基于微囊化技術(shù)的益生菌功能性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展

楊動(dòng)聽，黃 莎，楊 選，王曄洋，李偉榮

（麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院 浙江麗水 323000）

“益生菌”一詞源于拉丁語“pro”和希臘語“biotikos”，被世衛(wèi)組織定義為“足量施用時(shí)會(huì)賦予宿主健康益處的活體微生物”[1]。適量攝入益生菌可以預(yù)防或輔助治療疾病，益生效果則因菌株種類而異，因此在投入商業(yè)應(yīng)用時(shí)，通常需要經(jīng)過屬種水平、菌株水平的鑒定，臨床使用安全性評(píng)估、腸道環(huán)境適應(yīng)性評(píng)價(jià)、產(chǎn)品有效成分檢測等步驟。為了產(chǎn)生足夠的生物效應(yīng)，臨床上通常規(guī)定人類每天需服用約108～1010CFU 的益生菌才能達(dá)到理想的益生效果[2]。隨著近年來食品加工技術(shù)的發(fā)展，保持益生菌菌株活力的策略也從單純?cè)黾赢a(chǎn)品中益生菌活菌的絕對(duì)數(shù)量向提升益生菌存活率，即益生菌微囊化的方向研究和發(fā)展。

最早的益生菌產(chǎn)品通常以活體或凍干狀態(tài)施用。然而，這類狀態(tài)的菌株在胃腸道環(huán)境下的存活率（在包括胃腸道酸性、堿性和膽鹽的環(huán)境中存活細(xì)菌的百分比）通常較低[3-5]。不同種類的益生菌對(duì)人體胃腸道環(huán)境的耐受性不同，較早的研究顯示到達(dá)盲腸的游離雙歧桿菌存活率可達(dá)到30%，而游離嗜酸乳桿菌的存活率僅有10%[6]。第1 代益生菌產(chǎn)品的保質(zhì)期也很有限，通常在發(fā)酵乳制品中的益生菌維持人體攝入所需的有效活菌數(shù)時(shí)間僅有2～3 周[7-9]。

由于上述的弊端，搭載微囊化技術(shù)的新一代益生菌產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。將聚合物材料包埋益生菌制備成單層或多層外殼封裝的微膠囊產(chǎn)品，或?qū)⒁嫔旌显陬愃乒羌軜?gòu)造的聚合物基質(zhì)中，制備成內(nèi)外布局均勻的微球產(chǎn)品[10]，這些產(chǎn)品通過合適的加工技術(shù)來提高益生菌胃腸道存活率[11]，提升生物利用度[12]，減少細(xì)菌原料浪費(fèi)[13]和調(diào)節(jié)釋放速度[14]。學(xué)者們通常使用具有物理屏障功能的多糖和具有化學(xué)屏障功能的蛋白質(zhì)充當(dāng)微膠囊或微球的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，采用二價(jià)陽離子結(jié)合海藻酸鹽、黃原膠、卡拉膠、阿拉伯膠、結(jié)冷膠、果膠、乳蛋白、豆類蛋白等多種材料組合形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使用殼聚糖、聚賴氨酸、乳清蛋白等材料構(gòu)建外部涂層達(dá)到改性和強(qiáng)化產(chǎn)品綜合性能的目的[15-17]。初步設(shè)計(jì)生產(chǎn)出產(chǎn)品后，學(xué)者們便會(huì)開始使用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)來評(píng)估微囊化益生菌產(chǎn)品的功能特性。本文介紹近年來微囊化益生菌的體內(nèi)外功能性試驗(yàn)研究進(jìn)展，以指導(dǎo)微囊化益生菌產(chǎn)品的開發(fā)評(píng)估。

1 體外試驗(yàn)

