirhizomaNakai 的干燥根莖和葉柄殘基，按照《中國(guó)藥典》2020 年版方法制成綿馬貫眾炭，詳細(xì)信息見(jiàn)表 1；高效液相用乙腈和磷酸為Merck 公司色譜純?cè)噭?，甲醇為分析純?/p>

1.2 儀器

FRQ-1010T 型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；色譜柱Symmetry C18、Agilent Zorbax C18和Apollo C18，規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ME24102/XS205Du 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定后用70%甲醇制成含白綿馬素AA 0.226 mg/mL、二去甲基偽綿馬素AA 0.114 mg/mL、偽綿馬素0.31 mg/mL、白綿馬素AP 0.058 mg/mL、綿馬酸ABA 0.082 mg/mL、綿馬貫眾素 ABBA 0.57 mg/mL、山柰素 0.436 mg/mL、大豆素0.074 mg/mL、去甲氧基莢果蕨素2.39 mg/mL、異槲皮素0.278 mg/mL 和圣草次苷0.042 mg/mL 的貯備液；精密吸取貯備液1 mL，經(jīng)70%甲醇稀釋20 倍，搖勻，即得白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷質(zhì)量濃度依次為11.3、5.7、15.5、2.9、4.1、28.5、21.8、3.7、119.5、13.9、2.1 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取各產(chǎn)地綿馬貫眾綿馬貫眾炭粉末約1.0 g，精密稱(chēng)定，加70%甲醇約20 mL，超聲提取30 min，冷卻，經(jīng)提取溶劑定容至25 mL，搖勻，靜置，濾過(guò)，即得。

2.3 色譜條件

采用Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)298 nm 檢測(cè)白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA 和綿馬貫眾素ABBA，330 nm 檢測(cè)山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷；流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），分析時(shí)長(zhǎng)60 min，梯度洗脫條件：0～11 min，52.0% B；11～18 min，52.0%～60.0% B；18～34 min，60.0%～85.0%B；34～53 min，85.0%～90.0% B；53～60 min，90.0%～52.0% B；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.4 HPLC 方法學(xué)考察

2.4.1 耐用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，結(jié)果基線(xiàn)平穩(wěn)，供試品溶液中11種成分的保留時(shí)間與對(duì)照品基本一致，且與相鄰色譜峰分離效果符合《中國(guó)藥典》2020 年版要求，見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和綿馬貫眾炭樣品 (B) 色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference (A) and Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum sample (B)

2.4.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)儲(chǔ)備液適量，分別用70%甲醇稀釋4、10、20、40、100 和200 倍制成一定質(zhì)量濃度差的6 份溶液。各精密吸取10 μL 進(jìn)樣。橫坐標(biāo)（X）為白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷對(duì)照品的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（Y）為相應(yīng)色譜峰峰面積。對(duì)11個(gè)成分峰面積繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，r均大于0.999，11 個(gè)對(duì)照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 11 個(gè)成分的線(xiàn)性回歸結(jié)果Table 2 Linear regression results of 11 components

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取綿馬貫眾炭（S1）樣品制成的供試品溶液1 份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果白綿馬素AA 等11 個(gè)成分峰面積RSD 值依次為0.66%、0.52%、1.06%、0.83%、1.38%、1.54%、1.67%、0.71%、1.68%、1.46%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取綿馬貫眾炭（S1）樣品按“2.2” 項(xiàng)下方法制成的供試品溶液，分別于室溫下放置 0、2、5、9、14、20、24 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果白綿馬素AA 等11 個(gè)成分峰面積RSD 值依次為1.01%、0.95%、1.58%、1.05%、1.61%、1.55%、1.85%、1.12%、1.91%、1.78%、1.46%。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取綿馬貫眾炭（S1）樣品6 份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各精密吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄白綿馬素AA等11 個(gè)成分的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算11 個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算各成分含量的RSD 值依次為1.09%、0.91%、1.28%、1.16%、1.76%、1.85%、1.79%、1.32%、1.96%、1.76%、1.80%，表明重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取9 份同批次已知11 個(gè)成分含量的綿馬貫眾炭（S1）細(xì)粉，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，按已知各成分含量的80%、100%、120%加入混合對(duì)照品溶液（含0.129 mg/mL 白綿馬素AA、0.068 mg/mL 二去甲基偽綿馬素AA、0.224 mg/mL 偽綿馬素、0.032 mg/mL 白綿馬素AP、0.047 mg/mL 綿馬酸ABA、0.391 mg/mL 綿馬貫眾素ABBA、0.283 mg/mL 山柰素、0.041 mg/mL 大豆素、1.762 mg/mL 去甲氧基莢果蕨素、0.157 mg/mL 異槲皮素和0.024 mg/mL 圣草次苷的溶液），每個(gè)水平制備3 份，再按“2.2”項(xiàng)方法制得加樣供試品溶液。各精密吸取10 μL，按照確立的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷加樣回收率分別為98.23%、97.95%、99.44%、97.70%、96.99%、100.01%、99.06%、100.15%、98.16%、99.52%、96.95%；RSD 分別為1.34%、1.40%、0.86%、1.34%、0.84%、0.77%、1.04%、1.89%、0.75%、1.50%、1.48%。

