基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析蛋白酶體對宰后秦川牛肉貯藏期間品質(zhì)變化的影響

胡麗筠，王金霞，李 榮，張 倩，陳雪妍，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

宰后肉的品質(zhì)直接影響消費者對購買的肉及肉制品的滿意程度。牛肉在宰后貯藏期間由于受自身肌肉組織中生物化學(xué)變化的影響，導(dǎo)致肌肉的品質(zhì)發(fā)生一系列的變化，這些生物化學(xué)變化主要包括細(xì)胞凋亡、內(nèi)源酶激活、結(jié)構(gòu)蛋白降解等[1]。蛋白酶體作為內(nèi)源性蛋白酶家族成員，在死后蛋白水解中發(fā)揮作用，有助于肉的嫩化[2]；20S蛋白酶體能夠?qū)ⅵ?輔肌動蛋白從Z線區(qū)域釋放出來進入肌漿中[3]，誘導(dǎo)肌原纖維的Z盤和I帶溶解，甚至降解肌動蛋白和肌球蛋白[4]。由此可見，蛋白酶體可以通過發(fā)揮酶解作用水解肌肉中的蛋白質(zhì)，進而影響宰后肌肉的品質(zhì)變化。Wimmers等[5]利用功能基因組學(xué)和遺傳基因組學(xué)方法，以確定與肉品質(zhì)相關(guān)的基因的功能網(wǎng)絡(luò)，使用Affymetrix基因芯片獲得的74 個背最長肌樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)與滴水損失和主成分相關(guān)，功能注釋分析表明，持水能力、早期pH值下降和最終pH值的差異與蛋白酶體介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitinproteasome pathway，UPP）有關(guān)。Cheng Huilin等[6]基于蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白亞基β、腺苷酸激酶同工酶1、LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合3等蛋白與20S蛋白酶體相關(guān)，從蛋白水解的角度來看蛋白質(zhì)組的變化及其與蛋白酶體的關(guān)系。然而，宰后貯藏期間秦川牛肉中蛋白酶體變化所調(diào)控的能量代謝變化及肉品質(zhì)變化機制尚不明確。因此，本研究以宰后秦川牛背最長肌為研究對象，測定蛋白酶體活性及品質(zhì)變化，結(jié)合4D-非標(biāo)定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究蛋白酶體，分析宰后貯藏期間蛋白酶體活性與能量水平及其與肉品質(zhì)的關(guān)系，揭示宰后貯藏期間蛋白酶體調(diào)控肉品質(zhì)的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗秦川黃牛購自于寧夏尚農(nóng)生物科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。隨機選取生長發(fā)育良好、體形健壯的3 頭25 月齡左右的去勢秦川公牛，按照商業(yè)屠宰程序屠宰，取背最長肌，剔除筋膜后按每塊約150 g分割肉樣，并置于透氣性為23.5 g/（m2·d）的聚乙烯保鮮袋中。置于4 ℃條件下貯藏8 d，分別于0、2、4、6、8 d采集樣品。

BCA試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑 德國Calbiochem公司；甲酸（色譜純）瑞士Fluka公司；二硫蘇糖醇、尿素、硫代乙酰胺、三乙基碳酸氫銨 美國Sigma公司；三氟乙酸 美國Sigma-Aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、牛血清白蛋白上海麥克林生化科技有限公司；甘氨酸、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、疊氮化鈉美國A m r e s c o 公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、磷酸氫二鉀、乙醇、冰醋酸、濃硫酸、鹽酸國藥集團化學(xué)試劑有限公司；20S蛋白酶體酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NAI-CS150超聲波細(xì)胞破碎機 上海那艾精密儀器有限公司；Scan Speed Mini Vac Alpha冷凍離心機美國Scan Speed公司；ML204/O2電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；Testo 205便捷式pH計 德國德圖集團；Thermo Scientific Forma 994 -80 ℃超低溫冰箱美國Thermo公司；Nano Elute超高效液相色譜儀德國Bruker公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；CR-400色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；Tims TOF Pro質(zhì)譜儀 那艾精密儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

