一氧化氮處理對杏果實采后抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)及貯藏品質的影響

張潔仙,劉雪艷,單晴,姜麗巍,吳斌,魏佳

1(新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院,新疆 烏魯木齊,830052)

2(新疆農業(yè)科學院農產品貯藏加工所,新疆 烏魯木齊,830091)

3(新疆農產品加工與保鮮重點實驗室,新疆 烏魯木齊,830091)

杏(PrunusarmeniacaL.)具有較高的營養(yǎng)價值和抗氧化能力,已成為世界上最受歡迎的水果之一[1]。通常情況下,杏果實采后具有較高的呼吸強度和乙烯釋放,會導致果實采后品質質量的損失,從而限制了杏果實的運輸、商業(yè)化和營養(yǎng)價值的維持。因此,為防止后熟、維持果實感官和營養(yǎng)品質,需要探究一種高效的方法以延長果實的保質期并增加水果的市場價值。

近年來,NO處理作為一種可以更高效地提高果實采后品質的策略已被廣泛應用。NO具有氧化還原活性,可以通過擴散方式透過細胞膜,在細胞之間具有生物學作用。另外,NO作為抗氧化劑與活性氧(reactive oxygen species,ROS)通路密切相關,在氧化應激期間淬滅ROS并減少脂質過氧化,兩者都可以調節(jié)參與植物應激反應、初級代謝,進而維持果實采后的衰老[2]。已經證明NO可以誘導甜瓜[3]、桃[4]和番茄[5]等果實中的ROS系統(tǒng),這與延緩果實衰老的能力高度相關。過量的ROS與DNA、蛋白質和脂質反應以觸發(fā)細胞膜的脂質過氧化,最終導致細胞死亡[6]。然而,在植物中存在完善ROS清除系統(tǒng),其可調節(jié)ROS平衡并維持細胞的正常氧化還原狀態(tài)?？箟难?谷胱甘肽(ascorbic acid-glutathione,AsA-GSH)循環(huán)作為常見的ROS清除系統(tǒng),有利于保持ROS穩(wěn)態(tài)[6]。AsA-GSH循環(huán)主要包括抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)4種抗氧化酶,以及抗壞血酸(AsA)、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid,DHA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)。研究發(fā)現,NO處理梨果實后,提高了AsA和GSH含量,增強了APX、GR、MDHAR和DHAR的活性,延緩梨的衰老[7]。APX、GR、MDHAR、DHAR酶活性增強,保持了桃果實貯藏過程中較高的抗氧化能力[8]。以上結果表明,NO與AsA-GSH循環(huán)存在密切聯系。然而,NO能否通過果皮和果肉AsA-GSH循環(huán)延緩杏果實采后的品質的下降還尚未進一步明確。

因此,本研究旨在研究NO處理對杏果實采后呼吸強度和品質參數的影響;通過測定AsA-GSH循環(huán)相關指標及關鍵酶活性,分析AsA-GSH循環(huán)在杏果實果皮和果肉的不同變化;闡明杏果實采后常溫下貯藏品質變化與AsA-GSH循環(huán)存在的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

吊干杏(PrunusarmeniacaL.cv ‘Diaogan’)于2021年7月8日在新疆阿克蘇市四團商業(yè)果園采收,杏果實采收期為綠色成熟階段(可溶性固形物含量≥11%),采收后運回新疆農業(yè)科學院,預冷24 h后進行處理。選擇大小均勻、色澤均一,無機械損傷和病蟲害的杏果實,進行后續(xù)實驗。

NO標準氣體(≥95%,純度),烏魯木齊鑫天意標準氣體有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮,天津市福晨化學試劑廠;三氯乙酸,天津市致遠化學試劑有限公司;還原性谷胱甘肽,瑞禧生物國產/進口有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GY-4果實硬度計,浙江艾德堡儀器有限公司;Check Point III O2/CO2分析儀,阿美特克(上海)有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計,日本島津公司;高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

采用30 μL/L的NO對杏果實進行3 h的熏蒸處理,同時做CK(不熏蒸)空白對照組,每個處理3組平行試驗[試驗處理時溫度為室溫,(25±1.0) ℃]。NO處理時將杏果實置于熏蒸罐(100 cm×75 cm×75 cm)中,先抽真空,再注入氮氣使罐內壓力等于大氣壓力,然后使用氣體進樣針注入NO標準氣體,立即拔出注射器針口,同時打開風扇,使NO氣體在密封箱中均勻分布。熏蒸結束,將果實分裝于盒蓋上帶有均勻小孔的保鮮盒中(尺寸為21 cm×15 cm×8.5 cm),每盒500 g左右杏果實,放置在常溫、避光[溫度為(25±1.0)℃,相對濕度為(80±5)%]條件下貯藏,定期取樣測定相關指標,指標平行3次,將樣品果皮果肉分開后用液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中,用于后期其他指標的測定。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 硬度的測定

