基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對接技術(shù)及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討通塞顆粒治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用機(jī)制

付子堅(jiān)，李建生，田燕歌，趙鵬，燕苗苗，蘆曉帆

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450011

2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046

3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以呼吸道持續(xù)氣流受限為特征的進(jìn)行性發(fā)展的肺部疾病，其肺部癥狀急性惡化階段又被稱為COPD 急性加重期（AECOPD）。感染是AECOPD 最主要的誘因，是造成COPD 患者肺功能惡化和氣道重塑的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。AECOPD 歸屬于中醫(yī)學(xué)肺脹范疇。有學(xué)者對AECOPD 中醫(yī)證候分布規(guī)律進(jìn)行文獻(xiàn)研究與臨床調(diào)查研究，得出痰熱壅肺型為AECOPD 的最常見證型[1-2]。通塞顆粒是河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由葶藶子、地龍、浙貝母等組成，具有清熱滌痰活血、宣肺降氣平喘等作用。經(jīng)臨床研究證實(shí)，該藥物治療痰熱壅肺型AECOPD 具有良好療效，可以有效改善患者的通氣功能和血?dú)夥治鼋Y(jié)果，減少肺部炎癥，促進(jìn)炎性分泌物的吸收[3-4]。團(tuán)隊(duì)前期研究表明，通塞顆粒-補(bǔ)肺益腎方序貫治療AECOPD 可有效減輕急性炎癥滲出、改善AECOPD 大鼠肺組織病理損傷，且其作用機(jī)制與調(diào)控Toll 樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號通路有關(guān)[5-6]。本研究在此基礎(chǔ)上運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，通過構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出通塞顆粒治療AECOPD 的潛在靶標(biāo)，并對富集分析出的通路及關(guān)鍵蛋白加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為后續(xù)研究提供新思路。具體研究流程如圖1 所示。

圖1 研究流程示意圖

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級SD 大鼠50 只，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，動物質(zhì)量合格證號：110011211105823815，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（豫）2020-0004]。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（倫理審查批號為YFYDW2021028）。

1.2 藥物、試劑及儀器

1.2.1 藥物通塞顆粒（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑），鹽酸莫西沙星片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字J20150015，規(guī)格：0.4 g×3 片），硫酸沙丁胺醇片（江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32024535，規(guī)格：2mg×100 片）。

1.2.2 試劑肺炎克雷伯桿菌（46117-5a1），購于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）；紅旗渠過濾嘴烤煙型香煙（河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（Servicebio 武漢賽維爾生物科技有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（ELISA Kit）、大鼠白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）ELISA Kit 均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；NF-κB P65 抗體（以下簡寫為P65）（貨號：GTX102090）、NF-κB P65（phospho Ser536）抗體（以下簡寫為 P -P65）（貨號：GTX133899），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）抗體[N3C2]， Internal（以下簡寫為 AKT）（貨號：GTX121937），AKT（phospho Ser473）抗體（以下簡寫為P-AKT）（貨號：GTX128414）、兔抗絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）/絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）多克隆抗體[細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2），以下簡寫為MAPK1/3]（貨號：GTX134462）、ERK1（phospho Thr202/Tyr204）+ERK2（phospho Thr185/Tyr187）抗體[HL173]（以下簡寫為P-MAPK1/3）（貨號：GTX635617）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：GTX28245）均購自美國GENETEX，INC.；腫瘤抑制蛋白53（TP53）抗體（貨號：YT3528）購自美國ImmunoWay Biotechnology Company；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠二抗（貨號：SA00001-1）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（貨號：SA00001-2）均購于武漢三鷹技術(shù)有限公司。RIPA 裂解液（貨號：20-188）購自美國EMD MILLIPORE CORPORATION；BCA 試劑盒（貨號：PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司；10%SDS-PAGE 電泳凝膠試劑盒（貨號：PG112）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.3 儀器DSI Buxco 非束縛小動物肺功能測量儀及FinePointe 動物肺功能檢測系統(tǒng)（DATA SCIENCES INTERNATIONAL，INC.，美國）；Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀及D-37520 臺式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛科技中國有限公司）；TissueLyser Ⅱ樣品破碎系統(tǒng)（QIAGEN，德國）；DM6000 B 光學(xué)顯微鏡及LAS V4.7 照相系統(tǒng)（Leica，德國）；Image-pro plus（IPP）6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics，美國）。

