冷鮮鵝胸肉微生物群落分析及其對揮發(fā)性風味的影響

吳利真，廖志強，史陽凱，于立梅

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225）

鵝是我國養(yǎng)殖規(guī)模十分龐大的一種家禽，鵝存欄量及屠宰量高居世界首位[1]，廣東省具有全國最大的鵝養(yǎng)殖規(guī)模以及鵝肉食用量[2]，由于鵝肉生產(chǎn)與消費具有地域性，相對于其他家禽，鵝肉的研究基礎相對薄弱。冷鮮肉具有營養(yǎng)成分損失少、肉質(zhì)好、滋味鮮美等優(yōu)點，但冷鮮肉相較于冷凍肉的貯藏溫度高，易滋生細菌，因此極易腐敗變質(zhì)[3]。研究表明，微生物是造成冷鮮肉腐敗變質(zhì)的主要原因，并且引起不同動物肉腐敗的微生物可能不同，如假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和腸桿菌科細菌等在腐敗的冷藏禽類中較常見[4]。麥栩滔等[5]發(fā)現(xiàn)冷鮮雞胸肉貯藏后期的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌屬、不動桿菌屬和希瓦氏菌屬，而王輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)冰鮮鴿中優(yōu)勢腐敗菌為微小桿菌、不動桿菌、假單胞菌、金黃桿菌、腸桿菌、短食單胞菌、Joostei金桿菌。因此，抑制引起鵝肉冷藏期間腐敗變質(zhì)的微生物菌群是保持鵝肉品質(zhì)和延長貨架期的關鍵。

氣味是判斷肉類新鮮程度的有效手段，當肉類腐敗時，會產(chǎn)生令人不愉快的氣味，新鮮的肉類具有濃郁肉香味，這些香味成分通常由多種揮發(fā)性化合物組成，不同的肉其組成也不盡相同[7]。孟一等[8]研究表明丙酮、壬烷、2-戊酮、2,3-丁二酮、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇和壬醛是新鮮牛肉的特征性成分；劉同等[9]對北京鴨的風味物質(zhì)進行研究，結果表明主要風味物質(zhì)為(E)-2,4-癸二烯醛、壬醛、2-辛烯醛、2-戊基呋喃、1-辛烯-3-酮。肉類在貯藏過程中，由于自身的酶和外界微生物等多重作用下，其揮發(fā)性成分組成發(fā)生變化，因此分析不同優(yōu)勢腐敗菌對冷鮮鵝胸肉揮發(fā)性成分產(chǎn)生的影響對于鵝胸肉腐敗進程的研究具有重要意義。

基于此，本研究通過高通量測序技術分析鵝胸肉在冷藏前期、中期、后期的菌相演替變化規(guī)律，最終確定鵝胸肉在冷藏期間的優(yōu)勢腐敗菌，利用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）結合固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）技術表征3 種優(yōu)勢腐敗菌對冷藏鵝胸肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響，進一步探究鵝肉優(yōu)勢腐敗菌的致腐機制，以期為開發(fā)鵝肉的新型靶向保鮮技術提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇達到適齡宰殺期（2 a）、健康狀況良好的馬崗公鵝，購于廣州海珠區(qū)江灣市場。鵝新鮮宰殺后立即用無菌采樣袋裝到帶有冰袋的保溫箱中，1 h之內(nèi)運至實驗室。

假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司；TaqPlus DNA聚合酶、引物DNA、DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；正構酮校準液 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-100A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；3H12RI型臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；ETC811型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；3730xl測序儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；FlavourSpec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S.公司；57328-U 50/30μm（DVB/CAR/PDMS）固相微萃取針 美國Supelco公司；7890B GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

在無菌工作臺中，無菌操作下將鵝胸肉修整分割，分割成大小一致的肉片（3 cm×3 cm×1 cm），裹上聚乙烯保鮮膜，置于4 ℃冰箱中貯存，于第0、3、6、9、12、15、18天取樣進行菌相分析，將采集的樣品依次命名為YP 1、YP 2、YP 3、YP 4、YP 5、YP 6、YP 7[10]。

1.3.2 DNA的提取

稱取200～500 mg的樣品，放入無菌的離心管中，加入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）后振蕩混勻，在10 000 r/min（室溫）離心3 min，棄上層液體。將2 mL管倒置于吸水紙上1 min，待沒有液體流出后將樣品管放入55 ℃金屬浴10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)，保證后續(xù)實驗操作[11]。

