羊肚菌菌絲的紫外誘變及高產(chǎn)多糖菌株篩選

阮永海 許騰龍 錢(qián)森和

（1安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2蕪湖野樹(shù)林生物科技有限公司，安徽 蕪湖 241111）

羊肚菌（Morchella esculenta）又稱羊肚菜、羊肚蘑和編笠菌，在真菌學(xué)分類中屬于子囊菌亞門(mén)、盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目、羊肚菌科和羊肚菌屬[1]。羊肚菌是一種珍稀名貴的野生食用菌，具有“菌中之王”“蘑菇皇后”等美譽(yù)[2]。作為藥食兩用菌，羊肚菌富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、多糖以及多酚等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)腎臟與肝臟等藥理活性[3]。其中，羊肚菌多糖是羊肚菌中一種重要的活性物質(zhì)，其對(duì)羊肚菌的品質(zhì)具有重要影響。研究表明，羊肚菌多糖具有抗菌、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等功效，在保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

目前，生產(chǎn)上種植的羊肚菌菌株主要來(lái)源于野生種的人工篩選和馴化，菌種質(zhì)量有待進(jìn)一步提升。通過(guò)人工育種技術(shù)可以獲得優(yōu)良菌株，常見(jiàn)的食用菌育種方法有雜交育種、誘變育種和基因工程育種等。其中，誘變育種是一種簡(jiǎn)單、高效的育種方法，在食用菌育種過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6]。紫外誘變是一種使用較早、應(yīng)用較廣的誘變技術(shù)，其產(chǎn)生的突變率高，且操作簡(jiǎn)單安全。實(shí)踐中已通過(guò)紫外誘變技術(shù)獲得多種植物和微生物等新品種[7]。本研究采用紫外誘變處理羊肚菌菌絲體，通過(guò)探究誘變后的菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)與多糖含量，篩選菌絲生長(zhǎng)速度快、多糖含量高的突變菌株，并對(duì)突變菌株的菌絲多糖形貌特征、紅外光譜、抗氧化活性以及菌絲的生長(zhǎng)溫度進(jìn)行分析，為羊肚菌品種的創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊肚菌由安徽蕪湖野樹(shù)林生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

SW-CJ-ZFD超凈工作臺(tái)（蘇州杰諾凈化科技有限公司）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；ZQZY-78BN震蕩培養(yǎng)箱（知楚儀器有限公司）；DHG-9000 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（無(wú)錫市翼搏凡環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LGJ-12 真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；80 L 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊儀器有限公司）；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.3 菌絲體制備

將羊肚菌子實(shí)體切小塊，取菌蓋與菌柄連接處，放入75%乙醇浸泡消毒3 min 后取出，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水清洗2～3 遍，放到PDA 固體培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.4 紫外誘變與篩選

1.4.1 菌絲體的紫外誘變?cè)诔瑑艄ぷ髋_(tái)中將上述制備的羊肚菌菌絲接入固體培養(yǎng)皿中，每個(gè)平板中央接入相同大小的菌絲圓片，于25 ℃培養(yǎng)48 h后在紫外燈正下方30 cm 處進(jìn)行紫外照射20 s；25 ℃暗培養(yǎng)24 h后再次紫外照射40 s；再次25 ℃暗培養(yǎng)24 h 后紫外照射60 s，并置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)[8]；之后挑取生長(zhǎng)較為旺盛的菌落尖端菌絲于斜面培養(yǎng)基中，直至長(zhǎng)滿斜面。用生理鹽水沖洗斜面，制備菌絲懸液，稀釋一定倍數(shù)后涂布平板，并培養(yǎng)36 h。

1.4.2 突變株的平板培養(yǎng)篩選從上述平皿中挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落菌絲接種于PDA 平板中培養(yǎng)48 h，觀察每個(gè)誘變株的菌落顏色、長(zhǎng)勢(shì)和疏密度，測(cè)量菌落的直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率，并繼續(xù)培養(yǎng)，記錄菌絲生長(zhǎng)情況，以此進(jìn)行初步篩選[9]。菌絲生長(zhǎng)速度計(jì)算公式如下。

將初步篩選的誘變株菌絲與出發(fā)菌株菌絲體接種于同一PDA培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)4～5 d后，觀察相互之間的拮抗情況，進(jìn)一步篩選發(fā)生突變的菌株。

1.4.3 遺傳穩(wěn)定性分析將出發(fā)菌株和篩選的誘變株菌絲接種于PDA 培養(yǎng)皿中，共培養(yǎng)6 代，測(cè)定第2 代、第3 代和第6 代菌絲的生長(zhǎng)速度，分析各菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 液體培養(yǎng)篩選