1.1 存活

當(dāng)學(xué)者們?nèi)斯ぴO(shè)計(jì)配方和使用不同加工技術(shù)制備出微囊化益生菌產(chǎn)品后，亟待測定的就是微膠囊或微球產(chǎn)品對(duì)益生菌的實(shí)際保護(hù)效果。通常采用特定的方法對(duì)微囊化益生菌的存活率進(jìn)行測定，來判斷配方中不同的添加劑和微囊化材料在特定環(huán)境下的功能性。試驗(yàn)基于不同評(píng)價(jià)目標(biāo)來設(shè)計(jì)并檢測微囊化益生菌產(chǎn)品，在諸如不同干燥工藝、熱處理、食品儲(chǔ)存基質(zhì)種類、氧化壓力、炎癥壓力、模擬胃腸道消化等特定條件下產(chǎn)品的穩(wěn)定性。設(shè)計(jì)優(yōu)良的微囊化配方可以獲得較為理想的益生菌保護(hù)效果。例如，使用海藻酸鈉、阿布扎比單峰駱駝奶提取的酪蛋白和駱駝皮提取的明膠共同制備的異質(zhì)蛋白偶聯(lián)型微膠囊，可以使益生菌對(duì)體外模擬胃腸消化和熱應(yīng)激的耐受性顯著強(qiáng)于單種材料制備的微囊化產(chǎn)品，并且相對(duì)裸菌而言，可進(jìn)一步提高鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌和副干酪乳桿菌的封裝率[18]。有學(xué)者通過濕熱法和噴霧干燥法將乳清蛋白分離物和低聚木糖反應(yīng)產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，作為性能強(qiáng)化壁材來制備微囊化鼠李糖乳桿菌產(chǎn)品，該產(chǎn)品能在模擬胃腸道消化試驗(yàn)中維持益生菌較高的存活率，并在模擬腸液階段釋放更多的益生菌，以達(dá)到緩釋的效果[19]。另有學(xué)者采用噴霧干燥、冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或折射窗干燥等封裝工藝將低聚果糖、乳清蛋白、麥芽糖糊精和植物乳桿菌NCIM 2083 制備成合生元復(fù)合粉末，封裝后的合生元產(chǎn)品使用3D 打印技術(shù)并采用冷凍干燥、折射窗干燥、熱風(fēng)干燥或微波干燥等后處理工藝生產(chǎn)微囊化益生菌產(chǎn)品，該產(chǎn)品在體外模擬口腔-胃腸液中的存活率測定結(jié)果顯示，使用噴霧冷凍干燥作為封裝工藝和冷凍干燥作為后處理工藝的組合是維持益生菌活力的最佳工藝方法[20]。蔗糖作為凍干保護(hù)劑與海藻酸鈉-殼聚糖混合并使用凍干工藝制備的嗜酸乳桿菌KBL409 微球產(chǎn)品能顯著提升產(chǎn)品在模擬口腔-胃腸液中的益生菌存活率，其效果優(yōu)于葡萄糖、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖糊精、菊粉或玉米淀粉[21]。對(duì)于限定在高溫噴霧干燥工藝條件下生產(chǎn)微囊化酪丁酸梭菌的情況，學(xué)者們使用了4%明膠、5%變性淀粉和5%麥芽糊精質(zhì)量濃度的組合作為微囊壁材可以顯著提升微囊化益生菌在模擬胃液中的存活率[22]。在外界高糖環(huán)境的滲透脅迫條件下，以海藻酸鹽-葡萄糖為核心，殼聚糖充當(dāng)涂層制備的微膠囊能顯著減弱植物乳桿菌活菌數(shù)的下降，為特殊食品基質(zhì)中搭載的微囊化益生菌提供良好的保護(hù)[23]。以葡聚糖-海藻酸鹽為核心，殼聚糖充當(dāng)涂膜制備的益生菌微膠囊能提升益生菌在模擬胃腸液中的存活率，相比于裸菌能顯著緩解十二烷基硫酸鈉作為促炎劑處理人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 后誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥應(yīng)激，促使益生菌和葡聚糖協(xié)同調(diào)節(jié)HT-29 細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10、腫瘤壞死因子-α 并提升HT-29 細(xì)胞活力[24]。在益生菌與印度傳統(tǒng)食品Laddu結(jié)合生產(chǎn)益生菌甜品的工藝研究中，相比于凍干狀態(tài)的嗜酸乳桿菌，添加阿拉伯樹膠-蔗糖制備的微囊化益生菌能提升益生菌的存活率并使產(chǎn)品有更強(qiáng)的抗氧化能力[25]。