2 研究方法

2.1 數(shù)據(jù)庫與軟件①數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）、人類基因（GeneCards）數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)系統(tǒng)（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）、人類疾病相關(guān)基因（DisGeNET）數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、人類疾?。∕alaCards）數(shù)據(jù)庫（https：//www.malacards. org/）、 DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）、微生信在線生物信息學(xué)分析、可視化云平臺（http：//www. bioinformatics. com. cn/）、STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（RSCB PDB）（https：//www.rcsb.org/）、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)（Pub-chem）數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。②軟件：Cytoscape 3.8.1軟件，R 4.1.3 軟件，ChemoBio 3D Ultra 17.0 軟件；Pymol 軟件，AutoDockTool 1.5.6 軟件，Vina 軟件。

2.2 通塞顆?；钚猿煞趾推鋵?yīng)靶點(diǎn)篩選將通塞顆粒中的10 味中藥（矮地茶、赤芍、大黃、地龍、麻黃、麥冬、人參、石菖蒲、葶藶子、浙貝母）分別錄入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)TCMSP 參數(shù)信息，將口服利用度（OB）≥20% 且類藥性質(zhì)（DL）≥0.1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取各中藥活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)，并從Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行注釋，轉(zhuǎn)換為基因編號ID（Gene Symbol ID）。其中地龍、麥冬2 味中藥并未被TCMSP 數(shù)據(jù)庫收錄，將其錄入中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫，獲得2 味中藥的化學(xué)成分物質(zhì)數(shù)字識別號碼（CAS 號），再從TCMSP 數(shù)據(jù)庫根據(jù)參數(shù)信息，將OB≥20%且DL≥0.1%作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選。

2.3 疾病基因篩選以“acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards、 OMIM、 DisGeNET、 MalaCards、 Drug-Bank 5 個數(shù)據(jù)庫，檢索獲取與AECOPD 相關(guān)的基因。

2.4 共同靶點(diǎn)獲取和網(wǎng)絡(luò)圖的繪制通過微生信在線生物信息學(xué)分析、可視化云平臺繪制韋恩圖（Venn圖），獲得通塞顆粒治療AECOPD 的交集靶點(diǎn)。將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件構(gòu)建中藥-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖平均度值（degree值）篩選出核心活性成分。

2.5 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將2.4 項(xiàng)中篩選得到的交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，從多種蛋白質(zhì)（multiple proteins）中導(dǎo)入選中靶點(diǎn)，有機(jī)體（organism）選為“智人（homo sapiens）”，以最高置信度（highest confidence）＞0.900作為篩選條件，下載交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)TSV 文件。將下載文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)平均度值（degree 值）和平均中介中心度值（betweenness 值）篩選核心靶點(diǎn)。

2.6 相關(guān)通路富集分析運(yùn)用R 語言軟件中的“org.Hs.eg.db”數(shù)據(jù)包將核心靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因ID，導(dǎo)入R 4.1.3 軟件，設(shè)定P-value＜0.05、Q-value＜0.05，利用“BiocManager”等軟件包對關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，取前30 項(xiàng)構(gòu)建柱狀圖。并將KEGG 通路富集分析得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件進(jìn)一步構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.7 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接將2.4、2.5 項(xiàng)中degree 值排在前5 的活性成分和degree 值排在前6 的核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行對接。將活性成分的英文名稱導(dǎo)入Pub-chem 數(shù)據(jù)庫，下載其相應(yīng)的小分子配體（2D 結(jié)構(gòu)，sdf 格式），使用ChemoBio 3D Ultra 17.0 軟件轉(zhuǎn)格式（3D 結(jié)構(gòu)，mol2 格式）；將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niport 數(shù)據(jù)庫，限定物質(zhì)來源設(shè)定為homo sapiens，將得到的條目導(dǎo)入RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫，下載其相應(yīng)的基因蛋白（3D 結(jié)構(gòu)，pdb 格式），利用AutoDockTool 1.5.6 軟件去水加氫轉(zhuǎn)格式（3D 結(jié)構(gòu)，pdbqt 格式），并設(shè)置保存活性口袋的數(shù)據(jù)參數(shù)（grid.gpf 格式）。運(yùn)用Vina 軟件對活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，結(jié)果通過Pymol 軟件進(jìn)行可視化展示。