2.5 一測(cè)多評(píng)法質(zhì)量評(píng)價(jià)模式的建立[10]

2.5.1 相對(duì)校正因子（f）的計(jì)算 按照確立的色譜條件，依法進(jìn)樣“2.5”項(xiàng)6 份混合對(duì)照品溶液，以綿馬貫眾素ABBA 為內(nèi)參物，按照公式計(jì)算各成分的f值。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3，各成分f的RSD 均小于2.0%，提示f的均值可作為定量用。

f＝(ρi×As)/(ρs×Ai)

ρi和ρs分別為內(nèi)參物和其他待測(cè)成分的質(zhì)量濃度、Ai和As分別為內(nèi)參物和其他待測(cè)成分的峰面積

2.5.2f穩(wěn)健性考察 為了考察計(jì)算得到的f的穩(wěn)健性，本試驗(yàn)通過(guò)考察不同儀器及色譜柱、改變流速和柱溫對(duì)f的影響來(lái)評(píng)價(jià)。選用液相色譜儀（Agilent 1260 型和Waters Arc）和色譜柱（Symmetry C18柱、Agilent Zorbax C18柱和Apollo C18柱），體積流量（1.0±0.2）mL/min，柱溫（30±5）℃等條件，取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，結(jié)果各成分的f值在以上條件改變時(shí)變化不顯著（RSD 均小于2.0%），提示建立的f穩(wěn)定性良好。

2.5.3 色譜峰定位 記錄“2.5.2”項(xiàng)不同儀器與不同色譜柱時(shí)各成分色譜峰保留時(shí)間，采用相對(duì)保留時(shí)間值（t）法對(duì)色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果各成分t值變化不顯著（RSD 均小于2.0%），且出峰順序不會(huì)改變，提示該法可用于綿馬貫眾炭中多組分色譜峰的定位（表4）。

表4 各成分的相對(duì)保留時(shí)間值Table 4 t value of various constituents

2.6 樣品常規(guī)外標(biāo)法（ESM）和QAMS 法的準(zhǔn)確性比較

16 批綿馬貫眾炭樣品（S1～S16），按“2.2”項(xiàng)流程制備供試品溶液（每批平行3 份），各精密吸取10 μL 按照確立的色譜條件進(jìn)樣。運(yùn)用ESM 法計(jì)算白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的含量，再以綿馬貫眾素ABBA 為內(nèi)參物，利用上述建立的各成分f的均值，采用QAMS法計(jì)算樣品中其他成分的含量，再運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)各組分2 種方法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果P＞0.05，提示2 種方法所得16 批綿馬貫眾炭樣品中11 個(gè)成分的含量結(jié)果沒(méi)有顯著的差別，見(jiàn)表5。

2.7 多元統(tǒng)計(jì)分析法[11]評(píng)價(jià)模式的建立

以16 批綿馬貫眾炭中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的含量數(shù)據(jù)（QAMS 法）為變量，借助SIMCA 14.1 軟件對(duì)16×11 矩陣數(shù)據(jù)構(gòu)建PCA 模型（圖2），提取出2個(gè)主成分[12]，16 批綿馬貫眾炭樣品自動(dòng)聚焦為3個(gè)象限，分成3 組，且所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均在95%橢圓置信區(qū)間內(nèi)，表明所有檢測(cè)數(shù)據(jù)無(wú)異常。進(jìn)一步運(yùn)行OPLS-DA，結(jié)果16 批樣品聚類(lèi)良好，模型參數(shù)R2X＝0.928、R2Y＝0.822、Q2＝0.760，均大于0.5[13]，表明建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力好（圖3 和圖4）。結(jié)合變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值法篩選對(duì)樣品分組起關(guān)鍵作用的變量，以VIP 值＞1.0 的變量作為標(biāo)準(zhǔn)，圖4 顯示VIP＞1 的組分分別為去甲氧基莢果蕨素（VIP＝2.102）、綿馬貫眾素ABBA（VIP＝1.503）、偽綿馬素（VIP＝1.276）和山柰素（VIP＝1.159），表明上述4 個(gè)組分對(duì)不同產(chǎn)地綿馬貫眾炭質(zhì)量差異影響顯著。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA score chart