1.2 釋放

早一代益生菌微囊化工藝存在一定的局限性，而動(dòng)物機(jī)體胃腸道具有排空速度快的生理特性，兩者結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致益生菌在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)到達(dá)預(yù)定位置后迅速釋放，致使益生菌在腸道內(nèi)停留、發(fā)揮功能的時(shí)間較短并使益生效果不理想[26]，因此許多學(xué)者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了益生菌的緩釋控制和靶向遞送。例如，使用明膠和阿拉伯樹膠作為壁材，將瓜拉那提取物與益生菌共同封裝所生產(chǎn)的微囊化益生菌產(chǎn)品，在體外模擬胃腸道釋放試驗(yàn)中被證明可以有效延遲益生菌的釋放，其可能源于瓜拉那提取物的生物化學(xué)物質(zhì)與構(gòu)成凝聚層的聚合物相互作用并強(qiáng)化了微囊結(jié)構(gòu)[27]。耐酸型乳清蛋白分離物、氯化鈣和吐溫-80 包埋植物乳桿菌生產(chǎn)的微囊化益生菌產(chǎn)品，在體外模擬胃部環(huán)境中孵育8 h 仍無法釋放微囊化益生菌，而能在模擬回腸環(huán)境中2 h 內(nèi)完全釋放益生菌，達(dá)到靶向釋放的效果[28]?；谝旱挝⒘黧w技術(shù)將聚-γ-谷氨酸水凝膠封裝益生菌所制成的微球產(chǎn)品能耐受人工模擬胃腸液，并能在405 nm 可見光照射硝普鈉所產(chǎn)生的一氧化氮模擬腸炎環(huán)境中，表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)塌陷、分裂并迅速釋放益生菌，達(dá)到產(chǎn)品在炎癥部位靶向遞送的目的，其原理是一氧化氮（NO）通過自氧化作用轉(zhuǎn)化為三氧化二氮（N2O3）后與配方中交聯(lián)劑N，N'-（2-氨基-1，4-亞苯基）二乙酰胺的鄰苯二胺結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆反應(yīng)，導(dǎo)致水凝膠網(wǎng)絡(luò)解離[29]。將石松花粉去除原生質(zhì)體后壓片制備的孢粉素外膜微膠囊，可以在模擬人體胃腸道環(huán)境中保護(hù)干酪乳桿菌，使益生菌在微囊內(nèi)部大量繁殖（12±2）h 后機(jī)械破壞微膠囊的外壁結(jié)構(gòu)并迅速釋放，從而達(dá)到益生菌在結(jié)腸區(qū)域靶向遞送的目的[30]。

1.3 黏附

在微囊化益生菌體內(nèi)釋放后，希望益生菌能在胃腸道中停留盡可能長的時(shí)間甚至能實(shí)現(xiàn)黏附、定植和長期生活的效果。許多學(xué)者對(duì)此展開微囊化益生菌黏附的體外相關(guān)研究。例如，使用電噴霧技術(shù)制備的抗性淀粉強(qiáng)化壁材和殼聚糖包被的海藻酸鹽益生菌微粒，能在體外模擬的熒光法流動(dòng)沖洗黏膜黏附試驗(yàn)中，達(dá)到較好的黏膜黏附特性，并使產(chǎn)品在黏膜上的停留時(shí)間延長[31]。采用離子凝膠技術(shù)制備的低甲氧基果膠-羧甲基纖維素鈉鼠李糖乳桿菌GG 微珠，在體外山羊結(jié)腸組織模擬黏膜黏附試驗(yàn)中，具有較高的黏膜黏附強(qiáng)度，其源于該pH 條件下，羧甲基纖維素鈉的羥基、低甲氧基果膠的羧基可以與組織的粘蛋白層形成氫鍵，延長了產(chǎn)品在吸收部位的停留時(shí)間，加強(qiáng)了產(chǎn)品與上皮屏障的接觸[32]。蘆薈粘液、高度聚合的龍舌蘭果聚糖和阿拉伯膠包裹的植物乳桿菌微膠囊，可以形成具有氫鍵結(jié)構(gòu)的弱凝膠并與腸黏附蛋白相互作用，提升產(chǎn)品在豬黏蛋白模擬腸道黏膜系統(tǒng)中的黏附性能[33]。燕麥麩膠、乳清蛋白和海藻酸鈉共同封裝的益生菌酵母VIT-MN03 微膠囊，可在體外新鮮豬小腸組織的模擬黏膜黏附試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附性能[34]。