2.8 通塞顆粒治療AECOPD 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.8.1 模型制備與分組干預(yù)采用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、中藥組、西藥組、聯(lián)合組。每組10 只。除對照組外，其余各組通過香煙和肺炎克雷伯桿菌刺激誘導(dǎo)制備AECOPD大鼠模型[7-8]。并于急性加重前2 d（Day-1、0）及其后4 d（Day 2～5）給予灌胃治療，每天2 次。藥物灌胃劑量采用等效劑量系數(shù)換算公式計(jì)算，具體公式為：D大鼠=D人×（HI大鼠/HI人）×（W大鼠/W人）2/3（其中D：劑量；HI：體型系數(shù)；W：體質(zhì)量），具體給藥方案見表1。對照組、模型組均予同體積0.9%氯化鈉溶液。

表1 各組大鼠給藥方案

2.8.2 肺功能檢測治療結(jié)束后，用DSI Buxco 非束縛小動物肺功能測量儀以及FinePointe 動物肺功能檢測系統(tǒng)檢測大鼠的肺功能指標(biāo)，包括0.3 s 用力呼氣容積（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、0.3 s 用力呼氣容積與用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、呼氣流量峰值（PEF）。

2.8.3 血清TNF-α、IL-17 含量麻醉大鼠，腹主動脈取血。取上清，采用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-17 的含量。

2.8.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察處死大鼠后，結(jié)扎未灌洗的左肺，取肺組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進(jìn)行HE 染色并封片，在光學(xué)顯微鏡100 倍及200 倍光鏡下觀察切片。

2.8.5 肺組織中P-P65、P65、P-AKT、AKT、PMAPK1/3、MAPK1/3 以及TP53 的蛋白表達(dá)在肺組織中加入RIPA 裂解液，剪碎打成勻漿，用離心機(jī)離心后提取蛋白質(zhì)，通過BCA 試劑盒經(jīng)全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳凝膠分離，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后，用IPP 6.0 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描，測定各目的條帶及內(nèi)參GAPDH 的灰度值，計(jì)算比值，求得目的蛋白的相對表達(dá)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊時，多重比較采用LSD 法；方差不齊時，多重比較采用Dunnett T3 法。計(jì)量資料數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 研究結(jié)果

4.1 通塞顆?；钚猿煞旨捌漕A(yù)測靶點(diǎn)篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集、基于藥物代謝動力學(xué)（ADME）參數(shù)（OB≥20%、DL≥0.1）篩選出通塞顆粒的活性成分共219 個，對應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)1 351 個，刪去在UniProt 數(shù)據(jù)庫中不能匹配基因名的靶點(diǎn)，去重后，獲得通塞顆粒有效成分172 個，對應(yīng)預(yù)測靶點(diǎn)306 個。各中藥的活性成分個數(shù)和其對應(yīng)的靶點(diǎn)個數(shù)見表2。部分中藥活性成分名稱見表3。