使用E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取DNA，利用Qubit 3.0 DNA試劑盒對基因組DNA精確定量，確定PCR加入的DNA用量。

1.3.3 PCR擴增

16S V3～V4 引物Nobar_ 341F：CCTACGGGNGGCWGCAG，Nobar_805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC。

1.3.3.1 第1輪擴增

反應體系：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR模板10～20 ng、H2O 9～12 μL，總體積30 μL。使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，短暫離心將反應液離心至管底。PCR管置于PCR儀中進行擴增，反應條件：94 ℃、3 min→（94 ℃、30 s→45℃、20 s→65 ℃、30 s）循環(huán)5 次→（94 ℃、20 s→55 ℃、20 s→72 ℃、30 s）循環(huán)20 次→72 ℃、5 min→10 ℃。

1.3.3.2 第2輪擴增

反應體系：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR模板20～30 ng、H2O 9～12 μL、總體積30 μL。使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。將PCR管置于PCR儀中進行擴增，PCR條件：95 ℃預變性3 min→（94 ℃變性20 s→55 ℃退火20 s→72 ℃延伸30 s）循環(huán)5 次→72 ℃延伸5 min→10 ℃。

獲得的基因序列由RDP數(shù)據(jù)庫進行相似序列檢索和序列比對，選取同源性較高的相關菌株的基因序列作為參比對象，序列同源性大于97%歸為同一物種。

1.3.4 揮發(fā)性風味化合物分析

1.3.4.1 樣品制備

將課題組前期分離純化得到的3 株優(yōu)勢腐敗菌（Pseudomonas helleri、莓實假單胞菌、加拿大假單胞菌，同源性大于9 9%），根據(jù)標準曲線配制6（lg（CFU/mL））左右的純菌液，在無菌環(huán)境中將分割后的鵝胸肉用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液浸泡2 min，用無菌水沖洗一次，瀝干后使用酒精噴燈進行表面火焰噴射滅菌，再將鵝胸肉浸泡在提前調(diào)配好濃度的純菌液中10 min，空白組浸泡到相同體積的無菌水中10 min，晾干后4 ℃冰箱貯藏12 d，分別命名為A 8-12、A 9-12、A 13-12，新鮮鵝胸肉（KB-0）作為對照。

1.3.4.2 GC-IMS測定

參考孟新濤等[12]的方法并稍作修改，取新鮮鵝胸肉（KB-0）及接種優(yōu)勢腐敗菌的鵝胸肉各2 g置于20 mL頂空瓶中，35 ℃孵育20 min后進樣，平行測3 次。測試條件如表1、2所示。

表1 GC-IMS分析條件Table 1 GC-IMS conditions

表2 GC條件Table 2 GC conditions

1.3.4.3 GC-MS分析

參考王加賓[13]的方法并稍作修改，取新鮮鵝胸肉（KB-0）及接種優(yōu)勢腐敗菌的鵝胸肉各5 g置于20 mL萃取瓶中，加入25 μg苯乙酸異戊酯作為內(nèi)標（0.5 mg/mL，50 μL），密封后置于60 ℃水浴中，500 r/min磁力攪拌平衡20 min，插入萃取針萃取30 min。萃取針使用前，在GC進樣口250 ℃活化20 min。GC分析條件：進樣口溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，載氣流速1.5 mL/min，不分流進樣。升溫程序：初始50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至100 ℃保持2 min；以4 ℃/min升溫至140 ℃保持1 min；以4 ℃/min升溫至180 ℃保持2 min；5 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min。MS條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子電離電壓70 eV，全掃描35～550 Da。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件對各數(shù)據(jù)進行方差分析及顯著性分析，P＜0.05表示顯著，P＜0.01表示極顯著，使用Origin 2019軟件作圖。使用SICMA軟件進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），GC-MS、GC-IMS儀測定的相關數(shù)據(jù)采用其自帶軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 物種多樣性分析

2.1.1 豐度等級曲線分析

豐度等級曲線是分析物種多樣性的一種方式，物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度反映，曲線越寬表示物種的組成越豐富[14]；而物種組成的均勻程度由曲線的平坦程度反映，曲線越平坦表示物種組成越均勻[15]。如圖1所示，YP 1、YP 2、YP 3、YP 7曲線橫軸長度達到300，說明貯藏早期和貯藏末期微生物組成豐富，YP 1、YP 2曲線相對平坦，說明貯藏早期物種組成相對均勻，優(yōu)勢腐敗菌需要一定時間積累才能發(fā)揮優(yōu)勢作用。