1.4 抗菌

由于活的益生菌具有不斷生長繁殖、競爭抑制和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等功能特性，學(xué)者們期盼通過封裝活的益生菌并保持較高的生存率，以達(dá)到在動(dòng)物機(jī)體或食品中抑制病原體的作用，由此許多體外試驗(yàn)得以開展。例如，聚乙烯吡咯烷酮-透明質(zhì)酸-麥芽糊精-乳清蛋白的四重包衣微膠囊被證明可在Caco-2 細(xì)胞系培養(yǎng)過程中，強(qiáng)化益生菌對(duì)常見食源性病原體鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用，其源于四重包衣微囊強(qiáng)化了益生菌的黏膜黏附能力，并競爭性抑制了病原體的黏附行為[35]。使用海藻酸鈉-殼聚糖封裝的尼氏大腸桿菌益生菌納米微囊能在體外顯著抑制高度侵襲性的食源性病原體空腸彎曲桿菌生長繁殖，因此可將益生菌產(chǎn)品提前添加進(jìn)食品或飼料中，預(yù)防高危人群和畜禽的感染，并提高公共衛(wèi)生質(zhì)量和食品安全水平[36]。海藻酸鹽-殼聚糖微膠囊封裝的鼠李糖乳桿菌GG微膠囊可以在體外共培養(yǎng)階段影響大腸桿菌lsrK和luxS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和群體感應(yīng)系統(tǒng)，從而顯著抑制大腸桿菌生物膜的形成，可應(yīng)用于控制耐藥性細(xì)菌生物膜形成從而達(dá)到抑菌效果[37]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)妥布霉素敏感型的復(fù)合乳酸桿菌益生菌商業(yè)產(chǎn)品，可以在靜電噴涂海藻酸鹽-水凝膠封裝的微膠囊保護(hù)下，與妥布霉素協(xié)同殺死耐甲氧西林的致病性金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，有利于臨床上治療復(fù)雜感染和緩解抗生素耐藥性問題[38]。另有海藻酸鹽-水凝膠封裝的短雙歧桿菌能夠與四環(huán)素產(chǎn)生協(xié)同作用，保持Caco-2 細(xì)胞層的表面屏障完整性，并有效殺死黏附在Caco-2 細(xì)胞層上的耐四環(huán)素致病性大腸桿菌，相比之下，未封裝的短雙歧桿菌、已封裝的雙歧桿菌或單獨(dú)的四環(huán)素均不能獨(dú)立殺滅耐四環(huán)素致病性大腸桿菌[39]。

2 體內(nèi)試驗(yàn)

目前許多評(píng)價(jià)微囊化益生菌產(chǎn)品功能特性的方法都基于體外試驗(yàn)[29，40-41]，雖然體外模擬消化模型有助于低成本、快速地篩選出許多不同的微囊化材料配方，但體外模型通常不能準(zhǔn)確模擬動(dòng)物機(jī)體胃腸道中包括氣體成分、動(dòng)態(tài)pH、酶解壓力、土著微生物競爭等復(fù)雜的特殊環(huán)境。部分學(xué)者指出益生菌試驗(yàn)的體內(nèi)研究與體外研究的相關(guān)性可能較差[11]。例如，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)使用牛奶蛋白制備的微膠囊在體外試驗(yàn)中顯示出了良好的益生菌保護(hù)特性，然而在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中相比于裸菌而言保護(hù)特性并未提升[42]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)由豌豆分離蛋白和海藻酸鹽制備的鼠李糖乳桿菌R0011 和瑞士乳桿菌R0052 微膠囊被證明會(huì)在檸檬酸桿菌誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，通過改變結(jié)腸黏膜的微生物群落和細(xì)胞蛋白表達(dá)，從而加重小鼠的炎癥癥狀，并促進(jìn)腸道疾病發(fā)展，而豌豆分離蛋白和海藻酸鹽通常被認(rèn)為是較為安全的食品成分[43]?；谏鲜霾糠煮w內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果不符合預(yù)期的報(bào)道，在開展微囊化益生菌體外試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確實(shí)有必要進(jìn)一步開展體內(nèi)試驗(yàn)，驗(yàn)證微囊化益生菌產(chǎn)品在動(dòng)物機(jī)體上施用的具體性能和功效。

目前很多研究顯示，益生菌攝入體內(nèi)后可以調(diào)節(jié)宿主的健康，其機(jī)理多種多樣[44]，包括：部分益生菌可以直接產(chǎn)生具有生物活性的后生元進(jìn)入宿主體內(nèi)循環(huán)參與生理代謝，例如：γ-氨基丁酸[45-47]、短鏈脂肪酸[48-50]和其它細(xì)菌代謝產(chǎn)物[51-53]；部分益生菌可以調(diào)節(jié)宿主腸道微生物區(qū)系，通過影響其它腸道菌群進(jìn)而引起宿主腸道中諸如支鏈脂肪酸[54]、支鏈氨基酸[55]、芳香族氨基酸[56]、氧化三甲胺[57]、甲烷[58]、硫化氫[59]等可能與宿主代謝綜合征發(fā)展相關(guān)的小分子物質(zhì)的變化，以此間接調(diào)控宿主健康[60]；部分益生菌可以與宿主的膽汁酸代謝系統(tǒng)[61]或腸道屏障系統(tǒng)[62]產(chǎn)生互作。許多報(bào)道都證明適當(dāng)?shù)奈⒛一幚砜蓮?qiáng)化益生菌對(duì)宿主腹瀉、感染、炎癥、代謝綜合征的調(diào)控能力。

