非小細(xì)胞肺癌組織中CLCA4的表達(dá)情況及與病理和預(yù)后的關(guān)系

吳媛媛 劉科 齊艷麗 童小華

1商洛市中心醫(yī)院病理科，商洛 726000；2商洛市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，商洛 726000

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見(jiàn)的肺癌類型，占85%以上［1-3］。盡管近年來(lái)針對(duì)NSCLC的診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但該疾病的發(fā)病率和病死率仍居高不下。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和標(biāo)志物對(duì)于NSCLC 的診療及預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要。鈣激活的氯離子通道A 4（calcium-activated chloride channel regulator 4，CLCA4）是一種離子通道調(diào)節(jié)蛋白，在人體中廣泛分布，并參與多種生理過(guò)程［4］。CLCA4 可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路（PI3K/AKT）、Janus 激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3（JAK2/STAT3）等腫瘤細(xì)胞增殖的信號(hào)途徑，介導(dǎo)結(jié)直腸癌的病理改變［5-6］。而PI3K/AKT、JAK2/STAT3 等腫瘤信號(hào)作為NSCLC 病理進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)途徑，部分學(xué)者認(rèn)為CLCA4的表達(dá)與NSCLC 的病理進(jìn)展及預(yù)后存在關(guān)聯(lián)［4］。然而，目前對(duì)于CLCA4 在NSCLC 中的作用和機(jī)制研究資料有限，能否成為NSCLC 新的治療靶點(diǎn)尚待驗(yàn)證［5］?；诖?，本文旨在探討CLCA4 在NSCLC 組織中的表達(dá)情況，并研究其與病理及預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC 的診療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路和策略。

資料與方法

1.一般資料

前瞻性選取商洛市中心醫(yī)院2019年4月至2022年4月收治的106 例NSCLC 患者進(jìn)行研究。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肺癌的臨床診斷［7］，術(shù)前經(jīng)病理穿刺活檢確診；②符合手術(shù)指征，均行NSCLC根治性切除術(shù)，術(shù)后留存病理組織送常規(guī)病理。美國(guó)麻醉師醫(yī)學(xué)會(huì)分級(jí)I～Ⅱ級(jí)；③TNM 分期Ⅱ～ⅢA 期；④卡氏健康評(píng)分＞65 分；⑤年齡＞18 歲；⑥患者家屬均簽署知情同意書(shū)。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移癌；②NSCLC 復(fù)發(fā)；③肝、腎功能衰竭；④合并其他呼吸道急性感染；⑤心腦血管急癥治療期；⑥妊娠期、哺乳期女性；⑦病歷資料缺失或不接受隨訪。

本研究通過(guò)商洛市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2019-001）。

2.研究方法

術(shù)后收集患者的臨床資料，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)癌組織及癌旁正常組織中CLCA4的表達(dá)情況。

2.1.資料收集 人口學(xué)資料包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙、肺癌家族史；病理資料包括組織類型、分化程度、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2.CLCA4 陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)病理組織中CLCA4 陽(yáng)性表達(dá)情況。采用半定量評(píng)分法判定結(jié)果：染色強(qiáng)度分為無(wú)染色、弱染色、中等強(qiáng)度染色、強(qiáng)染色，對(duì)應(yīng)評(píng)分依次記為0分、1分、2分、3分；染色數(shù)量分為陽(yáng)性細(xì)胞占比＜5%、5%～25%、＞25%～75%、＞75%～100%，對(duì)應(yīng)評(píng)分依次記為0分、1分、2分、3分。染色強(qiáng)度和染色數(shù)量得分之和≥2分判定為陽(yáng)性（陽(yáng)性細(xì)胞占比＜5%直接記為陰性。）

2.3.CLCA4 表達(dá)檢測(cè)方法 病理標(biāo)本置于RNAlater 保護(hù)液中，-80 ℃冷凍保存，檢測(cè)前離心去除保護(hù)劑。將組織標(biāo)本置于液氮中研磨成粉，依次提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃冷凍保存，預(yù)備PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min、變性15 s、60 ℃退火1 min、延伸溫度68 ℃，40個(gè)循環(huán)。取3個(gè)樣本復(fù)孔的均值，以CT值為基礎(chǔ)，采用2-△△CT法計(jì)算CLCA4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4.隨訪及分組 所有患者術(shù)后采用門(mén)診復(fù)查、電話隨訪等方法跟蹤隨訪12 個(gè)月，觀察無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）情況。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。影響因素的分析采用多因素logistic逐步回歸模型，生存曲線Kaplan-Meier 分析與對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)估預(yù)測(cè)效能。

結(jié)果

1.CLCA4表達(dá)（表1）

表1 106例非小細(xì)胞肺癌患者癌組織、癌旁正常組織中CLCA4表達(dá)分析

癌組織中CLCA4 陽(yáng)性率及CLCA4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁正常組織（均P＜0.05）。

2.不同病理分期患者的CLCA4表達(dá)

42 例Ⅱ期患者的CLCA4 mRNA 表達(dá)量為（0.69±0.15），64 例ⅢA 期患者的CLCA4 mRNA 表達(dá)量為（0.61±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.914，P=0.004）。

3.不同預(yù)后組患者的臨床資料比較（表2）

表2 不同預(yù)后非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料比較

106例患者均正常隨訪12個(gè)月，其中非DFS組58例，DFS組48例。兩組患者的性別、年齡、BMI、吸煙、肺癌家族史、組織類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；非DFS組中ⅢA期患者例數(shù)高于DFS組（P＜0.05），CLCA4 mRNA表達(dá)量低于DFS組（P＜0.05）。

