基于細胞自噬的中醫(yī)藥治療帕金森病的研究進展*

張敬雯 范仙靈 王楠 張子騰 楊一帆,2 賈妮,2 閆詠梅,2

(1陜西中醫(yī)藥大學,陜西 咸陽 712000;2陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一類以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病,截止目前全球PD患者的總?cè)藬?shù)已超過610萬[1],已成為世界第二常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變的疾病。越來越多的證據(jù)表明,細胞自噬受損可能在PD的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。自噬是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和清除受損細胞器的關鍵細胞過程,功能失調(diào)的自噬與異常蛋白質(zhì)聚集體的積累和線粒體質(zhì)量控制機制的損害有關,并可能導致神經(jīng)變性。中醫(yī)藥在包括PD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的治療上經(jīng)驗頗豐,臨床效果顯著,一系列研究均顯示中醫(yī)藥治療可能通過干預細胞自噬的過程從而抑制PD的產(chǎn)生及進程。因此,本文從中藥單體、中藥復方、針灸等中醫(yī)藥治療方法回顧目前對PD發(fā)病與自噬功能障礙的作用的科學認識,對中醫(yī)藥治療PD相關細胞自噬研究進行綜述,明確中醫(yī)藥調(diào)節(jié)自噬過程的機制,以期為PD患者提供新的治療途徑。

1 PD發(fā)病與細胞自噬

PD又名震顫麻痹,是一類以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性病變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)退行性疾病,主要發(fā)病機制為α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的異常聚集、氧化應激、線粒體功能障礙、重復激酶2(leucine rich repeat kinase 2,LRRK2)基因突變、神經(jīng)炎癥及腸道菌群的失調(diào)等導致多巴胺能神經(jīng)元變性[2],然而其具體發(fā)病機制仍未闡明。細胞自噬在PD的體內(nèi)和體外模型中均已被證實可防止神經(jīng)變性,為臨床治療PD提供了新的思路。

自噬是一種去除多余或有缺陷的細胞成分的降解過程,通過細胞內(nèi)或細胞外信號的整合啟動。在生長因子剝奪或營養(yǎng)不足的條件下,核心自噬蛋白和微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈 3 (LC3-Ⅰ)脂化形成膜結(jié)合的脂化形式(LC3-Ⅱ),吞噬膜擴張形成自噬體,待其完全成熟以后就會完全吞噬靶蛋白和細胞器并與溶酶體融合,其中蛋白酶降解內(nèi)部成分,然后釋放產(chǎn)生氨基酸和脂質(zhì),供細胞循環(huán)利用[3]。在哺乳動物細胞中,存在三種類型的自噬:巨自噬、伴侶蛋白介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和微自噬。巨自噬是自噬的主要類型,通過形成自噬體并與溶酶體融合促進降解發(fā)生;CMA是需要在特定分子伴侶如HSCP70等協(xié)助下完成的自噬過程;微自噬是經(jīng)溶酶體膜直接包裹入溶酶體內(nèi),經(jīng)過溶解酶水解后降解內(nèi)容物。一般而言,自噬指的就是巨自噬[4]。