2.1 存活、黏附與定植

許多學(xué)者證明了益生菌使用不同的微囊化工藝處理，可強(qiáng)化益生菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體的益生效果，其源于益生菌在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)胃腸道中生存率的提高，益生菌在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)停留的時(shí)間延長，甚至促使益生菌黏附和定植在胃腸道黏膜上，以長期發(fā)揮作用。例如，以醋酸誘導(dǎo)冷凝乳-植物油-碳酸鈣體系中κ-酪蛋白和鈣離子交聯(lián)為原理制備的植物乳桿菌LIP-1 微囊化益生菌產(chǎn)品，相比于裸菌能顯著增加益生菌在高脂血癥大鼠結(jié)腸中的存活率，并進(jìn)一步促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1 在大鼠體內(nèi)的降膽固醇效果[63]。采用海藻酸寡糖-殼寡糖制備的合生元微膠囊長雙歧桿菌CICC 6259 被證明在動(dòng)物體內(nèi)的生存率顯著優(yōu)于裸菌，并在遞送小鼠后2 周使體內(nèi)益生菌數(shù)維持較高水平[64]。聚-L-賴氨酸封裝的植物乳桿菌KCTC 3108 能順利通過ICR 小鼠胃腸道段并從糞便中分離培養(yǎng)，而采用裸菌遞送時(shí)糞便中無法成功分離和培養(yǎng)益生菌[65]。

在胃腸道消化液中存活后，活的益生菌能在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的第二個(gè)關(guān)鍵因素是能否成功黏附，甚至定植到胃腸道上皮細(xì)胞表面。學(xué)者們通過基因組測序闡明了益生菌黏附介質(zhì)的實(shí)質(zhì)是鞭毛、菌毛、分泌蛋白、細(xì)胞壁相關(guān)多糖（CPS）、脂磷壁酸（LTA）、脂多糖（LPS）和肽聚糖（PG），這些重要的表面分子能被宿主模式識(shí)別受體識(shí)別，并附著于腸上皮細(xì)胞交界區(qū)域[66]。體外研究中通常使用Caco-2 人腸上皮細(xì)胞系進(jìn)行初步的益生菌黏附研究[67]，而在條件允許的情況下，開展微囊化益生菌動(dòng)物體內(nèi)黏附定植研究會(huì)得到證據(jù)等級(jí)更高的結(jié)果。有學(xué)者將自發(fā)熒光轉(zhuǎn)基因益生菌乳酸乳球菌NZ9000 封裝進(jìn)硫醇化氧化魔芋葡甘聚糖微球中，能延長小鼠糞便中持續(xù)檢出益生菌的時(shí)間，學(xué)者們由此間接推斷出該微囊化工藝增強(qiáng)了益生菌在動(dòng)物體內(nèi)的黏附能力[68]。另有學(xué)者將海藻酸鹽和魚精蛋白通過靜電液滴結(jié)合逐層自組裝技術(shù)制備了具有逐層分解特性的酶促熔絲狀微膠囊，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到經(jīng)過特殊質(zhì)粒修飾的大腸桿菌MG1655 在雙層微膠囊保護(hù)下，停留于小鼠腸道中的時(shí)間顯著延長[69]。使用干粉包衣技術(shù)制備的醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素膠囊化商業(yè)嗜酸乳桿菌，在遞送給大鼠8 h 內(nèi)，可顯著提高大鼠腸段中的益生菌活菌數(shù)[70]。采用多層靜電紡絲結(jié)構(gòu)封裝的鼠李糖乳桿菌GG 微囊化益生菌遞送給小鼠72 h 后，可以顯著提高益生菌在空腸中的相對(duì)豐度，其效果優(yōu)于遞送裸菌[71]。