表2 通塞顆?；钚猿煞謧€數(shù)和靶點(diǎn)個數(shù)（去重）

表3 通塞顆粒治療AECOPD 的活性成分名稱

4.2 AECOPD 疾病靶點(diǎn)收集將從各數(shù)據(jù)庫檢索AECOPD 英文全稱獲取的疾病相關(guān)靶點(diǎn)與通塞顆粒的預(yù)測靶點(diǎn)結(jié)合，基于微生信在線生物學(xué)分析、可視化平臺制圖分析。數(shù)據(jù)庫疾病靶點(diǎn)個數(shù)：GeneCard 數(shù)據(jù)庫1 993 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫173 個，DrugBank 數(shù)據(jù)庫42 個，DisGeNET 數(shù)據(jù)庫63 個，MalaCards 數(shù)據(jù)庫97 個，見圖2。通塞顆粒與AECOPD 的交集靶點(diǎn)共200 個，見圖3。

圖2 AECOPD 疾病相關(guān)靶點(diǎn)Venn 圖

圖3 通塞顆粒-AECOPD 靶點(diǎn)交集Venn 圖

4.3 通塞顆?；钚猿煞峙cAECOPD 交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape 3.8.1 軟件構(gòu)建通塞顆粒的活性成分與AECOPD 交集靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。在網(wǎng)絡(luò)中通過degree 值和betweenness 值篩選得到前5 名關(guān)鍵活性成分，分別為槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇，見表4。

表4 關(guān)鍵活性成分篩選

圖4 通塞顆?；钚猿煞?AECOPD 交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4.4 核心靶點(diǎn)篩選將從STRING 數(shù)據(jù)庫篩選得到的162 個交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1 軟件進(jìn)行處理，其PPI 關(guān)系見圖5。將靶點(diǎn)根據(jù)degree 值和betweenness 值的大小進(jìn)行排列，最終篩選得到前6 名核心靶點(diǎn)，分別為TP53、MAPK3、MAPK1、RELA 原癌基因（RELA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF），見表5。

表5 核心靶點(diǎn)篩選

圖5 中藥-疾病共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

4.5 GO 富集分析及KEGG 通路富集分析將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析。GO富集分析：將“P-value＜0.05、Q-value＜0.05”作為篩選條件，得到總條目2 883 個，其中生物過程（BP）2 566 條，細(xì)胞組成（CC）108 條，分子功能（MF）209條，每組選取前10 條生成可視化三合一柱狀圖，見圖6。

圖6 GO 富集分析柱狀圖

KEGG 通路富集分析：關(guān)鍵靶點(diǎn)富集在178 條通路上，根據(jù)P值和Q值排序，選取前30 條繪制柱狀圖，見圖7。查閱文獻(xiàn)并結(jié)合P值和Q值，篩選出與AECOPD 密切相關(guān)的TNF、IL-17、MAPK、NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）-AKT、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）通路，見圖8。

圖8 交集靶點(diǎn)-信號通路圖

4.6 分子對接將關(guān)鍵活性成分槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與核心靶點(diǎn)TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、AKT1、TNF 進(jìn)行分子對接。結(jié)合能（Binding energy）體現(xiàn)配體與受體之間結(jié)合的可能性，能值越低表示配體與受體之間親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定，在自然狀態(tài)下更易結(jié)合。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol 表明有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 表明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[9]。結(jié)果顯示，對接均具有較好的結(jié)合活性，見圖9。具體分子對接見圖10。

圖9 分子對接自由結(jié)合能熱圖

圖10 中藥關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)對接圖

4.7 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

4.7.1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)對照組大鼠：支氣管結(jié)構(gòu)基本完整，肺血管壁未見明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，少量散在的炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠：支氣管上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增生，大量炎性細(xì)胞浸潤，肺血管壁增厚，肺泡間隔變窄并斷裂，融合成較大的囊腔。中藥組大鼠：支氣管結(jié)構(gòu)的破壞、炎性細(xì)胞的浸潤、肺泡間的融合均較用藥前改善，但肺血管壁仍可見明顯增厚。西藥組大鼠：支氣管病理學(xué)變化與中藥組相當(dāng)。聯(lián)合組大鼠：支氣管上皮細(xì)胞的破壞程度較模型組明顯減輕，肺血管壁輕微增厚，炎性細(xì)胞的浸潤及肺泡融合擴(kuò)張明顯改善，治療效果最好。見圖11。