圖1 豐度等級曲線Fig.1 Rank-abundance curves

2.1.2 稀釋曲線分析

從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列，抽到的序列數(shù)與它們所代表操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的數(shù)目構建曲線比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種豐富度，并判斷樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[14]。樣品的稀釋曲線如圖2所示，7 個樣品的曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，可以進行下一步數(shù)據(jù)分析。

圖2 稀釋性曲線圖Fig.2 Rarefaction curves

2.1.3 多樣性指數(shù)分析

覆蓋率越高，樣品中含有沒被測出序列的概率越低，該指數(shù)實際反映了測序結果是否代表樣品的真實情況[16]，7 個樣品的覆蓋率都是1.00，表明測序覆蓋了樣品中所有的序列，后續(xù)數(shù)據(jù)分析可靠[17]。Simpson指數(shù)越大，群落多樣性越低；Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高；Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越大則表示微生物群落的豐度越高。如表3所示，貯存第0天，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，由此可以推斷冷鮮鵝胸肉在貯藏初期物種多樣性最豐富，貯藏過程中呈現(xiàn)先減少后增加趨勢，進而推斷生物多樣性隨著優(yōu)勢腐敗菌的生長而減少，在貯藏后期特定優(yōu)勢菌作用減弱，物種多樣性有所增加，這與Wang Taojun等[18]研究結果相似。

表3 樣品多樣性指數(shù)Table 3 Sample diversity indexes

2.1.4 UpSet圖分析

利用UpSet圖評估不同樣本之間的OTU分布與組成的相似性，由圖3可知，YP 7組獨有OTU數(shù)量最多，為290 個，其次依次是YP 1、YP 2、YP 3，分別為235、118、52；YP 1、YP 2、YP 3共有OTU數(shù)量最多，為142 個，YP 6組和YP 7組與另外幾個組共有的OTU數(shù)量相對較少，可見貯藏前期和中期群落相對豐富，但群落種類有較高的相似性，在貯藏后期，獨有OTU數(shù)量明顯增加，物種多樣性有所上升。

圖3 基于OTU的UpSet Fig.3 UpSet based on OTU

2.2 優(yōu)勢物種結構分析

2.2.1 基于門水平優(yōu)勢物種組成分析

冷鮮鵝胸肉在貯藏過程中在門水平優(yōu)勢物種組成分析見圖4，在貯藏過程中優(yōu)勢物種主要由變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）組成。變形菌門廣泛存在于各個樣品中，并且占據(jù)優(yōu)勢，是冷鮮鵝胸肉貯藏過程中的優(yōu)勢菌門。在第9、12、15天變形菌門相對豐度達到90%以上，貯藏到第15天時變形菌門達到了峰值，變形菌門為優(yōu)勢菌門，與茹志瑩等[19]的研究結果相似。其次是擬桿菌門，在第0天的相對豐度為17.89%；在貯藏前期，隨著貯藏期的延長其相對豐度逐漸減少；在貯藏后期隨著變形菌門的減少，擬桿菌門生長趨勢增強。厚壁菌門也表現(xiàn)出相似的趨勢，在變形菌門達到峰值時，厚壁菌門相對豐度為5.94%，變形菌門的大量增殖并不能完全抑制厚壁菌門的生長。除此之外，冷鮮鵝胸肉中還有浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）等低豐度的菌門，說明其在貯藏過程中微生物種類豐富，但豐度相對集中。