蛋白質(zhì)聚集體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量積聚為 PD的病理特征,而α-syn是蛋白質(zhì)聚集體的主要成分。α-syn水平異常會損害吞噬體與溶酶體的融合,其過度表達會導致 SNAP29(介導自噬體-溶酶體融合的關鍵因素)水平降低,從而損害自噬體和溶酶體之間的整合,而SNAP29共表達能夠逆轉(zhuǎn)α-syn誘導的自噬周轉(zhuǎn),減少神經(jīng)元死亡[5]。PD中自噬途徑的失調(diào)表明受損的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)與LBs中α-syn和其他蛋白質(zhì)的積累之間存在聯(lián)系。自噬缺陷或通量阻斷不僅會導致PD基因編碼的蛋白質(zhì)的功能失調(diào),還會加劇α-syn和 tau聚集,形成雙向致病循環(huán)。α-syn與氧化應激、細胞自噬的調(diào)節(jié)均相關,過高的氧化應激水平會導致α-syn病理性擴散出現(xiàn)線粒體功能障礙,而自噬可以清除α-syn。而自噬異常也影響PD患者體內(nèi)氧化應激和線粒體功能。一項研究提供了PD患者大腦自噬、CMA和線粒體受損的證據(jù),即在PD患者黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元中觀察到自噬變性,并在超微結(jié)構(gòu)下顯示出線粒體被大量磷酸化 ERK 標記[3]。LRRK2基因突變是遺傳性PD患者的常見病因,但無論PD患者是否存在LRRK2突變,其腦內(nèi)均存在LRRK2過度激活[6]。當LRRK2蛋白的過度表達激活巨自噬,通過鈣相關途徑誘導自身吞噬體形成的持續(xù)增加,并增加了自噬受體p62的水平。在正常情況下,野生型LRRK2可被CMA降解,但致病性突變體以及高濃度的野生型LRRK2可通過抑制溶酶體膜上的易位復合物來阻斷CMA[7]。攜帶GBA1突變的PD患者自噬通量也會受到干擾,影響自噬體清除導致α-syn水平升高[8]。DJ-1蛋白通過調(diào)節(jié)氧化應激等方式調(diào)節(jié)線粒體功能,研究發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白可激活自噬過程來保護多巴能神經(jīng)元免受線粒體功能障礙和氧化應激的影響,若DJ-1功能喪失會直接影響細胞氧化還原狀態(tài)而影響自噬通量[9]。LRRK2、GBA1、DJ-1等基因突變會引起PD患者線粒體功能障礙和自噬異常,從而影響疾病進展。

當使用自噬化學誘導劑時[10-11],在PD的體內(nèi)和體外模型中均觀察到激活自噬可減輕神經(jīng)變性,所以自噬的上調(diào)被廣泛認為是一種有前途的治療策略。

2 細胞自噬的中醫(yī)機制

氣是人體構(gòu)成和生命維持的物質(zhì)基礎,若氣虛則氣血津液推動無力,機體各處無法得到精微物質(zhì)的滋養(yǎng)。此時,細胞可以通過自噬的方式溶解錯誤疊加的蛋白質(zhì)和破損的細菌器,以供應生命所需的精微物質(zhì),進而達到陰陽平衡。顏培正等[12-13]主張,人體各個系統(tǒng)間的信息傳輸依賴于氣,同時自噬通過激酶級聯(lián)信號傳導,展示出其所控制的生理功能,這兩者在生物學角度有相似之處。廣泛意義上的細胞自噬過程包含了許多氣體活動的元素,同時,這些氣體活動也可能會對其產(chǎn)生一定的影響。如果肺部主要負責調(diào)節(jié)氣的正常運行,那么當其出現(xiàn)氣虛時,就可能導致氣機的紊亂,進而干擾到自噬信號的傳遞和表達,最后有可能引發(fā)自噬的不平衡狀態(tài)。另外,脾臟和腎臟的功能異?；蛘唧w內(nèi)的痰濕過盛都有可能加劇肺氣虛現(xiàn)象。而肺氣虛、肺衛(wèi)功能受損以及自噬失衡等情況,都會給人類身體的防衛(wèi)能力帶來負面效應,使得人們更容易遭受外來病原體的入侵。

中醫(yī)學認為脾為后天之本,主運化,意為脾主導身體的代謝和轉(zhuǎn)化。若脾失健運,則其運化水谷精微之能力將逐漸減弱,導致臟腑機體無法獲得必要的滋養(yǎng)[14],脾虛日久,化生痰濁且無法及時清除。采用健脾祛痰療法可以激發(fā)細胞的自噬能力,清除體內(nèi)的有害細胞器和錯誤的折疊蛋白,進而將痰濁和其他病理代謝產(chǎn)物排出體外,調(diào)整身體的偏性并恢復其自我調(diào)控能力,從而實現(xiàn)陰陽平衡[15-16]。由此可見,通過調(diào)節(jié)細胞自噬能力恢復機體能量代謝正常和調(diào)節(jié)中醫(yī)脾胃運化功能從而恢復運化水谷精微之能力存在一定關聯(lián),故自噬缺失可以看作是脾胃功能衰退的微觀基礎。