圖3 16 批綿馬貫眾炭OPLS-DA 得分圖Fig.3 Score chart of OPLS-DA model for 16 batches of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum samples

圖4 OPLS-DA 模型的VIP 圖Fig.4 VIP plot of OPLS-DA model

2.8 熵權(quán)TOPSIS[14]分析法的建立

設(shè)置16 批綿馬貫眾炭樣品中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的QAMS含量值為bc（b＝1，2，3，……，16；c＝1，2，3，……，11），組成多指標(biāo)16×11 數(shù)據(jù)矩陣。由于以上11 種成分為正向指標(biāo)，根據(jù)公式（1）對(duì)16×11 矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以O(shè)PLS-DA 中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的VIP 值為權(quán)重，將處理后的矩陣數(shù)據(jù)與各成分權(quán)重相乘得加權(quán)決策矩陣。再以決策矩陣中各成分的最大值為最優(yōu)向量（Z+），最小值為最差向量（Z?），再按照最優(yōu)向量歐氏距離（Db+）計(jì)算公式（2），最差向量歐氏距離（Db?）計(jì)算公式（3），相對(duì)貼近度（Jb）計(jì)算公式（4）分別計(jì)算Db+、Db?和Jb值，并根據(jù)Jb值的大小對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行排序（表6）。從表6 可以看出吉林產(chǎn)地所得綿馬貫眾炭Jb值高于其他產(chǎn)地，提示吉林產(chǎn)地所得綿馬貫眾炭的整體質(zhì)量較佳。

表6 綿馬貫眾炭藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Quality evaluation result of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum

3 討論

3.1 提取溶劑及方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)以白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷提取峰面積為主要指標(biāo)，對(duì)比了不同溶劑（70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇和水）、超聲15、30、45、60 min 的提取結(jié)果，結(jié)果顯示綿馬貫眾炭供試品最佳提取方式為70%甲醇超聲提取30 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

綿馬貫眾炭中待檢測(cè)成分白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷紫外吸收主要集中在190～400 nm。綜合11 個(gè)成分峰形、峰面積等，本研究分別采用不同波長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比考察后發(fā)現(xiàn)，在298 nm 波長(zhǎng)處[15-17]，白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA 和綿馬貫眾素ABBA 有最大吸收；在330 nm波長(zhǎng)處[18-19]，山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的色譜峰飽滿(mǎn)且色譜峰分離度較好、基線(xiàn)較平。最后優(yōu)選以2.3 項(xiàng)色譜條件同時(shí)檢測(cè)綿馬貫眾炭中以上11 個(gè)成分的含量。

3.3 評(píng)價(jià)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)以5 省16 批綿馬貫眾炭為檢測(cè)樣品，首先建立ESM 方法學(xué)驗(yàn)證，再采用ESM 法同步檢測(cè)19 批綿馬貫眾炭所含的白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷等成分含量，同時(shí)建立QAMS 體系，對(duì)比了與QAMS 法計(jì)算的含量結(jié)果，ESM 法與QAMS 法所測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異；多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各批次間質(zhì)量差異較大，OPLS-DA 結(jié)果提示導(dǎo)致樣品不同分類(lèi)差異的有4 個(gè)成分（VIP＞1），分別為去甲氧基莢果蕨素、綿馬貫眾素ABBA、偽綿馬素和山柰素；EW-TOPSIS 法同樣顯示各批次間綿馬貫眾炭質(zhì)量差異較大（Jb在0.137 1～0.706 7），其中吉林產(chǎn)地所得綿馬貫眾炭Jb值較高，提示吉林產(chǎn)地所得綿馬貫眾炭整體質(zhì)量較佳。

本實(shí)驗(yàn)建立的QAMS 法、多元統(tǒng)計(jì)分析和熵權(quán)TOPSIS 分析綜合評(píng)價(jià)綿馬貫眾炭質(zhì)量方法，簡(jiǎn)便省時(shí)、準(zhǔn)確性好，為后續(xù)綿馬貫眾的道地性研究提供數(shù)據(jù)支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突