富硒豌豆苗粉理化性質(zhì)及抗氧化活性分析

王智偉，李 茜,2,*，張 民,2,3,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.天農(nóng)農(nóng)產(chǎn)品加工中外聯(lián)合研究中心，天津 300392；3.天津科技大學(xué) 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

硒元素是人體所必需的重要微量元素之一，其在抗氧化[1]、防癌抗癌[2-5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]、預(yù)防心血管疾病等[8-9]諸多方面均能夠起到一定的積極作用[10]。我國是世界上主要的硒資源國之一，但也存在硒資源分布不均衡的情況，世界衛(wèi)生組織對健康成人的硒推薦攝入量為55 μg/d，而我國大部分地區(qū)人口平均硒攝入量為26.00～32.00 μg/d，處于缺硒狀態(tài)[11]，因此，通過食用富硒食品對于人體進(jìn)行科學(xué)有效地補(bǔ)硒十分重要[12]。自然界中的硒元素主要以無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形式存在，無機(jī)硒包括硒單質(zhì)、硒（亞硒）酸鹽等形式，有機(jī)硒包括硒蛋白（多肽）、硒多糖、硒核酸等形式。無機(jī)硒的毒性較大，可使用劑量范圍較窄，而有機(jī)硒因具有吸收率和生物活性高、安全性強(qiáng)、環(huán)境污染小等優(yōu)點，目前已成為健康型營養(yǎng)補(bǔ)充劑的研究熱點之一。將植物性食物富集的有機(jī)硒作為膳食補(bǔ)充劑是一種改善中國居民膳食含硒量不足且同時避免硒中毒的較理想方式。

借助于蔬菜粉水分含量低、貯存時間長、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，將富硒豌豆苗加工為富硒豌豆苗蔬菜粉，既可以改善蔬菜產(chǎn)品的營養(yǎng)學(xué)特性，又可以減少蔬菜浪費，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[13-14]。基于此，本實驗探討不同干燥方式下富硒豌豆苗粉的理化性質(zhì)及體外抗氧化活性，旨在為有機(jī)硒天然食品補(bǔ)充劑開發(fā)及富硒食品產(chǎn)業(yè)化提供一定的理論指導(dǎo)與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆購于山東水生田園旗艦店；富硒豌豆苗、富硒豌豆苗粉由天津農(nóng)學(xué)院實驗室提供（豌豆苗粉中總硒含量2.0 μg/g）。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力試劑盒、羥自由基測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris-HCl、鄰苯三酚（均為分析純）天津百奧泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mars6微波消解儀 深圳CEM儀器公司；HWS-28恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司；FL970熒光分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；LGR20-W高速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；TU-1810分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒豌豆苗粉的制備

取一定量富硒豌豆苗，自來水清洗干凈，90 ℃熱燙5 min，取出瀝干，切分成均勻規(guī)格，分別探采用不同方式對富硒豌豆苗進(jìn)行干燥。未富硒豌豆苗進(jìn)行相同處理。

1.3.1.1 豌豆苗粉的熱風(fēng)干燥

將上述切分好的豌豆苗樣品分別置于60、80、100、120、140 ℃溫度條件下進(jìn)行熱風(fēng)干燥，物料干燥至含水率為5%時粉碎，得到經(jīng)熱風(fēng)干燥制備的富硒豌豆苗粉，測定有機(jī)硒含量，以干燥前的樣品有機(jī)硒含量（以干基計）為對照，計算有機(jī)硒含量損失率，選取熱風(fēng)干燥最優(yōu)的加工工藝參數(shù)[15]。

1.3.1.2 豌豆苗粉的冷凍干燥

將上述切分好的豌豆苗樣品置于-35 ℃環(huán)境中冷凍過夜后，置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，物料干燥至含水率為5%時粉碎，得到經(jīng)冷凍干燥制備的富硒豌豆苗粉，并進(jìn)行豌豆苗蔬菜粉有機(jī)硒含量的測定，以干燥前的樣品有機(jī)硒含量（以干基計）為對照，計算有機(jī)硒損失率，并與熱風(fēng)干燥最優(yōu)工藝下的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。