圖4 門水平優(yōu)勢物種組成Fig.4 Composition of dominant phyla

2.2.2 基于屬水平優(yōu)勢物種組成分析

冷鮮鵝胸肉在貯藏過程中屬水平上總共分離出15 種優(yōu)勢菌群。如圖5所示，在貯藏過程中微生物的種類存在較大差異，在貯藏前期和后期優(yōu)勢菌群種類相對較多，優(yōu)勢菌屬主要以假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）以及其他未分類的菌屬為主，其中假單胞菌（Pseudomonas）相對豐度最大，在第6天達到43.22%，比第3天增長了28.82%，說明假單胞菌從第3天開始大量增長，加速冷鮮鵝胸肉的腐敗變質(zhì)，在第9天達到峰值，為96.79%，是冷鮮鵝胸肉貯藏過程中主要優(yōu)勢腐敗菌群，這與目前大多數(shù)冷鮮肉優(yōu)勢腐敗菌研究結果[20-21]一致。其次是乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides），但其相對豐度不高，最高時分別為4.84%和2.73%。其他菌屬檢出較少甚至無法檢出，隨著貯藏時間的延長其他優(yōu)勢物種多樣性和豐度降低，這可能是假單胞菌（Pseudomonas）的大量增長導致[22]，Mohareb等[23]的研究表明假單胞菌在好氧冷藏條件下影響肉類變質(zhì)的主要微生物，其他細菌物種如不動桿菌、冷桿菌和莫拉氏菌無法與之進行有效競爭；但隨著貯藏時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，前期占優(yōu)勢的物種生長受到抑制[24]，第18天時，假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）等優(yōu)勢菌種相對豐度均小于0.1%，Lutibacter、Marinicella、Marivita、Thiothrix、Ignavibacterium、Muricauda、弧菌（Vibrio）等菌屬被檢出，說明貯藏后期優(yōu)勢菌群的作用已經(jīng)大幅度衰減。

圖5 屬水平優(yōu)勢物種組成Fig.5 Composition of dominant genera

2.2.3 不同貯藏時間冷鮮鵝胸肉菌群多樣性的主成分分析（principal component analysis，PCA）

如圖6所示，PC1和PC2的貢獻率分別是40.97%和37.46%，各樣品能較好地分離，說明不同貯藏期微生物結構具有一定的差異性。PC1能將第0、3、18天與第6、9、12、15天區(qū)分為2 個區(qū)域，結合上文可以看出，第0、3、18天的冷鮮鵝胸肉物種多樣性較多，第6、9、12、15天物種多樣性較少，說明貯藏時間在PC1水平上對物種多樣性影響顯著；PC2也將貯藏第6天前后的樣品明顯區(qū)分成2 個區(qū)域，貯藏前期不同時間的樣品區(qū)分明顯，這說明不同貯藏時間在PC2水平上對樣品菌群結構的影響顯著。

圖6 菌群多樣性變化PCAFig.6 PCA plot showing variations in microfloral diversity

2.3 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物GC-IMS分析

2.3.1 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物GC-IMS譜圖對比分析

圖7對比了不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性成分，但很難直觀地進行區(qū)分分析，為觀察方便，取圖7俯視圖進行差異對比，結果如圖8所示。不同樣品的揮發(fā)性有機物種類和含量不同，為明確對比樣品中具體的差異物質(zhì)，使用軟件自帶的Gallery Plot插件作指紋圖譜。如圖9所示，KB-0與A 8-12組、A 9-12組、A 13-12組的揮發(fā)性物質(zhì)差異明顯，A 8-12組、A 9-12組、A 13-12組之間也有明顯差別，不同腐敗菌組均具有各自的特征峰區(qū)域（1、2、3、4、5），其中新鮮鵝胸肉（KB-0組）的主要揮發(fā)性物質(zhì)分布在1號區(qū)域，這些物質(zhì)主要是戊醇、丁酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯、戊酸乙酯、己醇、苯甲醛、2-戊基呋喃、壬醛和己酸乙酯等，接種腐敗菌組這些成分相對含量遠比KB-0組低，推測這些物質(zhì)是新鮮鵝胸肉的特征揮發(fā)性成分，這與張惠朋等[2]對不同鵝肉風味物質(zhì)的比較分析結果相似，醛類物質(zhì)對新鮮鵝肉風味具有較大貢獻。A 8-12組的主要揮發(fā)性物質(zhì)集中分布在2號區(qū)域，這些物質(zhì)由3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-乙酰噻唑、庚酮和(Z)-3-己烯-1-醇等組成，這些物質(zhì)存在于A 9-12組、A 13-12組，但含量遠少于A 8-12組，推測這些物質(zhì)是A 8-12組腐敗菌的特征揮發(fā)性物質(zhì)；A 9-12組的濃度較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要分布在3號區(qū)域，主要有羥基丙酮、2,3-丁二醇和二甲基二硫醚等物質(zhì)，其中二甲基二硫醚的濃度顯著比其他組高，推測二甲基二硫醚是A 9-12組的特征揮發(fā)性物質(zhì)，食物系統(tǒng)中的甲硫氨酸可通過其側鏈間接分解形成甲硫醇和二甲基二硫醚[25]，說明莓實假單胞菌加速了鵝胸肉中甲硫氨酸的降解；A 13-12組含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要分布在4號區(qū)域，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇等物質(zhì)，A 13-12組的含量明顯高于其他組，推測3-甲基-3-丁烯-1-醇是A 13-12組的特征揮發(fā)性物質(zhì)。3 個腐敗菌在貯藏后期都出現(xiàn)5號區(qū)域的物質(zhì)（戊酮等），3 組含量相近，但均遠高于KB-0組，推測其為鵝胸肉腐敗代謝產(chǎn)物。酮類物質(zhì)可能通過脂肪氧化和美拉德反應產(chǎn)生[26]，說明假單胞菌加速鵝胸肉的脂肪氧化，孟一等[8]研究表明2-戊酮、2,3-丁二酮是表征牛肉腐敗的特征性揮發(fā)物。綜上，3 個腐敗菌在貯藏過程中都能產(chǎn)生明顯差異的揮發(fā)性成分，這些揮發(fā)性成分對于判斷鵝胸肉的腐敗情況有一定的幫助。