在超凈臺(tái)里將上述篩選的誘變株菌絲分別接種到液體培養(yǎng)基中，放入搖床25 ℃、140 r/min 培養(yǎng)5 d 后取出，用紗布過(guò)濾出菌絲球，蒸餾水清洗2～3 次，放入培養(yǎng)皿中計(jì)算菌絲球的數(shù)量；然后放入烘箱中烘干，稱量菌絲球的干重[10]，由此分析誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量。

1.6 多糖提取及含量測(cè)定

參照陳盛宇等[11]的方法提取菌絲多糖。將誘變菌株接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，之后以4 000 r/min離心培養(yǎng)液20 min，收集菌絲體，用去離子水清洗，放入烘箱烘干后打碎，即得到羊肚菌菌絲干粉，并采用水提醇沉法得到羊肚菌菌絲多糖。

將羊肚菌干重記為M1，凍干后多糖粉末重量記為M2，多糖含量計(jì)算公式如下。

1.7 多糖表征提取

1.7.1 掃描電鏡表征采用掃描電子顯微鏡對(duì)菌絲體多糖進(jìn)行表面形貌的觀察。測(cè)試前對(duì)多糖樣品噴金以提高其導(dǎo)電性，電壓為5 kV。

1.7.2 紅外光譜表征挑取少量?jī)龈傻木z體多糖與溴化鉀固體在瑪瑙研缽中進(jìn)行混合研磨，充分混勻后用壓片機(jī)壓成薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)菌絲體多糖紅外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為500～4 000 cm-1。

1.8 多糖抗氧化活性測(cè)定

1.8.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定DPPH 自由基清除能力測(cè)定參照Xiao等[12]的方法并在其基礎(chǔ)上適當(dāng)改進(jìn)。分別配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mg/mL 的羊肚菌多糖樣品溶液，將100 μL 樣品溶液與100 μL 0.4 mg/mL DPPH 乙醇溶液、100 μL樣品溶液與100 μL 無(wú)水乙醇、100 μL 0.4 mg/mL的DPPH乙醇溶液與100 μL無(wú)水乙醇等量混合加入酶標(biāo)板中，室溫下暗處反應(yīng)30 min 后，在517 nm 下測(cè)定吸光值，分別記為A0、A1和A2；同時(shí)以相同方法測(cè)定Vc的自由基清除率作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率公式如下。

1.8.2 ABTS自由基清除率測(cè)定根據(jù)景年華等[13]的方法測(cè)定ABTS自由基清除活性。分別將100 μL樣品與100 μL 提前配好的ABTS 溶液（等體積的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液）、100 μL 樣品與100 μL 無(wú)水乙醇、100 μL 提前配好的ABTS溶液與100 μL無(wú)水乙醇等量混合加入酶標(biāo)板中，室溫下暗處反應(yīng)6 min后，在734 nm下測(cè)定吸光值，分別記為B0、B1和B2；同時(shí)以相同方法測(cè)定Vc的自由基清除率作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS 自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.8.3 羥自由基清除率測(cè)定參考Zhang等[14]的方法并略作修改。將50 μL樣品與50 μL 0.250 2 mg/mL FeSO4、50 μL 0.124 3 mg/mL 水楊酸乙醇溶液以及50 μL 0.3%的過(guò)氧化氫混勻，置于37 ℃恒溫避光反應(yīng)15 min，在510 nm下測(cè)定吸光值，記為C1；用蒸餾水代替過(guò)氧化氫，在510 nm下測(cè)定吸光值，記為C2；用蒸餾水代替樣品，在510 nm 下測(cè)定吸光值，記為C0；以相同方法測(cè)定Vc 的自由基清除率，并作為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.9 誘變株菌絲體的生長(zhǎng)溫度篩選

在超凈工作臺(tái)中將每個(gè)平板中央接入相同大小的菌絲圓片，設(shè)置20、22、24和26 ℃4個(gè)溫度梯度進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌絲萌發(fā)速度、生長(zhǎng)速度以及菌絲的顏色變化。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用Origin 2018軟件作圖，SAS 8.1軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變平皿培養(yǎng)篩選