1.3.2 有機(jī)硒含量的測定

富硒豌豆苗粉有機(jī)硒含量的測定采用王世成等[16]的方法并稍作修改。稱取1.0 g豌豆苗粉樣品置于離心管內(nèi)，加入9 mL蒸餾水，攪拌混勻，隨后4 500 r/min離心20 min，重復(fù)進(jìn)行5 次，收集沉淀，按照GB 5009.93—2017《食品中硒的測定》的相關(guān)方法進(jìn)行微波消解后，采用熒光分光光度法測得有機(jī)硒的含量。

1.3.3 豌豆苗粉色差的測定

干燥后的富硒豌豆苗粉樣品置于比色皿中，采用色差儀測定不同干燥條件下所得豌豆苗粉的色差參數(shù)，其中L*值表示亮度，a*值表示紅綠度，b*值表示黃藍(lán)度。

1.3.4 豌豆苗粉微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用掃描電鏡觀測豌豆苗粉的表觀形貌。分別取適量未富硒、富硒的豌豆苗粉樣品，置于掃描電鏡的樣品臺上進(jìn)行噴金鍍膜處理（厚度10～20 mm、10 kV、15 mA），處理好的豌豆苗粉置于掃描電鏡觀察臺，調(diào)節(jié)掃描電鏡的焦距，分別在×300、×600、×1 000放大倍數(shù)下對豌豆苗粉樣品進(jìn)行表觀形貌的觀察。

1.3.5 豌豆苗粉水分分布的測定

稱取豌豆苗粉樣品50.0 mg置于核磁管中，采用低場核磁共振分析儀的脈沖序列對樣品中水分分布的橫向弛豫時間（T2）進(jìn)行測定。測定條件：采樣帶寬200、射頻延時0.002 s、重復(fù)采樣等待時間1 000 ms、回波時間0.2 ms、重復(fù)采樣64 次、回波個數(shù)3 000。在采樣信號曲線所得到的弛豫譜圖中，弛豫峰面積比例代表該相態(tài)水含量，峰面積越大表示該相態(tài)的水含量越多。

1.3.6 豌豆苗蔬菜粉復(fù)水性的測定

復(fù)水性的測定采用問小龍等[15]的方法。準(zhǔn)確稱取0.25 g豌豆苗粉，加入5 mL蒸餾水，在室溫條件下靜置1 h，10 000 r/min條件下離心25 min，收集沉淀物稱質(zhì)量，以沉淀的質(zhì)量計作復(fù)水后豌豆苗粉的質(zhì)量。以復(fù)水比表征復(fù)水性，復(fù)水比按公式（1）計算：

式中：mv為復(fù)水后蔬菜粉的質(zhì)量/g；md為復(fù)水前蔬菜粉的質(zhì)量/g。

1.3.7 體外抗氧化活性的測定

稱取未富硒、富硒豌豆苗粉樣品各0.2 g，置于50 mL的離心管中，分別加入10 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，利用超聲波儀（功率480 W）提取20 min，過濾除去殘渣，即得到抗氧化物質(zhì)的乙醇提取液，配制成不同質(zhì)量濃度（0.325、0.650、1.300、2.600、5.200 mg/mL）的樣品溶液，于-4 ℃密封保存、備用[17]。

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH自由基試劑盒法測定樣品的DPPH自由基清除能力，以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液為陰性對照，VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液為陽性對照。取上述豌豆苗粉醇提液400 μL，加入600 μL工作液混勻，在室溫25 ℃條件下避光靜置30 min，4 000 r/min離心5 min，吸取溶液800 μL至比色皿中，用無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度。按公式（2）計算DPPH自由基清除率：

式中：A空白為無水乙醇＋工作液組的吸光度；A對照為無水乙醇＋樣品組的吸光度；A測定為工作液＋樣品組的吸光度。

1.3.7.2 羥自由基清除能力的測定

采用羥自由基試劑盒法測定樣品的羥自由基清除能力，以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液為陰性對照，VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液為陽性對照。配制好的底物應(yīng)用液置于37 ℃水預(yù)中預(yù)溫3 min，取0.2 mL底物應(yīng)用液加入0.2 mL豌豆苗粉乙醇提取液、0.4 mL應(yīng)用液III，迅速混勻，37 ℃水浴反應(yīng)1 min后，立即加入定量顯色劑終止反應(yīng)。將溶液混勻，室溫放置20 min后，用蒸餾水調(diào)零，在550 nm波長處測定吸光度。按公式（3）計算羥自由基清除率：