4.7.2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較見表6。模型組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF 值均較對照組降低（P＜0.05）。中藥組、西藥組以及聯(lián)合組的FVC、FEV0.3、PEF 值均較模型組升高（P＜0.05）；聯(lián)合組FEV0.3/FVC 值較模型組升高（P＜0.05）。中藥組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF 值與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合組FVC、PEF 值均較中藥組及西藥組升高（P＜0.05）；聯(lián)合組FEV0.3較西藥組升高（P＜0.05）。

表6 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯(lián)合組6 6 6 6 6 FVC（mL）18.03±2.24 10.23±1.40①13.07±1.86①②13.10±1.38①②16.28±0.97②③④FEV0.3（mL）17.13±1.96 9.16±1.40①12.83±1.98①②12.47±1.46①②14.71±1.80①②④FEV0.3/FVC（%）95.55±1.01 85.08±1.61①90.77±4.03 90.44±5.94 93.50±2.82②PEF（mL/s）92.10±2.77 71.59±1.19①81.19±0.89①②80.96±1.05①②86.94±0.80①②③④

4.7.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較見表7。模型組、中藥組、西藥組、聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-17 含量均高于對照組（P＜0.05）；中藥組、西藥組及聯(lián)合組的TNF-α、IL-17 含量均低于模型組（P＜0.05）；聯(lián)合組血清TNF-α、IL-17 含量均低于中藥組、西藥組（P＜0.05）。中藥組TNF-α 含量高于西藥組（P＜0.05），IL-17 含量低于西藥組（P＜0.05）。

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較（±s） pg/mL

表7 各組大鼠血清TNF-α、IL-17 含量比較（±s） pg/mL

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯(lián)合組6 6 6 6 6 TNF-α 11.84± 1.37 35.63± 0.76①31.26± 0.45①②27.92± 1.42①②③24.50± 1.23①②③④IL-17 17.67± 1.09 44.10± 2.17①23.84± 0.75①②26.29± 0.71①②③21.08± 0.62①②③④

4.7.4 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)含量比較見表8、圖12。模型組肺組織P-P65/P65、P-AKT/AKT、P-MAPK1/3/MAPK1/3 和TP53/GAPDH 蛋白表達(dá)含量均高于對照組（P＜0.05）；中藥組、西藥組以及聯(lián)合組上述蛋白的表達(dá)含量均低于模型組（P＜0.05）；聯(lián)合組上述蛋白的表達(dá)含量均低于中藥組、西藥組（P＜0.05）。注：“P”代表磷酸化，“非P”代表非磷酸化。前者代表該蛋白的磷酸化水平，后者代表該蛋白的含量。因很多信號通路的蛋白在受到刺激后，均是通過其磷酸化水平的改變而引起一系列細(xì)胞反應(yīng)，所以用磷酸化與非磷酸化的比值來體現(xiàn)各組檢測蛋白的實(shí)際表達(dá)含量。P65、MAPK1/3 及AKT 均是通過磷酸化表達(dá)來證明通路的激活，但TP53 不是此類型，所以用TP53 與內(nèi)參GAPDH 的比值來體現(xiàn)蛋白的表達(dá)含量。

表8 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)比較（±s）

表8 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)比較（±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與中藥組比較，P＜0.05；④與西藥組比較，P＜0.05

樣本量組 別對照組模型組中藥組西藥組聯(lián)合組6 6 6 6 6 P-AKT/AKT 0.05±0.02 1.01±0.14①0.50±0.15①②0.43±0.12①②0.11±0.04②③④P-MAPK1/3/MAPK1/3 0.18±0.10 0.98±0.20①0.57±0.30①②0.54±0.16①②0.36±0.11②P-P65/P65 0.08±0.36 1.59±0.34①0.88±0.23①②1.02±0.24①②0.37±0.24①②③④TP53/GAPDH 0.09±0.01 1.41±0.03①0.92±0.12①②0.42±0.03①②③0.29±0.02①②③④