從誘變后的菌株中挑選45 株生長(zhǎng)較好的菌落于PDA 平板培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)4 d 后，根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速率和拮抗分析結(jié)果，進(jìn)一步篩選出6株菌株，并分別命名為YY-1、YY-2、YY-3、YY-4、YY-5 和YY-6。由出發(fā)菌株（CK）和6株誘變株菌絲生長(zhǎng)情況（表1）可以看出，CK 菌絲較為稀疏，其滿皿時(shí)間為6 d；YY-1 菌絲生長(zhǎng)較出發(fā)菌株濃密，菌絲滿皿時(shí)間為6 d；YY-2 和YY-6 菌絲生長(zhǎng)稀疏，滿皿時(shí)間分別為5 d 和4 d；YY-3、YY-4 和YY-5 菌絲較為濃密，滿皿時(shí)間均為5 d，其中YY-3和YY-4菌絲顏色為淺黃色。各誘變株與出發(fā)菌株均產(chǎn)生了不同程度的拮抗，表明各誘變株與出發(fā)菌株相比發(fā)生了遺傳變異，其中YY-3 菌株與出發(fā)菌株之間的拮抗作用如圖1所示。

圖1 誘變菌株菌絲的平皿生長(zhǎng)情況與拮抗作用

2.2 誘變株的遺傳穩(wěn)定性分析

對(duì)不同誘變株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，其結(jié)果如表2 所示。YY-6 的第2 代菌絲體生長(zhǎng)速率明顯降低，可能是誘變時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致遺傳物質(zhì)發(fā)生較大的改變；其他誘變株菌絲在不同代數(shù)間的生長(zhǎng)速率差異不明顯，表明其均有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 誘變株的遺傳穩(wěn)定性分析

2.3 誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量分析

由圖2可知，在25 ℃、140 r/min 的培養(yǎng)條件下，YY-1、YY-3、YY-4 和YY-5 的菌絲球個(gè)數(shù)分別為46.6、49.5、47.4 和46.2 個(gè)，多于出發(fā)菌株（37.5 個(gè)）；而YY-2 和YY-6 的菌絲球個(gè)數(shù)與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。YY-2、YY-3、YY-4和YY-5的菌絲球干重分別31.3、37.5、33.8和34.6 mg，高于出發(fā)菌株（23.6 mg）；而YY-1和YY-6菌絲球干重與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 誘變株在液體培養(yǎng)中的生物量分析

2.4 菌絲體多糖含量分析

多糖是羊肚菌中一種重要的活性成分，對(duì)羊肚菌的品質(zhì)有著重要的影響。不同誘變株菌絲體多糖含量的影響如圖3所示。YY-1、YY-2和YY-6菌株菌絲體多糖含量與出發(fā)菌株相比，差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；YY-3、YY-4 和YY-5 菌株菌絲體多糖含量高于出發(fā)菌株。

圖3 羊肚菌菌絲體多糖含量

2.5 菌絲多糖表征分析

通過(guò)上述分析，選取綜合性能較好的YY-3 菌株，對(duì)其多糖表征進(jìn)行分析。其菌絲體多糖的掃描電鏡和紅外表征如圖4 所示。從圖4（A）可以看出，羊肚菌菌絲體多糖呈扁平狀，顆粒大小約為0.5 μm，且顆粒之間結(jié)合比較緊密。從圖4（B）菌絲體多糖的紅外光譜可以看出，羊肚菌菌絲體多糖的紅外光譜在3 380 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)寬的特征吸收峰，可能是分子間氫鍵O-H 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；在2 950 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰，可能是由C-H伸縮振動(dòng)引起的；1 660 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰可能是由于C=C 雙鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；在1 420 cm-1處的吸收峰是C-H 彎曲振動(dòng)或伸縮振動(dòng)引起；在1 120 cm-1處具有吸收峰，則表明有吡喃糖環(huán)的存在。因此，羊肚菌菌絲體多糖具有一般多糖的紅外光譜特征。

圖4 羊肚菌菌絲體多糖的掃描電鏡和紅外表征

2.6 菌絲體多糖的抗氧化活性分析

YY-3 菌株菌絲體多糖的抗氧化活性分析結(jié)果如圖5 所示。從圖5（A）可以看出，羊肚菌菌絲體多糖的DPPH 自由基清除率隨濃度增大而增大，但增大的趨勢(shì)較為平緩，當(dāng)多糖濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其清除率為45.5%，低于Vc。由圖5（B）可以看出，當(dāng)多糖濃度在0.5～2.0 mg/mL，隨著多糖濃度的增大，ABTS自由基的清除率增加較為明顯，之后其清除率增加較少；當(dāng)多糖濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其ABTS 自由基清除率為90.64%。由圖5（C）可以看出，多糖的羥自由基清除率隨著多糖濃度的增大而明顯升高，當(dāng)多糖濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其羥自由基清除率為79.41%?？梢?jiàn)，羊肚菌菌絲體多糖對(duì)ABTS 自由基和羥自由基具有較好的清除能力。