式中：A空白為以蒸餾水替代樣品溶液組的吸光度；A對照為以蒸餾水替代應(yīng)用液組的吸光度；A測定為應(yīng)用液＋樣品組的吸光度。

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定

樣品中超氧陰離子自由基清除能力的測定也以未富硒豌豆苗粉乙醇提取液為陰性對照，VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液為陽性對照。取0.05 mol/L Tris-HCl溶液4.5 mL置于試管中，37 ℃靜置水浴30 min后，加入1.0 mL豌豆苗粉乙醇提取液和0.5 mL 25.0 mmol/L鄰苯三酚溶液，置于25 ℃水浴環(huán)境中反應(yīng)4 min，加入8.0 mol/L HCl溶液0.5 mL，在320 nm波長處測定吸光度[18]，以蒸餾水調(diào)零。按公式（4）計算超氧陰離子自由基清除率：

式中：A0為以蒸餾水替代樣品溶液組的吸光度；A2為添加鄰苯三酚樣品溶液組的吸光度；A1為未添加鄰苯三酚樣品溶液組的吸光度。

1.3.7.4 還原力的測定

取1.0 mL質(zhì)量濃度為0.65 mg/mL未富硒與富硒豌豆苗粉的乙醇提取液于試管中，分別加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，之后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL并充分混勻，50 ℃水浴20 min。取出后放置到室溫狀態(tài)，持續(xù)添加體積分?jǐn)?shù)10.0%的三氯乙酸溶液2.5 mL。待其加入完成后，3 000 r/min離心10 min。取樣品上層醇提液2.5 mL，加入同體積的蒸餾水混合均勻，再加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液，置于室溫環(huán)境下避光反應(yīng)10 min，于700 nm波長處測定吸光度[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對富硒豌豆苗粉中有機(jī)硒含量的影響

由圖1可以看出，經(jīng)熱風(fēng)干燥工藝處理后，富硒豌豆苗粉的有機(jī)硒有所損失。熱風(fēng)干燥的溫度較高時，雖然豌豆苗樣品干燥成粉所需的時間較短，但其有機(jī)硒損失較高；熱風(fēng)干燥的溫度較低時，有機(jī)硒損失程度則較低，但豌豆苗樣品干燥成粉所需的時間較長。綜合考慮，選取熱風(fēng)干燥工藝的溫度為100 ℃，此條件下有機(jī)硒含量最高，為1.05 μg/g，損失率最低，為36.7%。

圖1 不同干燥方式對富硒豆苗粉有機(jī)硒含量及損失率的影響Fig.1 Effects of drying methods on organic selenium content and loss percentage of pea seedling powder

經(jīng)冷凍干燥處理得到的富硒豌豆苗粉有機(jī)硒含量為1.15 μg/g，有機(jī)硒損失率為33.8%，其有機(jī)硒損失率略低于熱風(fēng)干燥方式處理得到的豌豆苗粉，但均差異不顯著。綜合考慮實際生產(chǎn)過程中成本投入、能耗等問題，選擇100 ℃熱風(fēng)干燥工藝獲得的富硒豌豆苗粉進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 熱風(fēng)干燥溫度對富硒豌豆苗粉色澤的影響

L*值可衡量產(chǎn)品色彩的明暗程度，其值越大表示樣品表面越亮；a*值可衡量產(chǎn)品的紅綠程度，正值表示偏紅色，負(fù)值表示偏綠色，b*值可衡量產(chǎn)品的藍(lán)黃程度，其為正值表示偏黃色，負(fù)值表示偏藍(lán)色[20]。由圖2可知，不同熱風(fēng)干燥溫度之間L*值具有顯著差異（P＜0.05）。a*值越小表明樣品色澤則越鮮綠，熱風(fēng)干燥溫度為60～100 ℃時，a*值為負(fù)值，表明豌豆苗粉在較低溫度下干燥時，對原料本身的鮮綠度影響較?。粶囟雀哂?20 ℃時，a*值較大，表明其顏色偏黃，這可能與干燥過程中的美拉德反應(yīng)有關(guān)，熱風(fēng)干燥溫度越高，褐變越嚴(yán)重。各組間b*值存在顯著差異（P＜0.05），富硒豌豆苗粉整體色澤偏向黃色。這可能與硒元素的富集有關(guān)，硒元素本身的顏色為紅色，豌豆苗顏色呈綠色，當(dāng)兩者疊加時可能會呈現(xiàn)黃色[21]。當(dāng)干燥溫度為100 ℃時，富硒豌豆苗粉的色澤較為明亮、鮮綠，其L*值為45.98，a*值為-4.83，b*值為21.17。