圖7 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物的3D GC-IMS對比Fig.7 Three-dimensional GC-IMS spectra of volatile compounds in goose meat samples contaminated with different dominant spoilage bacteria

圖8 GC-IMS譜圖（俯視圖）Fig.8 Top view of GC-IMS

如表4所示，共識別出29 種揮發(fā)性成分（含部分二聚體），主要包括醇類10 種，酯類8 種，酮類4 種，醛類4 種、呋喃類1 種，與劉雅娜等[27]對新疆鵝肉揮發(fā)性風味化合物分析結果相似。其中被檢測到的醇類物質(zhì)有(Z)-3-已烯-1-醇、1-己醇、正己醇、戊醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、丙酮醇。酯類物質(zhì)有2-羥基丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯。酮類物質(zhì)主要有2,3-丁二酮、2-庚酮、2-戊酮。

表4 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物的定性分析Table 4 Qualitative analysis of volatile compounds in goose meat contaminated with different dominant spoilage bacteria

2.3.2 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物GC-IMS指紋圖譜PCA

為了更加直觀地分析不同腐敗菌揮發(fā)性成分的差異，使用自帶軟件中的Dynamic PCA插件對樣品進行聚類分析，結果如圖10所示。PC1的貢獻率為65%，KB-0組與添加腐敗菌的3 個組差異顯著，PC1能很好地分離，KB-0組分布在左側，3 個添加腐敗菌組分布在右側，且樣本聚集較為分散，說明3 組間也存在一定差異。

圖10 優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性成分GC-IMS的PCAFig.10 PCA plot showing variations in volatile composition of goose meat contaminated with dominant spoilage bacteria analyzed by GC-IMS

2.4 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物的GC-MS分析

在肉類腐敗過程中，假單胞菌代謝產(chǎn)生醇類、醛類、酮類、酯類等揮發(fā)性成分，當其濃度超過一定的閾值會產(chǎn)生令人不快的氣味[28]。如圖11所示，冷鮮鵝胸肉的揮發(fā)性化合物成分種類主要由醇類、酯類、酮類、醛類、烴類、酸類及其他物質(zhì)組成。4 個組的揮發(fā)性物質(zhì)組成存在一定的差異。與KB-0組相比，3 個添加腐敗菌的冷鮮鵝胸肉揮發(fā)性化合物中酯類物質(zhì)種類明顯增加，醛類化合物的種類有所減少，與GC-IMS檢測結果一致。由于細菌酯酶的作用，酯類主要通過肉中醇和羧酸的酯化反應產(chǎn)生[29]。研究表明，新鮮鴨胸肉的醛類化合物含量最高，占總化合物含量的17.26%[30]，與本研究結果相似。A 9-12組醇類、酯類、烴類化合物種類有所增加，醛類、酮類化合物種類有所減少，這可能是由于假單胞菌生長產(chǎn)生的醛類物質(zhì)被快速酯化成醇[31]，A 13-12組化合物種類最多，醇類、酯類、酮類、烴類化合物種類都明顯增加，醛類物質(zhì)種類與KB-0組相近。