采集貯藏0、2、4、6、8 d樣本用于測定秦川牛肉品質(zhì)指標(biāo)；對于不便立即測定的指標(biāo)，用滅菌手術(shù)刀及鑷子分別采集不同貯藏期樣本10 g，并將其放置在液氮中速凍，后置于-80 ℃超低溫冰箱存放至實驗待用。

1.3.2 pH值的測定

在貯藏期第0、2、4、6、8天用pH計測定pH值，測定前用pH 6.86和pH 4.01的緩沖液校正，在肉樣橫截面處沿肌纖維方向隨機選取3 個不同部位，將電極頭完全嵌入肉中進行穿刺，測定過程中使電極與肉樣保持良好接觸，讀數(shù)并取其平均值。

1.3.3 色度的測定

采用CR-400色差儀測定貯藏期第0、2、4、6、8天的色度。標(biāo)準(zhǔn)光源D65，測量孔徑8 mm，標(biāo)準(zhǔn)視角10°，進行亮度（L*）值、紅度（a*）值、黃度（b*）值測定，在使用前色差儀用標(biāo)準(zhǔn)白瓷板和標(biāo)準(zhǔn)黑板在室溫條件下進行校正，肉樣截面隨機選取3 處進行測定，讀數(shù)并取其平均值。

1.3.4 保水性的測定

參考李桂霞等[7]的方法進行蒸煮損失測定。將樣品切割成3 cm×6 cm×6 cm的肉塊，除去表面的脂肪和筋膜，將肉樣置于蒸煮袋內(nèi)，抽去袋內(nèi)空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，密封袋口，置于水浴鍋在80 ℃加熱至中心溫度為70 ℃后立即取出，冷卻至室溫，用濾紙擦干表面水分后稱質(zhì)量。蒸煮損失以質(zhì)量損失量與肉塊初始質(zhì)量的百分比表示。

將不同貯藏時間的牛肉樣品切割成4.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，于10 mL離心管中稱質(zhì)量，4 ℃、40000×g離心15 min，取出離心管，用濾紙吸干肉樣表面水分，稱其質(zhì)量，測定離心損失，計算如下：

式中：m0為離心前樣品質(zhì)量/g；m1為離心后樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 剪切力的測定

參考馬旭華[8]的方法并進行修改。將蒸煮處理好的肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取4 個肉柱，然后用TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀V型活動剪切刀架垂直于肌纖維方向測定其剪切力，剪切速度與剪切距離分別為1.5 mm/s、40 mm，測定3 次取其平均值。

1.3.6 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）的測定

參考羅輝等[9]方法稍作修改。將樣品按要求處理后200 目篩過濾，合并上清液和濾液，采用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度，用MFI緩沖溶液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在595 nm波長處測定樣品吸光度，重復(fù)3 次并取平均值，帶入以下公式計算MFI：

1.3.7 能量基本物質(zhì)ATP、ADP、AMP含量的測定

參照羅輝等[9]方法采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定能量物質(zhì)ATP、ADP、AMP含量。

1.3.8 20S蛋白酶體活性的測定

用預(yù)冷后的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗組織，去除殘留血液，稱質(zhì)量后將組織剪碎。組織與PBS按照料液比1∶9（g/mL），并加入蛋白酶抑制劑，于冰上充分研磨。最后將勻漿液于5000×g離心5～10 min，取上清液進行檢測。實驗操作按照20S蛋白酶體ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處進行測定。以宰后0 d 20S蛋白酶體活力為100%，計算其余時間段的相對活性。

1.3.9 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測蛋白質(zhì)含量

參照張杏亞等[10]方法提取蛋白質(zhì)、測定蛋白質(zhì)含量，參照馬旭華[8]方法進行數(shù)據(jù)庫搜索、生物信息學(xué)分析，利用String（https://www.string-db.org/）進行PPI分析，篩選具有互作關(guān)系的差異蛋白質(zhì)（differentially expressed proteins，DEPs）。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對篩選的DEPs作基因本體（Gene Ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛背最長肌蛋白酶體含量變化與肉品質(zhì)相關(guān)性分析