圖2 熱風(fēng)干燥溫度對富硒豌豆苗粉色澤的影響Fig.2 Effect of hot air drying temperature on the color of seleniumenriched pea seedling powder

2.3 富硒對豌豆苗粉表觀形貌的影響

由圖3可知，未富硒與富硒的豌豆苗粉表觀形貌均呈現(xiàn)塊狀顆粒，表面褶皺；與未富硒豌豆苗粉相比，富硒的豌豆苗粉表面未觀察到明顯的孔洞，但表面褶皺程度及纖維管束明顯增多，這一點在豌豆苗復(fù)水過程中有助于增加與水分的接觸面積或增強(qiáng)毛細(xì)管吸附作用中有所體現(xiàn)，因此有利于豌豆苗粉復(fù)溶過程中保持較好的吸水性、持水性或膨脹度，同時也說明富硒能對豌豆苗粉表觀形貌具有一定的影響[22]。

圖3 富硒與未富硒豌豆苗粉掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.3 SEM images of selenium-enriched and ordinary pea seedling powders

2.4 富硒對豌豆苗粉水分分布的影響

低場-核磁共振圖中，T21、T22和T23處的峰分別代表緊密結(jié)合水、弱結(jié)合水（機(jī)械結(jié)合水）和自由水的弛豫時間，數(shù)值越高代表水分的流動性越高；A21、A22和A23分別為T21、T22和T23的各自峰面積所占峰面積之和的百分比，其數(shù)值越高代表此部分水分的比例越大[23]。對于豌豆苗粉體系，T21代表的緊密結(jié)合水存在于非水組分附近，與其分子之間通過化學(xué)鍵緊密結(jié)合的一部分水，而蛋白、糖水化合物等聚合物分子鏈的膨脹、伸展及持水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是大分子與水分子通過緊密締合形成的；因此，此部分水分的含量可能對體系復(fù)溶過程中分子鏈的膨脹、伸展及持水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成具有重要影響；T22代表機(jī)械結(jié)合的水分，為分子表面附著的水，具有一定的流動性，這部分水分的存在有助于穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)；T23代表自由水，此部分水分為干燥過程中去除的主要水分，因此，此部分水分的含量可能與干燥程度有關(guān)[24-25]。由圖4和表1可知，與未富硒豌豆苗粉相比，富硒豌豆苗粉緊密結(jié)合水（A21）及機(jī)械結(jié)合水（A22）的比例顯著增加，且機(jī)械結(jié)合水的流動性顯著增強(qiáng)；富硒豌豆苗粉自由水比例顯著減少，說明富硒豌豆苗粉在干燥過程中可以更好地除去游離水分。這可能是富硒過程中硒元素與豌豆苗細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致其滲透壓增大，從而改變了豌豆苗粉的水分分布情況。這一點也有利于改善產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性及加工適應(yīng)性，例如冷藏過程中減少冰晶的形成，以及復(fù)水過程中保持較好的復(fù)溶性。

表1 富硒對豌豆苗粉T2和峰值面積的影響Table 1 Effect of selenium enrichment on T2 relaxation times and peak area ratios in pea seedling powder

2.5 富硒對豌豆苗粉復(fù)水性的影響

復(fù)水性對蔬菜粉品質(zhì)有重要影響，由圖5可知，富硒豆苗粉的復(fù)水性顯著高于未富硒豆苗粉，這可能是由于富硒改變了豌豆苗粉的細(xì)胞滲透壓或纖維結(jié)構(gòu)[26-27]。這與上述表觀形貌、水分分布的分析結(jié)果相印證。

圖5 富硒對豌豆苗粉復(fù)水性的影響Fig.5 Effect of selenium enrichment on rehydration ratio of pea seedling powder