人體是陰陽對立統(tǒng)一的整體,自噬水平失衡出現(xiàn)自噬不足或自噬過度的病理表現(xiàn),可以類比到中醫(yī)所說的陰陽失衡概念。近代中醫(yī)學者研究提出3種支持觀點:一是將細胞自噬這個病理生理現(xiàn)象看作是從微觀層面上反映出人體對陰陽平衡的調(diào)整;二是細胞自噬消除有害物質(zhì)并修正自身的方式被視為一個體現(xiàn)機體內(nèi)陰陽相互協(xié)調(diào)的微觀機制;三是引發(fā)細胞自噬性凋亡的過程可以理解為個體的陰陽失衡表現(xiàn)[17-18]。中醫(yī)注重陰陽平衡,若陰陽失衡,身體內(nèi)部可能出現(xiàn)機能失調(diào)的情況,自噬能夠清除胞內(nèi)廢物并保持平衡和穩(wěn)態(tài),有助于修正陰陽失衡,以糾正邪盛正衰的不平衡狀態(tài),實現(xiàn)機體自我調(diào)整。

3 中醫(yī)藥調(diào)控細胞自噬對PD的作用

PD 傳統(tǒng)治療方案以口服左旋多巴治療為主,但這僅能改善患者的運動癥狀,并不能延緩或阻止PD的病程進展,長期使用還會出現(xiàn)一系列不良反應及并發(fā)癥,影響患者的生活質(zhì)量。因此,尋求新的治療思路至關重要。根據(jù)PD的臨床具體表現(xiàn)可將歸納為中醫(yī)學“顫證”的類別,顫證病位多責之于肝、脾、腎三臟,其病理性質(zhì)當為本虛標實,多由患者年齡、思維情志等因素日久導致機體氣、血、津、液虧虛,筋脈失于濡養(yǎng),風氣內(nèi)動,或熱盛動風,擾亂筋脈而發(fā)為肢體顫動,故名“顫證”[19]。臨床治療PD多從臟腑入手,治其“本虛”而“標實”則愈,根據(jù)其證型的差異而采取不同的治法,以五臟氣血陰陽為核心,盡量調(diào)節(jié)全身使機體達到“陰平陽秘”,從而緩解PD的臨床癥狀[20]。當前不少臨床研究結(jié)果已顯示,常規(guī)治療結(jié)合中醫(yī)藥治療方法可顯著提高PD臨床療效,同時降低不良反應及副作用,常用的治療手段有中藥單體、復方、針刺等,有操作簡便、有效、耐受的優(yōu)點。

中醫(yī)藥能夠通過多重通路提高自噬蛋白表達,促進細胞自噬,減少細胞凋亡,防止由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性引起的神經(jīng)病變,改善PD患者臨床癥狀,多項現(xiàn)代研究結(jié)果均已表明,中醫(yī)藥治療PD的機制可能是通過調(diào)控細胞自噬手段來實現(xiàn)的,其中中藥單體、復方[21-22]和針灸療法[23]的研究最多,也較為透徹。

3.1中藥單體調(diào)控細胞自噬對PD的作用 研究顯示山奈酚能有效改善PD模型小鼠的運動及行為學障礙,保護小鼠多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)細胞器的完整性,維持自噬小體形態(tài),并通過調(diào)節(jié)mTOR通路中TH蛋白和Beclin-1、LC3等自噬蛋白表達,降低p62、cleaved Caspase-3凋亡相關蛋白表達,發(fā)揮對PD模型小鼠的保護作用[24]。厚樸酚(厚樸活性成分)能激活自噬上游AMPK/SIRT1通路,使得p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1上調(diào),逆轉(zhuǎn)Bcl-2/Bax比值,減少細胞凋亡,改善小鼠行為學障礙。同樣,石菖蒲揮發(fā)油亦能對AKT/mTOR通路起到抑制作用,產(chǎn)生和厚樸酚相似的神經(jīng)保護作用[25]。而姜黃素則是通過改善MPP+誘導SH-SY5Y的PD模型細胞存活率,抑制PI3K和下游Akt磷酸化,降低p-mTOR表達水平誘導自噬發(fā)生,清除α-syn從而增加多巴胺能神經(jīng)元存活數(shù),來保護PD細胞模型[26]。白藜蘆醇(虎杖的有效成分)可防止 SH-SY5Y 細胞中魚藤酮誘導的細胞凋亡,并通過自噬誘導增強表達 α-syn的 PC12 細胞系中 α-syn的降解,這種效應被 Beclin-1 敲低或溶酶體抑制所逆轉(zhuǎn),表明巨自噬對于白藜蘆醇誘導的 α-syn 清除至關重要[27]。此外,烏梅干預6-OHDA誘導的PD大鼠,其LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3蛋白上調(diào)且上調(diào)水平與劑量呈正相關,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶相比模型組活力明顯提高,提示烏梅通過調(diào)控線粒體自噬,發(fā)揮保護線粒體作用[28]。另外,在穿心蓮相關研究中發(fā)現(xiàn)其有效成分穿線蓮內(nèi)酯既可以通過抑制NLRP3炎性小體減輕神經(jīng)炎癥,又可以激發(fā)腦內(nèi)線粒體自噬,改善PD小鼠行為學功能[29]。牟蕾使用MPTP構(gòu)建斑馬魚PD模型,黃連素衍生物9-OH小檗堿可以改善其運動遲緩等行為,與下調(diào)lc3b、atg5等基因和α-syn蛋白表達有關[30]。