2.1.1 pH值的變化

由圖1可知，宰后秦川牛背最長肌的pH值呈先降低后緩慢上升的趨勢（P＜0.05），與高永芳[11]研究宰后牛肉pH值變化一致。宰后初期pH值下降，是糖酵解作用產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致，4～8 d pH值上升可能是肌肉中的酸性物質(zhì)開始被代謝[12]。

圖1 秦川牛背最長肌貯藏期間pH值的變化Fig.1 Changes in pH of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.2 色度的變化

由圖2可知，隨貯藏時間的延長L*、a*值呈先升高后降低的趨勢（P＜0.05），這與楊巧能等[13]研究牦牛肉中L*值的結(jié)果一致。b*值隨貯藏時間的延長顯著升高（P＜0.05）。長時間貯藏會影響細(xì)胞肌紅蛋白氧化還原的化學(xué)機制，從而影響肉色[14]。

圖2 秦川牛背最長肌貯藏期間肉色的變化Fig.2 Changes in flesh color of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.3 保水性的變化

由圖3可知，牛肉在0～8 d的貯藏過程中蒸煮損失呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），與劉騰[15]研究不同成熟溫度牛肉的蒸煮損失結(jié)果一致。牛肉在0～8 d的貯藏過程中離心損失呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），這與郭榮珍等[16]研究水牛肉的離心損失的變化趨勢相一致。這是由于宰后僵直的發(fā)生，肌球蛋白和肌動蛋白結(jié)合生成肌動球蛋白，導(dǎo)致肌肉收縮，使得細(xì)胞內(nèi)的水分流失。

圖3 秦川牛背最長肌貯藏期間離心及蒸煮損失的變化Fig.3 Changes in centrifugal and cooking loss of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.4 剪切力的變化

剪切力代表肌纖維對抗剪切力的大小，直接反映肌肉的嫩度。由圖4可知，隨著宰后牛肉貯藏時間的延長，剪切力呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），表明宰后初期秦川牛肉嫩度較差，貯藏至8 d時嫩度好轉(zhuǎn)，本研究結(jié)果與李若綺[17]對貯藏期間牛肉剪切力的研究結(jié)果一致，宰后初期，肌肉出現(xiàn)僵直現(xiàn)象，但隨著貯藏時間的延長，肌肉中內(nèi)源酶對肌肉蛋白降解，導(dǎo)致肌肉的僵直解除，嫩度增加[18]。

圖4 秦川牛背最長肌貯藏期間剪切力的變化Fig.4 Changes in shear force of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.5 MFI的變化

MFI反映肌原纖維蛋白降解及其結(jié)構(gòu)被破壞的程度，MFI值越大，肌肉嫩度越好[19]。由圖5可知，隨著時間的延長，宰后貯藏期間秦川牛背最長肌MFI顯著升高（P＜0.05）。這是由于貯藏時間的延長，秦川牛肌肉結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)源酶的作用下被降解，肌肉僵直解除，使得肌肉變軟。這一結(jié)果與舒一梅等[20]研究涼山黃牛中MFI變化趨勢相一致。

圖5 秦川牛背最長肌貯藏期間MFI的變化Fig.5 Changes in MFI of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.6 能量基本物質(zhì)ATP、ADP、AMP含量的變化

采用HPLC法測得秦川牛背最長肌貯藏過程中能量代謝基本物質(zhì)的變化，如表1所示，隨著宰后貯藏時間的延長，ATP逐漸耗盡，0～2 d期間快速下降，2～8 d下降較緩，8 d時ATP基本檢測不出；ADP、AMP的含量在0～8 d均呈下降趨勢。本研究結(jié)果與魏起超[21]研究宰后牛肉能量代謝物變化趨勢結(jié)果一致。能量物質(zhì)的缺失會間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，進而使肌肉蛋白的合成速率遠(yuǎn)低于降解速率，造成肌肉纖維蛋白含量減少，進而使牛肉的嫩度發(fā)生變化[22]。

表1 貯藏期間ATP、ADP、AMP含量變化Table 1 Changes in contents of ATP,ADP and AMP during storage