2.2 抗腹瀉

益生菌在動(dòng)物養(yǎng)殖及臨床領(lǐng)域被長期、廣泛應(yīng)用于腹瀉治療，而微囊化益生菌對(duì)腹瀉的改善效果進(jìn)一步加強(qiáng)。例如，海藻酸鹽和殼聚糖封裝的微囊化植物乳桿菌22F、25F 和乳酸片球菌72N菌株均可調(diào)節(jié)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌誘導(dǎo)的水樣腹瀉斷奶仔豬模型釋放血清促炎和抗炎細(xì)胞因子，通過增強(qiáng)與緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)來幫助上皮細(xì)胞保持其完整性以減輕腸道病理學(xué)損傷，改善斷奶仔豬的嚴(yán)重水樣腹瀉癥狀[72]。由低甲氧基果膠和羧甲基纖維素鈉封裝、醋酸鄰苯二甲酸纖維素涂層的微囊化鼠李糖乳桿菌GG 可以通過提高益生菌在上消化道中的存活率，促進(jìn)產(chǎn)品在結(jié)腸中的迅速釋放，從而快速改善阿莫西林誘導(dǎo)的白化Wistar 大鼠抗生素相關(guān)性腹瀉，其止瀉療效的生效時(shí)間顯著短于裸菌[73]。在無菌豬體內(nèi)接種人類嬰兒糞便微生物群構(gòu)建營養(yǎng)不良仔豬模型后，學(xué)者們使用葡聚糖制備的大腸桿菌Nissle 1917 生物膜微球益生菌產(chǎn)品遞送給該模型豬可以顯著改善人類輪狀病毒誘導(dǎo)的仔豬腹瀉并降低糞便輪狀病毒排出，削弱病毒傳播性，其源于大腸桿菌Nissle 1917 生物膜微球增強(qiáng)了仔豬的先天免疫反應(yīng)和B 細(xì)胞免疫反應(yīng)[74]。

2.3 抗菌

微囊化工藝會(huì)進(jìn)一步提升益生菌在動(dòng)物胃腸道中的生存率，增強(qiáng)益生菌對(duì)病原體的抑制作用，達(dá)到抗菌和改善宿主健康的效果。有學(xué)者指出使用微囊化益生菌應(yīng)用于感染的輔助治療，能一定程度緩解由于抗生素濫用造成的病原體微生物耐藥性問題[75]。例如，使用靜電紡絲納米纖維封裝益生菌蒙氏腸球菌制備的微囊化生物支架，能吸收人工模擬的燙傷傷口液體后形成水凝膠結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步提升傷口表面的益生菌存活率和存活時(shí)間，幫助二級(jí)燒傷的成年小鼠顯著抑制金黃色葡萄球菌ATCC 25923 對(duì)燒傷傷口的感染，并加快傷口恢復(fù)速度，由于益生菌的抗菌能力，其單位時(shí)間的愈合效果甚至優(yōu)于磺胺嘧啶銀乳膏藥品[76]。海藻酸鈉-淀粉封裝的戊糖片球菌Li05 微膠囊相比于裸菌能進(jìn)一步提升SPF 小鼠腸道微生物多樣性，下調(diào)NF-κB 磷酸化誘導(dǎo)的pro-IL-1β 基因和腫瘤壞死因子-α 的表達(dá)，顯著強(qiáng)化小鼠抗艱難梭狀芽胞桿菌感染的能力，并提升試驗(yàn)期小鼠的存活率[77]。有學(xué)者使用商業(yè)化益生菌糞腸球菌NCIMB 11181 微膠囊產(chǎn)品預(yù)先持續(xù)性飼喂肉雞，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品可以上調(diào)肉雞空腸黏膜中的CLDN-1 mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)，在后續(xù)試驗(yàn)期間顯著削弱由產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的肉雞腸道損傷、腸細(xì)胞凋亡并有效改善肉雞健康[78]。另有微囊化益生菌糞腸球菌產(chǎn)品通過維持有益的盲腸微生物群，來降低盲腸大腸桿菌的相對(duì)豐度，增強(qiáng)宿主血清免疫和抗氧化能力，從而降低產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的不良影響[79]。