因此,中藥有效成分山奈酚、姜黃素、穿心蓮內(nèi)酯、白藜蘆醇、厚樸酚、石菖蒲揮發(fā)油等可以通過激活線粒體自噬,增加Beclin-1、LC3等自噬蛋白表達,抑制神經(jīng)炎癥而發(fā)揮保護多巴胺神經(jīng)元的作用。

3.2中藥復方調(diào)控細胞自噬對PD的作用 PD的發(fā)病機制尚不明確,臨床上PD患者證型不一,中藥單體神經(jīng)保護作用有限,而中藥復方遵循中醫(yī)藥辨證論治原則,療效顯著。隨著對細胞自噬與PD研究的不斷深入,越來越多研究人員開始從細胞自噬角度探索中醫(yī)藥對PD的治療機制。平肝益腎方可以促進細胞自噬,調(diào)節(jié)Beclin1、LC3B表達,抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷而保護神經(jīng)元[31]。止顫湯可通過p62蛋白改善注射lactacystin制備的PD大鼠癥狀[32]。李茜羽等[33]發(fā)現(xiàn)蓯蓉舒痙顆粒干預增加了自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達,激活SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白表達,使黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目增多,腦活性氧水平降低,改善PD大鼠各項行為學障礙。加味五虎追風散可通過TFEB,使得LC3Ⅱ、P62表達量降低,緩解α-syn聚集[34]。菖蒲郁金湯能通過上調(diào)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值,減少α-syn蛋白表達,促進神經(jīng)元細胞的自噬活性,并明顯增加小鼠黑質(zhì)TH陽性細胞表達,從而起到對PD小鼠的神經(jīng)保護作用[35]。韋一佛等[36]用滋腎益髓方干預PD小鼠模型,結(jié)果顯示,中藥組小鼠Cath D、HSP70蛋白上調(diào),與模型組相比有統(tǒng)計學意義,說明用藥后增強了CMA而治療PD。彭偉等[37]將50只大鼠分為假手術(shù)組、PD模型組、西藥組、天麻鉤藤飲高、低劑量組,研究顯示給藥8 w后大鼠黑質(zhì)部Beclin1、LC3B表達強度明顯增強,α-syn減少,模型大鼠的神經(jīng)損傷癥狀減輕。高鑫等[38]采用MPP+刺激SH-SY5Y細胞制備PD模型,分為對照組、模型組、拜顫停復方組、自噬抑制劑3-MA組,研究結(jié)果顯示拜顫停復方不僅可以降低Bax、Caspase等凋亡蛋白表達繼而改善細胞凋亡,同時上調(diào)Bcl-2、LC3B、Beclin蛋白促進自噬,在給予3-MA后,上述改變被逆轉(zhuǎn),說明拜顫停復方通過促進神經(jīng)元自噬,干預了自噬與凋亡平衡,反饋性抑制凋亡,從而實現(xiàn)神經(jīng)保護的作用,進而治療PD。經(jīng)方斂肝熄風止顫方,能夠抑制過度激活的CaMkkβ、p-AMPK蛋白,使得細胞不因過度自噬而破壞線粒體結(jié)構(gòu),其止顫效果隨劑量上升而增強,表明其對PD具有神經(jīng)保護作用[39]。龜羚帕安丸對6-OHDA誘導的PD大鼠模型有保護作用,表現(xiàn)為大鼠黑質(zhì)部神經(jīng)元損傷減少,Beclin1、P62、LC3Ⅱ蛋白表達較模型組明顯上升[40]。