2.1.7 20S蛋白酶體活性的變化

蛋白酶體作為內(nèi)源性蛋白酶對宰后肉品質(zhì)的影響很重要。由圖6可知，在宰后貯藏過程中，20S蛋白酶體相對活性顯著降低（P＜0.05），這與Zhang Yuemei等[23]研究宰后貯藏期間豬腰肉的蛋白酶體活性變化趨勢結(jié)果一致。

圖6 秦川牛背最長肌貯藏期間20S蛋白酶體相對活性變化Fig.6 Changes in relative activity of 20S proteasome in Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef during storage

2.1.8 蛋白酶體活性與能量物質(zhì)及品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)分析

為探究宰后貯藏期間秦川牛背最長肌中蛋白酶體與肉品質(zhì)及能量物質(zhì)的關(guān)系，對蛋白酶體活性與能量基本物質(zhì)及品質(zhì)指標(biāo)進行Pearson相關(guān)性分析，由表2可知，宰后貯藏期間秦川牛背最長肌中20S蛋白酶體活性與b*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與ADP含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與AMP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與MFI呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），以上結(jié)果表明宰后肌肉中蛋白酶體活性的變化與肌肉中能量物質(zhì)及肌肉品質(zhì)的變化有著密切的關(guān)系。曾珍[24]研究發(fā)現(xiàn)豬肉中20S蛋白酶體與系水力呈負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果的保水性結(jié)果不一致，可能是研究物種存在差異，或是樣本處理不同；蛋白酶體活性與能量物質(zhì)相關(guān)性極強，說明蛋白酶體降解蛋白質(zhì)是一個依賴能量的過程，Davis等[25]發(fā)現(xiàn)ATP含量與肌肉細(xì)胞中蛋白酶體介導(dǎo)的UPP的蛋白質(zhì)降解有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

表2 秦川牛背最長肌20S蛋白酶體活性與品質(zhì)各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between 20S proteasome activity and various quality indicators of Longissimus dorsi muscle in Qinchuan beef

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

對不同貯藏期秦川牛背最長肌蛋白質(zhì)表達(dá)變化進行樣品組間相關(guān)性分析，由圖7可以看出，樣品在不同貯藏期間差異較大，該結(jié)果充分證明了樣品采集的組學(xué)數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，不同貯藏期樣本具有顯著差異，具有一定代表性，能夠滿足后續(xù)分析要求。

圖7 蛋白組間相關(guān)性分析Fig.7 Intergroup correlation analysis of protein

2.2.1 蛋白酶體相關(guān)蛋白質(zhì)篩選

本研究采用4D-LFQ研究秦川牛在宰后貯藏過程中蛋白質(zhì)組學(xué)變化。設(shè)置差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）為1.2 倍篩選DEPs，結(jié)果表明，4 d/0 d組一共鑒定出38 個DEPs；8 d/0 d組一共鑒定出71 個DEPs；8 d/4 d組一共鑒定出42 個DEPs。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對所篩DEPs進行逐個檢索，通過功能特性篩選出8 種蛋白酶體亞基，說明蛋白酶體在宰后牛背最長肌中主要以亞基形式存在，詳細(xì)信息如表3所示，4 d/0 d共2 個顯著差異表達(dá)的蛋白酶體亞基；8 d/0 d共7 個顯著差異表達(dá)的蛋白酶體亞基，8 d/4 d共1 個顯著差異表達(dá)的蛋白酶體亞基。

表3 貯藏期間顯著差異表達(dá)的蛋白酶體Table 3 Significantly differentially expressed proteasomes during storage

2.2.2 蛋白酶體相關(guān)DEPs的鑒定

將篩選出的DEPs與篩選出的8 種蛋白酶體亞基表達(dá)量進行相關(guān)性分析，并結(jié)合String對蛋白酶體及其相關(guān)的DEPs進行PPI互作分析，結(jié)果如圖8所示，表明該網(wǎng)絡(luò)中PPI富集的P值為1.0×10-16，聚類系數(shù)為0.456，發(fā)現(xiàn)了46 個節(jié)點數(shù)，88 條邊位于該互作網(wǎng)絡(luò)中，最終確定27 個DEPs與蛋白酶體之間具有明顯的互作關(guān)系。篩選出的與8 種蛋白酶體亞基表達(dá)量相關(guān)的DEPs詳細(xì)信息如表4所示。