圖11 不同優(yōu)勢腐敗菌組的揮發(fā)性化合物組成Fig.11 Composition of volatile compounds in goose meat contaminated with different dominant spoilage bacteria

如表5所示，從鵝胸肉中共檢出164 種揮發(fā)性成分，KB-0組共檢出95 種，其他3 組依次為85、101、113 種。KB-0組含量相對較高的揮發(fā)性物質(zhì)有乙醇、三氯甲烷、己醛、1-辛烯-3-醇、己酸乙烯酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、反-2-辛烯醛、壬醛、2-正戊基呋喃。其中KB-0組己醛、壬醛含量明顯比3 個腐敗菌組高。黃可等[32]研究表明嫩鵝和老鵝的揮發(fā)性物質(zhì)也是以己醛、庚醛、辛醛和壬醛等成分為主，推測己醛、壬醛是新鮮鵝胸肉的特征揮發(fā)性成分。除此之外，3 個腐敗菌組中油酸乙酯含量均明顯增加，其中A 9-12組含量最高。油酸乙酯與脂肪酸氧化有關，推測油酸乙酯是腐敗鵝胸肉的特征揮發(fā)性成分。

表5 不同優(yōu)勢腐敗菌組揮發(fā)性化合物定量分析Table 5 Quantitative analysis of the composition of volatile compounds in goose meat contaminated with different dominant spoilage bacteria

2.5 不同腐敗菌鵝胸肉的香氣成分差異分析

為了進一步分析不同香氣成分對3 種不同優(yōu)勢腐敗菌鵝胸肉的貢獻率，對揮發(fā)性化合物的含量進行OPLSDA，并計算投影中的變量重要性（variable importance for the projection，VIP），根據(jù)VIP＞1的標準，篩選出28 種差異香氣物質(zhì)（表6），其中醇類2 種、醛類7 種、酮類1 種、酯類12 種、烴類3 種和其他3 種。己醛、壬醛、辛醛等是肉類和肉制品中的主要風味化合物，通常壬醛和辛醛具有肉質(zhì)、綠色、新鮮或水果味，但接種腐敗菌的肉中己醛和壬醛含量較低，表明假單胞菌可能損害肉品的風味[33]。KB-0組鵝胸肉中未檢出3-羥基-2-丁酮，而A 8-12和A 13-12組均檢出3-羥基-2-丁酮，酮類物質(zhì)通常是由氨基酸和脂質(zhì)氧化形成[34]，證明Pseudomonas helleri和加拿大假單胞菌促進了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化。接種假單胞菌的肉中大部分酯類化合物含量比新鮮組高，如棕櫚油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、棕櫚油酸乙酯、反式油酸甲酯、反式油酸乙酯。研究表明，酯類物質(zhì)的積累會導致羅非魚產(chǎn)生腥味和刺鼻氣味[35]，推測含量較高的酯類化合物是腐敗鵝胸肉的標志性風味。由于烷烴氣味閾值較高，對鵝胸肉整體風味貢獻不大[36]。

表6 差異香氣物質(zhì)組成及含量Table 6 Contents and VIP scores of differential aroma substances

3 結論

本實驗以冷鮮鵝肉為研究對象，明確冷鏈條件下腐敗菌的菌系結構，分離優(yōu)勢腐敗菌，研究腐敗菌對鵝肉風味的影響。研究結果揭示了新鮮鵝胸肉與腐敗鵝胸肉在微生物多樣性和揮發(fā)性風味物質(zhì)之間的差異。結果表明冷鮮鵝胸肉貯藏前期和后期菌群多樣性更豐富；在門水平上，優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，其中變形菌門相對豐度最高；假單胞菌是冷鮮鵝胸肉貯藏過程中的主要優(yōu)勢腐敗菌群。己醛、壬醛是新鮮鵝胸肉的特征揮發(fā)性成分，接種假單胞菌的腐敗鵝胸肉具有高比例的酯類化合物以及高濃度的3-羥基-2-丁酮、戊酮、二甲基二硫醚，這對預防和減少鵝胸肉的腐敗具有重要意義。然而，目前基于16S rRNA的高通量測序未能準確鑒定出主導鵝胸肉腐敗的微生物，因此在后續(xù)的研究中，可以使用基于第3代測序的宏基因組進一步在物種水平上表征這些微生物，并結合蛋白組學、代謝組學等多組學技術驗證它們與揮發(fā)性風味物質(zhì)之間的關系。