圖12 各組大鼠肺組織中相關(guān)蛋白條帶圖

5 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對通塞顆粒治療AECOPD 的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。動物實(shí)驗(yàn)病理學(xué)及肺功能檢測結(jié)果顯示通塞顆粒可有效改善AECOPD 肺泡融合、血管壁增厚，減輕肺損傷并有助于恢復(fù)呼吸功能。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，通塞顆粒的關(guān)鍵活性成分是槲皮素、山柰酚、芹菜素、木犀草素和β-谷甾醇，除β-谷甾醇外，其余成分均為天然黃酮。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用，而抗炎、抗氧化特性使其成為治療肺部炎癥疾病的潛在藥物[10]。有研究表明，槲皮素能通過抑制磷酸二酯酶4（PED-4）、激活cAMP/PKA 信號通路，抑制NF-κB 活化，并可有效減輕氣道炎癥[11-12]；在COPD 鼠體模型中，槲皮素可顯著降低TNF-α 表達(dá)水平，抑制肺泡細(xì)胞凋亡，減少肺部損傷，預(yù)防COPD 的急性加重[13]。Chung MJ 等[14]通過實(shí)驗(yàn)證明，山奈酚可以顯著減少哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)量，改善肺泡充血及氣道壁增厚等急性肺損傷的病理特征；另外，山奈酚還可通過調(diào)節(jié)Nrf2 和NF-κB 信號通路來減少氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[15]。木犀草素可以通過抑制內(nèi)毒素刺激導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞磷酸化，降低IL-6 等炎癥因子的表達(dá)水平，提高肺血管通透性，減輕COPD 患者的肺水腫癥狀，改善肺功能[16-17]。芹菜素碳苷可通過抑制TLR4/瞬時受體電位通道蛋白6（TRPC6）信號通路的激活，減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的BALB/c 小鼠急性肺損傷模型的肺部炎癥和免疫毒性[18]。β-谷甾醇是一種天然甾醇，臨床上應(yīng)用以它為主要成分的中藥球蘭治療呼吸道疾病有很好的消炎作用[19]；有實(shí)驗(yàn)證明，β-谷甾醇可通過下調(diào)硫氧還蛋白（Trx）/硫氧還蛋白-1（Trx1）激活TP53 表達(dá)，誘導(dǎo)A549 肺癌細(xì)胞的凋亡，起到抗癌作用[20]。