表4 貯藏期間與蛋白酶體相關(guān)DEPs對比Table 4 Comparison of proteasome-associated DEPs during storage

圖8 DEPs的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 Interaction network diagram of DEPs

2.2.3 GO分析

利用GO注釋對蛋白酶體亞基及其相關(guān)DEPs進行生物信息分析，并從3 個角度對其功能進行分析，即生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC），結(jié)果可以看出，8 d對比0 d組共富集到16 個BP、15 個CC、9 個MF。

由圖9可知，宰后0～8 d，蛋白酶體及相關(guān)DEPs主要涉及：蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程、ATP酶活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊、骨骼肌收縮、糖酵解過程、肌肉收縮等BP；MF主要包括內(nèi)肽酶活性、肌動蛋白結(jié)合、蘇氨酸型內(nèi)肽酶活性、肌動蛋白絲結(jié)合、微絲運動活性、ATP結(jié)合等；CC主要包括蛋白酶體核心復(fù)合物、Z盤、肌球蛋白復(fù)合體、應(yīng)力纖維、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、肌動蛋白細(xì)絲、蛋白酶體核心復(fù)合物、α-亞單位復(fù)合物等。

圖9 8 d對比0 d組與蛋白酶體表達(dá)相關(guān)DEPs GO富集分析Fig.9 GO enrichment analysis of DEPs associated with proteasome expression at 8 vs 0 days postmortem

2.2.4 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路對篩選的蛋白酶體亞基及其相關(guān)DEPs進行通路富集分析，結(jié)果顯示，8 d/0 d組蛋白酶體亞基及其相關(guān)DEPs注釋于3 條途徑。從表5可以看出，在屠宰后的0～8 d內(nèi)，DEPs主要參與蛋白酶體（bta03050）、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）信號傳導(dǎo)（bta04066）、碳代謝（bta01200）途徑。

3 討論

蛋白酶體是一種多亞基蛋白酶復(fù)合物，其表達(dá)所有組成的蛋白酶體亞基，在哺乳動物細(xì)胞中，編碼蛋白酶體亞基的基因組成表達(dá)受許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)[26]，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最大、最復(fù)雜的蛋白質(zhì)，約占全部基因產(chǎn)物的1%～2%[27]。本研究結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共篩選出8 種蛋白酶體亞基，表明宰后牛肉蛋白酶體以蛋白酶體亞基的形式存在。PSMA6和PSMB6基因的轉(zhuǎn)錄對肌間脂肪含量有影響[28]；PSMD13在蛋白酶體降解中起著重要的作用[29]；PSMD4的作用是將靶蛋白送入26S蛋白酶體的催化機制[30]；PSMD13、PSMD4作為26S蛋白酶體非ATPase調(diào)節(jié)亞基，說明蛋白酶體在宰后能量耗盡時，依然可以降解蛋白；PSMB3和PSMB6是蛋白酶體亞基的成員，其中PSMB6具有催化活性，PSMA7作為免疫調(diào)節(jié)劑，對線粒體具有調(diào)節(jié)作用[31]；20S蛋白酶體亞基PSMA3，可優(yōu)先與許多不需要聚泛素鏈定位的內(nèi)在無序蛋白相互作用[32]。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞通過蛋白酶體亞基和組裝伴侶的協(xié)調(diào)表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白酶體豐度，從而根據(jù)自身需要調(diào)節(jié)蛋白酶體介導(dǎo)的降解[33]。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)這些與蛋白酶體亞基之間具有明顯互作關(guān)系的DEPs包含了與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，其中MYH15、MYH6為肌球蛋白重鏈，肌球蛋白作為骨骼肌內(nèi)具有收縮功能和調(diào)節(jié)功能的主要蛋白，尤其在骨骼肌的收縮功能上發(fā)揮重要作用[34]，肌動蛋白等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白水解和肌節(jié)的變化是導(dǎo)致宰后貯藏過程中肉質(zhì)嫩化的主要原因[35]，已鑒定這些蛋白是蛋白酶體的潛在底物[36]，結(jié)合相關(guān)性分析蛋白酶體活性與MFI呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），說明宰后蛋白酶體通過對肌細(xì)胞骨架蛋白的降解從而對嫩度產(chǎn)生影響。