2.4 抗炎和抗氧化

炎癥是動(dòng)物機(jī)體受到有害刺激時(shí)所產(chǎn)生的一系列復(fù)雜生物反應(yīng)，通常會(huì)伴隨發(fā)熱、疼痛、紅腫、功能性喪失并給機(jī)體帶來一定的痛苦。目前研究顯示微囊化益生菌產(chǎn)品對(duì)機(jī)體的某些慢性和急性炎癥反應(yīng)均有改善作用。例如，口服海藻酸鈉封裝的黏膜乳桿菌 KM068788 和發(fā)酵乳桿菌KM068787 微膠囊，被證明可以通過增強(qiáng)大鼠體內(nèi)抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10 的表達(dá)，來有效緩解角叉菜膠誘導(dǎo)的Wistar 雄性大鼠后爪急性炎癥性水腫，且效果優(yōu)于裸菌[80]。一項(xiàng)基于人類的隨機(jī)雙盲安慰劑試驗(yàn)證明微囊化植物乳桿菌IS-10506能在8 周的干預(yù)期內(nèi)，顯著緩解成年人的特征性皮炎，其源于微囊化益生菌抑制了受試者Th1 型免疫應(yīng)答，并增強(qiáng)了Th2 型免疫應(yīng)答[81]。由海藻酸鈉和殼聚糖混合制備的納米級(jí)微囊化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)品有較強(qiáng)的體內(nèi)穩(wěn)定性，相比于裸菌能進(jìn)一步降低硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎成年Wistar 大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物丙二醛、結(jié)腸液中促炎氧化損傷物一氧化氮和糞便中的腸道炎癥生物標(biāo)志物運(yùn)載蛋白-2 的水平，從而改善大鼠結(jié)腸炎癥、體質(zhì)量驟降和脾臟腫大的癥狀，顯著提升大鼠實(shí)驗(yàn)期的生存率[82]。采用羥丙基甲基纖維素和海藻糖制備的鼠李糖乳桿菌HDB1258 微膠囊遞送給脂多糖誘導(dǎo)的C57BL/6 炎癥小鼠模型后，可改變小鼠的腸道微生物區(qū)系，提升體內(nèi)白細(xì)胞介素-10 的表達(dá)，調(diào)整腫瘤壞死因子-α 的表達(dá)比例，并增強(qiáng)脾臟巨噬細(xì)胞吞噬作用和脾臟自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞活性來抑制動(dòng)物機(jī)體的全身炎癥[83]。另有學(xué)者通過逐層微囊化技術(shù)對(duì)唾液乳酸桿菌Li01 進(jìn)行封裝，并遞送給硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎SD 無菌大鼠模型，該產(chǎn)品可以促進(jìn)腸道微生物菌群和腸道屏障功能的修復(fù)[84]?；谝旱挝⒘黧w技術(shù)的聚-γ-谷氨酸水凝膠益生菌微球能在炎癥部位靶向遞送益生菌，以減輕小鼠全身炎癥，顯著保護(hù)結(jié)腸炎小鼠的小腸和結(jié)腸的機(jī)械屏障穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)腸道微生物區(qū)系，并上調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖生物標(biāo)志物Ki67 的表達(dá)[29]。

2.5 調(diào)控代謝綜合征

代謝綜合征是包括腹型肥胖、高血壓、高血糖、高血清甘油三酯或低血清高密度脂蛋白膽固醇在內(nèi)的一組同時(shí)發(fā)生的、在動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)代謝紊亂的癥候群，并且在現(xiàn)代社會(huì)人群中越來越常見[85]。目前越來越多的研究證明微囊化益生菌可以調(diào)控動(dòng)物機(jī)體的代謝綜合征并改善機(jī)體健康。例如，學(xué)者們?cè)O(shè)計(jì)了以陰陽二元概念為靈感的雙核海藻酸鹽微膠囊，通過靜電驅(qū)動(dòng)微流體技術(shù)封裝乳酸菌21790 和枯草芽孢桿菌10012，避免了兩種益生菌的相互干擾，相比于兩種益生菌在微囊內(nèi)直接混合的單核微膠囊，益生菌互相隔離的雙核微膠囊能進(jìn)一步改善小鼠腸道屏障功能并緩解腸道炎癥[86]。另有學(xué)者使用海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸封裝鼠李糖乳桿菌NCIMB 6375、植物乳桿菌NCIMB 8826 和發(fā)酵乳桿菌NCIMB 5221 制備微囊化益生菌混合物，該混合物能顯著降低高脂飲食金黃地鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯濃度，并且在益生菌結(jié)束遞送后的4 周仍能維持治療效果[87]。以醋酸引發(fā)冷凝乳-植物油-碳酸鈣體系中κ-酪蛋白和鈣離子交聯(lián)作用為原理制備的微囊化植物乳桿菌LIP-1 產(chǎn)品被證明可以增加大鼠糞便膽固醇排泄，降低大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平，緩解肝臟代謝紊亂，修復(fù)心血管內(nèi)膜和腸黏膜損傷，降低血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇濃度，且效果優(yōu)于裸菌[63]。另有學(xué)者使用微流體技術(shù)將搭載了綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒和胰高糖素樣肽-1 usp45 分泌信號(hào)肽基因序列的光控乳酸乳球菌GFP 菌株封裝成吲哚菁綠微膠囊，該產(chǎn)品可以在大鼠體內(nèi)將體外人工發(fā)射的高穿透力980 nm 的近紅外光轉(zhuǎn)化為475 nm 的藍(lán)光，促使體內(nèi)的工程益生菌每日固定時(shí)間釋放胰高糖素樣肽-1，從而持續(xù)穩(wěn)定降低糖尿病大鼠的血糖水平并改善其血脂代謝[88]。包裹在海藻酸鹽-殼聚糖微凝膠中的鼠李糖乳桿菌ATCC 7469 被證明可以通過改變腸道的微生物區(qū)系，來改善高鹽飲食誘導(dǎo)的小鼠代謝性腎損傷[89]。