通過中藥-疾疾共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，通塞顆粒治療AECOPD 的核心靶點(diǎn)涉及TP53、MAPK1、MAPK3、TNF、AKT1、RELA。TP53 是人體重要的抑癌因子，其功能為調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[21]；目前有研究已證實(shí)TP53 可通過外源性和內(nèi)源性凋亡途徑，調(diào)控細(xì)胞凋亡[22]；TP53 能通過下調(diào)B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）及上調(diào)細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax 的表達(dá)水平來促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程[23]；TP53 抑制劑可有效減少COPD大鼠肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，減輕肺組織損傷[24-25]。MAPK 作為一種絲裂原活化蛋白激酶，負(fù)責(zé)在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，參與多種炎癥細(xì)胞因子和應(yīng)激信號的傳導(dǎo)[26]；MAPK1、MAPK3 均屬于MAPK 家族，可以通過介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答、氣道結(jié)構(gòu)、細(xì)胞反應(yīng)等途徑參與哮喘和COPD 的發(fā)生與發(fā)展[27-29]。文獻(xiàn)[30]報(bào)道MAPK1、MAPK3 的激活可以抑制細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果顯示，香煙煙霧提取物（cCSE）誘導(dǎo)的A549 肺癌細(xì)胞MAPK1、MAPK3 磷酸化水平顯著升高，并且增加了肺泡上皮細(xì)胞的凋亡[31]。RELA 是NF-κB 家族的重要成員，RELA/p65 具有激活NF-κB 轉(zhuǎn)錄的功能，當(dāng)NF-κB 被激活，將出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位過程，結(jié)合于相關(guān)基因上游的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控元件，促進(jìn)相關(guān)基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)對應(yīng)分子的表達(dá)[32-33]。近年越來越多的研究表明，通過對RELA/P65 翻譯后修飾可以對NF-κB 通路進(jìn)行精準(zhǔn)和復(fù)雜的調(diào)控[34]。臨床研究表明，抑制RELA/P65 的過度活化可以減輕COPD 患者的氣道炎癥反應(yīng)，改善肺功能和血?dú)庵笜?biāo)[35]。本研究的GO 富集分析結(jié)果顯示，通塞顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控LPS 反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、絲/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等BP 而發(fā)揮治療AECOPD 的功效。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，通塞顆粒治療AECOPD 主要涉及TNF、IL-17、MAPK、NF-κB、P13K、HIF-1 等多條信號通路。TNF 信號通路是COPD 疾病病理過程中的關(guān)鍵通路，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要通過上調(diào)MAPK、ERK、NF-κB 等信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)炎癥反應(yīng)[36]。TNF 信號通路通過釋放TNF-α 等促炎因子，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，促進(jìn)氣道炎性浸潤，增加血管通透性，形成肺水腫，加重肺損傷[37-38]。有研究證實(shí)，TNF-α 廣泛存在于COPD 患者的肺組織中，其升高會引起炎性介質(zhì)的瀑布樣連鎖反應(yīng)，從而加重COPD 的病情發(fā)展[39-40]。輔助性T 細(xì)胞17（Th17）是人類輔助性T 細(xì)胞分化出的一類細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-17A 導(dǎo)致炎性因子釋放，促使氣道黏液腺分泌大量黏液，與肺氣腫的形成、氣流阻塞密切相關(guān)[41]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集，增加COPD 患者支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，增強(qiáng)ICAM-1 的黏附作用，并加劇氣道炎癥反應(yīng)[42-43]。HIF-1 信號通路在細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激、損傷修復(fù)等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[44]；其由HIF-1α 和HIF-1β 兩種亞基組成異源二聚體，HIF-1α 是內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的始動因子，也是P13KAKT 信號通路的下游因子[45]。COPD 患者普遍存在缺氧的臨床表現(xiàn)，在缺氧條件下，P13K-AKT 通路被激活，AKT 活化，下游蛋白mTOR 磷酸化，促使HIF-1α蛋白合成，以應(yīng)對低氧環(huán)境，改善氣道缺血、缺氧狀態(tài)[46]。在PI3K-AKT 經(jīng)典信號通路中，AKT 是處于PI3K 下游的關(guān)鍵蛋白，在激活后，可以通過各種下游因子的磷酸化來進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控[47]；該通路上調(diào)會激活NF-κB 上游抑制蛋白κB 抑制因子激酶（IKK）及NF-κB 抑制蛋白（IKB），使后者被泛素化降解，繼而激活NF-κB 信號通路，引起TNF-α 和IL-17 等多種炎癥因子的釋放[48-49]。另外，NF-κB 信號通路通過調(diào)節(jié)呼吸道細(xì)胞因子活性，增強(qiáng)促炎分子分泌，從而加重COPD[50]。因此許多藥物通過抑制NF-κB 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而起到抗炎作用，延緩COPD 的發(fā)展[51-52]。本研究動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，通塞顆?？捎行抡{(diào)TP53、P-P65、P-AKT、P-MAPK1/3 蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)肺黏膜的作用。

綜上所述，通塞顆粒治療AECOPD 是一個涉及多成分、多靶點(diǎn)、多通路的過程。動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示相較于模型組，通塞顆?？娠@著下調(diào)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中篩選出的核心靶點(diǎn)蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，緩解肺損傷，起到治療AECOPD 的功效。本研究系統(tǒng)地闡釋了通塞顆粒治療AECOPD 的潛在活性成分、核心靶點(diǎn)以及相關(guān)通路，為后續(xù)深入驗(yàn)證和探討通塞顆粒治療AECOPD 的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)和思路。