4.預(yù)后影響因素分析（表3）

表3 106例非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響因素分析

以NSCLC 患者死亡為因變量（是=1，否=0），logistic 回歸分析得出，TNM 分期（OR=4.031，95%CI1.429～11.364，P=0.003）、CLCA4 mRNA 表達(dá)量（OR=0.310，95%CI0.109～0.873，P=0.003）均是NSCLC患者DFS的影響因素。

5.預(yù)測(cè)效能分析（圖1）

圖1 CLCA4 mRNA預(yù)測(cè)106例非小細(xì)胞肺癌患者DFS的ROC

ROC 分析得出，CLCA4 mRNA 預(yù)測(cè)NSCLC 患者DFS 的最佳截?cái)嘀禐?.60，靈敏度為0.802（95%CI0.715～0.893）、特異度為0.809（95%CI0.721～0.904）、曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.857（95%CI0.782～0.935）。

6.生存預(yù)后分析（圖2）

圖2 不同CLCA4 mRNA 表達(dá)水平的非小細(xì)胞肺癌患者的DFS曲線比較

基于5.中CLCA4 mRNA 預(yù)測(cè)NSCLC 患者DFS 的最佳截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃镃LCA4 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中CLCA4 mRNA 高表達(dá)組50 例，死亡2 例；低表達(dá)組56 例，死亡11 例。兩組患者的生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=6.006，P=0.014）。

討論

NSCLC 作為全球生存率最低的實(shí)體瘤，基因蛋白的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8-11］。根據(jù)全球癌癥2020 年數(shù)據(jù)報(bào)道［12］，肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，我國(guó)約30%的癌因死亡與肺癌有關(guān)，且發(fā)病率及病死率一直呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。近幾年隨著靶向［表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑、間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶（ROS1）融合基因等］、免疫［程序性死亡受體1（PD-1）、程序性死亡受體配體1（PD-L1）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）抑制劑等）］等生物療法不斷取得突破，肺癌患者的生存效果顯著改善，但5 年總生存率僅保持在20%，且晚期NSCLC 患者的預(yù)后更差［13-15］。因此，針對(duì)NSCLC 新型診療靶點(diǎn)的探索一直是臨床醫(yī)學(xué)者研究的重點(diǎn)。

本研究嘗試探究CLCA4 在NSCLC 組織中的表達(dá)情況以及與病理和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明，與癌旁正常組織比較，癌組織中CLCA4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量更低，且隨著NSCLC 患者的病理進(jìn)展，CLCA4 表達(dá)量呈降低趨勢(shì)。與Li和Huang［6］、陳慧莉等［16］報(bào)道的CLCA4 在結(jié)直腸癌、乳腺癌中的表達(dá)均被抑制一致。Horaira等［17］研究提出，在癌組織中CLCA4基因甲基化改變可導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。因此，本研究分析NSCLC 組織中DNA 甲基化改變是導(dǎo)致CLCA4 表達(dá)降低的原因之一，CLCA4 mRNA 表達(dá)量與NSCLC 患者的DFS預(yù)后相關(guān)，且在NSCLC 患者DFS預(yù)測(cè)中效能表現(xiàn)良好。同時(shí)，CLCA4 mRNA 高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線存在差異，進(jìn)一步證實(shí)CLCA4 表達(dá)的變化與NSCLC 的病理進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。JAK2/STAT3 信號(hào)通路被廣泛認(rèn)為是與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的一條信號(hào)通路，JAK2/STAT3 信號(hào)通路的活化可誘導(dǎo)靶向基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［18-21］。早期研究表明，JAK2/STAT3 信號(hào)通路可通過(guò)介導(dǎo)干擾素-γ、白細(xì)胞介素-10 等細(xì)胞因子激活JAK2酪氨酸激酶，從而使其磷酸化并激活STAT3轉(zhuǎn)錄因子［22-23］。激活的STAT3可通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因（如cyclin D1、c-myc、Bcl-2等）的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程［24-26］。在肝癌、乳腺癌、肺癌等［27-28］多種惡性腫瘤中都存在JAK2/STAT3 的異常激活。Xiong 等［29］發(fā)現(xiàn)CircRPPH1 通過(guò)PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在NSCLC 的治療中可通過(guò)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路和抑制msi2 細(xì)胞活性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［30］。而蔣可心等［31］研究發(fā)現(xiàn)，CLCA4對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路具有抑制作用，且該信號(hào)途徑可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。因此，CLCA4 與JAK2/STAT3信號(hào)通路的相互作用，同樣是影響NSCLC病理進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)鍵。后續(xù)臨床實(shí)踐可通過(guò)檢測(cè)NSCLC癌組織中CLCA4 的變化，輔助診斷或評(píng)估NSCLC 患者的病理狀態(tài)，且可能成為后續(xù)治療NSCLC的新型靶點(diǎn)。

綜上，NSCLC 患者癌組織中CLCA4 表達(dá)被抑制，且與病理進(jìn)展及DFS 預(yù)后有關(guān)。但鑒于本研究納入樣本量有限，后續(xù)仍需完善多中心、大樣本隨機(jī)對(duì)照研究，證實(shí)本研究結(jié)論。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明吳媛媛：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫(xiě)，統(tǒng)計(jì)分析，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；劉科、齊艷麗：采集數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析，支持性貢獻(xiàn)；童小華：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)