圖5 羊肚菌菌絲體多糖抗氧化活性分析

2.7 菌絲體生長(zhǎng)的溫度分析

溫度對(duì)羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)有著重要的影響。由表3 可以看出，隨著溫度從20 ℃上升到24 ℃，菌絲萌發(fā)和生長(zhǎng)速度較快，菌絲顏色變化不明顯。當(dāng)溫度為24 ℃時(shí)，菌絲萌發(fā)和生長(zhǎng)速度最快；當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，其萌發(fā)和生長(zhǎng)速度明顯變慢，且菌絲顏色由微黃變?yōu)辄S色。

表3 不同溫度對(duì)YY-3菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的誘變方法包括化學(xué)誘變、物理誘變和生物誘變，其中物理誘變簡(jiǎn)單易行，且高效安全。紫外誘變是物理誘變中常用的一種方法，在微生物、蔬菜和農(nóng)作物新品種的選育中發(fā)揮重要作用[15]。紫外誘變的主要原理是使DNA能夠形成嘧啶二聚體，阻止堿基之間的正常配對(duì)，使生物體產(chǎn)生突變[16]。本研究采用紫外線照射處理羊肚菌菌絲體，根據(jù)菌絲平皿生長(zhǎng)速度及拮抗作用篩選得到了6 株正突變株；其中，YY-1、YY-2、YY-3、YY-4 和YY-5 菌株菌絲具有較好的遺傳穩(wěn)定性，而YY-6 突變株的遺傳穩(wěn)定性較差；另外，YY-3、YY-4和YY-5突變株的菌絲球個(gè)數(shù)和菌絲干重優(yōu)于出發(fā)菌株；而YY-6 突變株無(wú)論是菌絲球個(gè)數(shù)還是菌絲球干重與出發(fā)菌株的差異均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

多糖是羊肚菌食藥用的主要活性成分之一，具有抗氧化等生物學(xué)功能。篩選高產(chǎn)多糖的羊肚菌菌株，對(duì)提高羊肚菌的品質(zhì)具有重要作用[2]。本研究篩選得到的YY-3、YY-4 和YY-5 突變株菌絲體多糖含量高于出發(fā)菌株，而YY-1、YY-2 和YY-6 突變株菌絲體多糖含量與出發(fā)菌株差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，羊肚菌菌絲體多糖具有一般多糖的紅外光譜特征，其對(duì)DPPH 自由基清除能力稍差，但對(duì)ABTS 自由基和羥自由基均具有較好的清除作用。

溫度是食用菌菌絲生長(zhǎng)的重要影響因素之一，適宜的溫度能夠促進(jìn)菌絲快速生長(zhǎng)。較低的溫度導(dǎo)致菌絲萌發(fā)和生長(zhǎng)受到限制；同樣，超過(guò)菌絲生長(zhǎng)的最適溫度，菌絲顏色發(fā)生變化，生長(zhǎng)速度會(huì)急劇下降，甚至導(dǎo)致菌株死亡[17]。當(dāng)溫度低于或超過(guò)24 ℃時(shí)，羊肚菌菌絲體的萌發(fā)和生長(zhǎng)均受到抑制，且在26 ℃時(shí)菌絲顏色變成了黃色。

為篩選優(yōu)良的羊肚菌菌株，采用紫外誘變處理羊肚菌菌絲體，本研究通過(guò)探究誘變后的菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)與多糖含量，篩選菌絲生長(zhǎng)速度快、多糖含量高的突變菌株，并對(duì)突變菌株的菌絲多糖形貌特征、紅外光譜、抗氧化活性以及菌絲的生長(zhǎng)溫度進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在挑選的45 株誘變后菌株中，篩選得到6 株生長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，其與出發(fā)菌株均有一定的拮抗作用。其中，YY-1、YY-2、YY-3、YY-4 和YY-5菌株菌絲具有較好的遺傳穩(wěn)定性；YY-3、YY-4和YY-5 菌株菌絲體具有較高的生物量和多糖含量。YY-3菌株菌絲體多糖呈扁平狀，具有一般多糖的紅外光譜特征，且具有較好的ABTS自由基和羥自由基清除能力。YY-3 菌株菌絲的適宜生長(zhǎng)溫度為24 ℃。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)紫外誘變可以篩選得到生長(zhǎng)勢(shì)較好、多糖含量較高的羊肚菌菌株，篩選得到的YY-3、YY-4 和YY-5 突變株菌絲具有較好的生長(zhǎng)勢(shì)與多糖含量，這些突變株的出菇性能及其子實(shí)體中的多糖含量將有待于進(jìn)一步研究。