故而,中藥復方能從調(diào)節(jié)自噬與凋亡間平衡、降低細胞凋亡、避免細胞過度自噬等多種角度達到改善震顫癥狀、減輕神經(jīng)損傷的效果。

3.3針刺療法調(diào)控細胞自噬對PD的作用 早在1996年,中國就率先開展了針刺治療PD的動物實驗研究,先前的研究顯示針灸治療在改善PD患者認知功能和生活質(zhì)量方面有一定優(yōu)勢,同時降低了藥物不良反應發(fā)生率。針刺干預PD的作用機制主要體現(xiàn)在增加腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子、減少腦內(nèi)異常代謝產(chǎn)物、增強自噬、減少α-syn聚集、抑制神經(jīng)細胞凋亡、抑制氧化應激、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、調(diào)節(jié)腸道菌群及減輕神經(jīng)炎癥反應等方面。吳海洋等[41]采用通督調(diào)神針刺法提高線粒體自噬水平和紋狀體中多巴胺含量,改善神經(jīng)元形態(tài),從而保護PD模型小鼠神經(jīng)損傷。符之逸[42]電針針刺“百會、太沖”穴位治療MPTP誘導的PD小鼠發(fā)現(xiàn),電針后可上調(diào)Agt7、p62、LC3等自噬蛋白,減弱MPTP對小鼠的神經(jīng)損傷,進一步減少α-syn的表達,改善PD模型小鼠運動功能障礙。羅宇雄等[43]對魚藤酮誘導大鼠的百會、腎俞、太溪穴位每周進行1次埋線處理,5周后行為學數(shù)據(jù)顯示實驗組移動潛伏期縮短并有統(tǒng)計學意義,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示LC3 B-Ⅱ/LC3 B-Ⅰ蛋白上調(diào),p63蛋白下調(diào)并可改善細胞凋亡,降低α-syn表達,改善了PD癥狀。馬駿等[44]利用魚藤酮制備PD模型,將60只大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、電針組,實驗結(jié)果表明,電針 “太沖、風府”穴后,模型大鼠CMA相關Lamp2A蛋白和Hsc70蛋白表達水平上升,α-syn聚集被抑制,大鼠PD樣癥狀得到改善。

以上實驗證據(jù)表明,針刺“太沖”“百會”“腎俞”“太溪”等穴位能抑制α-syn聚集,增加自噬相關蛋白表達,實現(xiàn)改善運動功能障礙的目的。

4 小結(jié)

PD困擾人群眾多,而發(fā)病病因及機制不明為臨床治療帶來極大挑戰(zhàn),需要創(chuàng)新和整體的治療方法。近年來隨著中醫(yī)學者對PD的認識逐步加深,中醫(yī)藥治療已被越來越多地運用于此類疾病的臨床治療中,且臨床研究顯示中醫(yī)藥治療PD對改善其臨床癥狀具有顯著療效。細胞自噬是 PD 發(fā)病機制中的一個關鍵過程,目前各項研究顯示,不論是中藥單體、中藥復方或針刺等各類中醫(yī)藥療法應用越來越廣泛,利用中醫(yī)的獨特視角,多種傳統(tǒng)療法相結(jié)合以及個體化治療方法,通過細胞自噬干預,在溶酶體消化降解過程中清除受損細胞器和錯誤折疊蛋白質(zhì)等來達到物質(zhì)代謝所需,從而使細胞本身達到內(nèi)穩(wěn)態(tài),細胞器不斷更新,有望增強自噬清除率并改善PD的臨床結(jié)果。自噬在PD中作用復雜,涉及氧化應激、神經(jīng)炎癥、細胞凋亡等多個方面,但目前研究較少,不論是中藥單體、中藥復方或針刺研究仍是以基礎研究為主,尤其是中藥單體多為體外或動物實驗,無法運用于臨床,因此更應著眼于中藥復方的深入研究,對復方進行拆分或調(diào)整,進行標準化隨機對照試驗,深挖相關信號傳導、作用靶點等機制研究,將基礎實驗與臨床研究結(jié)合起來,為中醫(yī)藥治療PD提供更多高質(zhì)量的理論支撐和循證醫(yī)學證據(jù)。未來可著眼于此進一步完善中醫(yī)藥基于細胞自噬的研究,包括嚴格的科學研究和大規(guī)模、多中心的臨床試驗,為PD患者的循證中醫(yī)干預鋪平道路。