3 總結(jié)

從現(xiàn)有的研究來看，微囊化益生菌的產(chǎn)品功能性評(píng)價(jià)研究取得了突破性進(jìn)展，合適的益生菌微囊化處理可以拓展和提升各類益生菌在食品安全、畜牧養(yǎng)殖、健康膳食和臨床治療等方面的應(yīng)用，然而其中的研究也存在諸多局限性。

就益生菌在動(dòng)物胃腸道黏膜黏附而言，有學(xué)者最近通過手術(shù)精細(xì)剝離機(jī)體胃腸道黏膜并對(duì)不同胃腸道區(qū)段的黏膜表面和內(nèi)容物中的微生物宏基因組進(jìn)行測序，結(jié)果顯示益生菌在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的遞送會(huì)遭遇到廣泛而明顯的腸道黏膜定植抗性，而益生菌在人類體內(nèi)具有個(gè)體、區(qū)域和菌株特異性的黏膜定植模式[90]。另有研究發(fā)現(xiàn)在恒河猴體內(nèi)不同區(qū)域的腸上皮黏膜或內(nèi)容物的微生物區(qū)系存在差異，糞便中的微生物區(qū)系僅與部分胃腸道區(qū)域微生物區(qū)系存在相關(guān)性[91]。這些結(jié)果印證了動(dòng)物糞便的微生物與體內(nèi)胃腸道黏膜定植的微生物僅存在部分相關(guān)性。進(jìn)一步而言，歷來許多學(xué)者通過檢測糞便中的益生菌來間接推斷“益生菌在腸道中滯留并黏附定植”的試驗(yàn)設(shè)計(jì)思路可能存在問題。細(xì)菌黏附黏膜的過程存在可逆階段和穩(wěn)定階段[92]，在胃腸道中停留時(shí)間長并不能證明益生菌完成了定植并可長期生存，對(duì)益生菌體內(nèi)定植的確鑿性需要類似胃腸道上皮黏膜活檢這類更加慎重直接的證據(jù)。

動(dòng)物模型方面，現(xiàn)階段廣泛用于體內(nèi)試驗(yàn)測試益生菌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般為嚙齒類，盡管該類模型成本較低且倫理審查方案完善，然而仍有不少學(xué)者提出嚙齒類動(dòng)物的胃腸道結(jié)構(gòu)和微生物群特異性與人類的相關(guān)性較差[90，93-94]。相比嚙齒類試驗(yàn)動(dòng)物而言，豬或狗胃腸道的部分結(jié)構(gòu)、特征及微生物群與人類相關(guān)性更強(qiáng)，因此在確保倫理審查完備的前提下，如果以豬或狗作為非侵害性飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)的模型動(dòng)物可能會(huì)得到更高的證據(jù)等級(jí)，使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更有說服力并提升與人類臨床研究的相關(guān)性[95-97]。

另外，現(xiàn)有的關(guān)于微囊化益生菌功能性評(píng)價(jià)的研究存在“重體外，輕體內(nèi)”的現(xiàn)象，大量的微囊化益生菌的功能性研究仍然停留在體外階段，例如模擬胃腸道消化、體外抗菌、模擬黏附等，證據(jù)等級(jí)低，缺乏對(duì)于動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)酥寥祟惻R床階段的進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)而導(dǎo)致研究成果轉(zhuǎn)化和商業(yè)化率較低。市面上具有高科技含量和高附加值的微囊化益生菌產(chǎn)品大部分仍以較為成熟的歐美日韓等國外企業(yè)品牌為主，這制約了我國益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此筆者認(rèn)為益生菌微囊化研究要避免“打一槍換一個(gè)地方”，對(duì)于有潛力的微囊化工藝和菌種需要深度耕耘研究，切實(shí)以產(chǎn)業(yè)需求為導(dǎo)向，開發(fā)出具有行業(yè)國際競爭力的產(chǎn)品，并促進(jìn)更多的物美價(jià)廉的微囊化益生菌產(chǎn)品投送市場，提升全民健康水平，并產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。