通過GO注釋對這些蛋白質(zhì)的生物信息進行分析，蛋白酶體及其相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過其分子功能參與蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝、ATP酶活性的調(diào)節(jié)、骨骼肌收縮、糖酵解等生物途徑。宰后由于肌肉蛋白降解導(dǎo)致肌肉品質(zhì)變化，其中蛋白酶體介導(dǎo)的UPP是肉類蛋白質(zhì)降解最重要的途徑之一，Jia Wei等[37]基于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究山羊肉凍藏過程中蛋白質(zhì)動態(tài)變化的分子機制，發(fā)現(xiàn)蛋白酶體通過UPP對冷凍過程中蛋白降解及肉的品質(zhì)產(chǎn)生影響，本研究結(jié)果與其一致。糖酵解是機體在缺氧情況下能量供應(yīng)的重要途徑，研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體亞基PSMB3、PSMA3對ALDOC、ENO2蛋白的調(diào)節(jié)可能影響宰后糖酵解過程[6]，宰后肌肉供氧停止，糖酵解反應(yīng)開始，促使乳酸積累，pH值降低，進而影響肌肉中蛋白質(zhì)的特性，最終引起肉質(zhì)嫩度、持水性和色澤變化[38-39]，結(jié)合相關(guān)性分析20S蛋白酶體活性與b*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），可以推測宰后貯藏過程中蛋白酶體有可能通過對糖酵解的調(diào)節(jié)來影響肉色。ATP是細(xì)胞中主要的高能化合物，是許多代謝反應(yīng)的驅(qū)動力，它的存在對細(xì)胞至關(guān)重要，ACTN1、MYH6是與ATP酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，結(jié)合相關(guān)性分析蛋白酶體活性與ADP含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與AMP含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明宰后貯藏期間蛋白酶體通過消耗機體細(xì)胞中的ATP分解代謝蛋白質(zhì)。

通過KEGG通路對與蛋白酶體表達(dá)相關(guān)的DEPs進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，宰后8 d對比0 d組顯著富集了3 條途徑，DEPs主要參與蛋白酶體途徑（bta03050）、HIF-1信號傳導(dǎo)途徑（bta04066）、碳代謝途徑（bta01200）。HIF-1信號傳導(dǎo)途徑參與宰后缺氧反應(yīng)，調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，上調(diào)影響細(xì)胞存活、生長、分化、以及凋亡的基因表達(dá)[40]，蛋白酶體在細(xì)胞內(nèi)，參與包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、增加抗原遞呈等多種細(xì)胞功能[41]，說明宰后牛肉貯藏過程中，蛋白酶體有可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)影響宰后牛肉品質(zhì)。碳代謝主要包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)等，糖酵解是機體在缺氧情況下能量供應(yīng)的重要途徑，宰后貯藏初期蛋白酶體通過消耗能量物質(zhì)，影響宰后牛肉品質(zhì)特性，后期由于能量物質(zhì)耗盡，蛋白酶體可通過糖酵解提供的能量以及非ATP依賴型蛋白酶體亞基，實現(xiàn)對宰后蛋白質(zhì)的降解，最終影響秦川牛肉的品質(zhì)。

4 結(jié)論

宰后貯藏期間秦川牛背最長肌中蛋白酶體活性與牛肉能量代謝及品質(zhì)間存在密切聯(lián)系。宰后貯藏期間蛋白酶體以亞基的形式存在，與其相關(guān)DEPs具有內(nèi)肽酶活性、肌動蛋白結(jié)合、微絲運動活性等分子功能，參與泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝、骨骼肌收縮、肌肉收縮、糖酵解等生物過程，引起秦川牛肉品質(zhì)變化；宰后初期蛋白酶體通過消耗能量物質(zhì)分解代謝蛋白調(diào)控生物途徑，后期能量物質(zhì)耗盡，蛋白酶體可通過糖酵解提供的能量以及非ATP依賴型蛋白酶體亞基，實現(xiàn)對宰后蛋白質(zhì)的分解代謝，最終影響秦川牛肉的品質(zhì)。