2.6 富硒對豌豆苗粉的體外抗氧化活性的影響

富硒過程中，硒元素可以通過與豌豆苗粉某些活性物質(zhì)的結(jié)合從而改變體系的抗氧化活性及功能特性等[28]。例如，硒元素與豆苗蔬菜粉中谷胱甘肽過氧化物酶的結(jié)合可提高其DPPH自由基清除能力[29-31]，硒蛋白以及一些含硒的酶類物質(zhì)能夠有效清除羥自由基[32]，以硒元素為活性部位的蛋白物質(zhì)可提高其超氧陰離子自由基清除能力。

由圖6及表2可以看出，0～6 mg/mL范圍內(nèi)，未富硒與富硒豌豆苗粉乙醇提取液均表現(xiàn)出DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力，但均低于VC的清除效果，且隨質(zhì)量濃度增加，各自由基的清除能力呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢。與未富硒豌豆苗粉相比，質(zhì)量濃度相同時，富硒豌豆苗粉乙醇提取液DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除率顯著較高（P＜0.05）。根據(jù)半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和還原力，判定富硒豌豆苗粉乙醇提取液DPPH自由基清除能力（IC50＝0.61 mg/mL）、羥自由基清除能力（IC50＝0.86 mg/mL）及超氧陰離子自由基清除能力（IC50＝0.90 mg/mL）較未富硒豌豆苗粉乙醇提取液顯著提高（P＜0.01）。這可能與富硒過程中，硒元素與某些氨基酸、谷胱甘肽過氧化物酶等物質(zhì)的結(jié)合有關(guān)。胡玲玲等[33]在富硒發(fā)芽糙米蛋白抗氧化活性研究中的相關(guān)結(jié)果也表明硒元素可能會與某些酶類物質(zhì)結(jié)合，從而提高其抗氧化活性；趙萍等[34]所進(jìn)行的小麥發(fā)芽富硒工藝及抗氧化活性研究也同樣表明硒元素可提高其抗氧化活性。但體外抗氧化實驗易存在假陽性結(jié)論，因此還需進(jìn)一步通過動物或細(xì)胞實驗明確富硒豌豆苗粉的生物活性機(jī)制。

表2 豌豆苗粉乙醇提取液體外抗氧化活性的IC50Table 2 IC50 for in vitro antioxidant activity of ethanol extract from pea seedling powder

圖6 豌豆苗粉乙醇提取液的體外抗氧化活性Fig.6 In vitro antioxidant activity of ethanol extract from pea seedling powder

某種物質(zhì)其提供的電子能力越強(qiáng)，所具有的還原力就越強(qiáng)，本實驗所選擇的實驗試劑為鐵氰化鉀，其測定的吸光度越大，被檢測物質(zhì)的還原力則越強(qiáng)，抗氧化能力越高[35]。由圖6可知，富硒豌豆苗粉醇提液的鐵離子還原能力顯著高于未富硒豌豆苗粉乙醇提取液（0.30 vs.0.17，P＜0.01），這可能是因為含硒元素的物質(zhì)有效抑制了金屬離子的催化氧化作用[36]。

3 結(jié)論

本實驗以未富硒豌豆苗粉和富硒豌豆苗粉為研究對象，在建立了豌豆苗粉熱風(fēng)干燥工藝的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)探究了富硒過程對豌豆苗粉理化性質(zhì)及體外抗氧化活性的影響規(guī)律。結(jié)果表明，豌豆苗粉熱風(fēng)干燥過程中，當(dāng)干燥溫度為100 ℃時，富硒豌豆苗粉的品質(zhì)較為理想，有機(jī)硒損失率較?。?6.7%）；其L*值為45.98，a*值為-4.83，b*值為21.17，色澤較為明亮、鮮綠；豌豆苗粉表觀形貌呈現(xiàn)塊狀顆粒，表面褶皺程度且纖維管束明顯增多；與未富硒豌豆苗粉相比，富硒豌豆苗粉中緊密結(jié)合水、機(jī)械結(jié)合水比例顯著增加，自由水比例顯著較少（P＜0.01）；與未富硒豌豆苗粉乙醇提取液相比，經(jīng)富硒后的豌豆苗粉乙醇提取液在DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力以及鐵離子還原能力方面具有顯著提升，富硒豌豆苗粉的體外抗氧化能力顯著高于未富硒豌豆苗粉（P＜0.05），說明富硒可在不影響豆苗蔬菜粉理化特性的基礎(chǔ)上顯著增強(qiáng)其體外抗氧化活性。