采用GY-4型果實硬度計對每個處理隨機選取的6個杏果實進行測定,檢測部位為果實赤道處,探頭直徑為3 mm,重復3次。硬度以N表示。

1.3.2.2 可溶性固形物(total soluble solid,TSS)和可滴定酸(titratable acid,TA)含量的測定

隨機選取杏果實,榨汁后過濾,采用PR-PAL-1型數顯糖度計測定,各處理重復3次,取其平均值,TSS含量用%表示。

TA的測定參照曹建康等[9]的方法。TA采用氫氧化鈉滴定法測定,以蘋果酸計(折算系數0.067),單位:%。

1.3.2.3 呼吸強度的測定

使用Check Point III O2/CO2分析儀測定密閉盒內CO2體積分數,呼吸強度以每小時每千克果實累積釋放的CO2質量所表示,呼吸強度以mg/(kg·h)表示。

1.3.2.4 H2O2含量的測定

H2O2含量以μmol/g表示,按照WANG等[10]的方法進行測定,略有修改。稱取凍樣(2.0 g)添加到3.0 mL冷丙酮(4 ℃)中,冰浴研磨勻漿,4 ℃下以10 000×g離心15 min。取上清液1.0 mL與0.1 mL 10%(體積分數)四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL氫氧化銨(13.38 mol/L)混合,然后在25 ℃下反應5 min。離心混合物以獲得沉淀。用冷丙酮洗滌2次后,向沉淀中加入3.0 mL 2 mol/L鹽酸,在吸光度415 nm下記錄。

1.3.2.5 AsA和DHA含量的測定

AsA和DHA含量根據ZHU等[11]和伊麗達娜·迪力夏提等[12]的方法,略有改動。將冷凍樣品(1.0 g)在5 mL 6%(體積分數)三氯乙酸中于4 ℃研磨1 min。將勻漿在10 000×g下于4 ℃離心10 min。收集上清液以確定AsA和DHA的含量。

AsA+DHA(總抗壞血酸)含量的測定:向1.0 mL粗酶液中加入0.5 mL 60 mmol/L二硫蘇糖醇-乙醇溶液,用磷酸氫二鈉-氫氧化鈉混合液將溶液pH調至7～8,置于室溫下10 min,然后加入0.5 mL 20% 三氯乙酸,將pH調至1～2,在543 nm處測其吸光值。

AsA的測定:取1 mL上清液加入1 mL 5%三氯乙酸、1 mL乙醇搖勻,再依次加入0.5 mL 0.4%(體積分數)正磷酸-乙醇、1.0 mL 0.5%(體積分數)二苯甲酮-乙醇、0.5 mL 0.03%(體積分數)三氯化鐵-乙醇。將溶液置于30 ℃下反應90 min,然后在543 nm下測定其吸光值。AsA和DHA含量表示為mmol/g。

DHA含量:總抗壞血酸含量減去AsA含量即為DHA的含量。每個樣品重復測定3次。

1.3.2.6 GSH和GSSG含量的測定

根據WANG等[10]和伊麗達娜·迪力夏提等[12]的方法測定了GSH和GSSG的含量稍作修改。將1.0 g冷凍樣品在2 mL 5%(體積分數)偏磷酸中研磨,然后在10 000×g,4 ℃下離心10 min。

GSH+GSSG含量測定:300 μL粗酶液加入2.5 mL反應液,其中包含500 μL反應液A[50 mmol/L七水磷酸氫二鈉、20 mmol/L磷酸二氫鈉、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L二硫代二硝基苯甲酸、0.02%(體積分數)牛血清蛋白]、500 μL反應液B[1 mmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L咪唑和0.02%(體積分數)牛血清白蛋白]、500 μL反應液C[5%(體積分數)磷酸氫二鈉,pH 7.5]和100 μL 9 mmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,以6%(體積分數)偏磷酸(pH 2.8)代替提取液作為對照,在412 nm下測定其吸光值。

GSSG含量測定:500 μL粗酶液加入2.5 mL乙烯吡啶,25 ℃下水浴1 h,在412 nm下測其吸光度,GSSG含量表示為mol/g。

GSH含量:總谷胱甘肽含量減去GSSG含量即為GSH含量。每個樣品重復測定3次。

1.3.2.7 AsA-GSH循環(huán)酶活性的提取與測定

APX、GR、DHAR和MDHAR的活性根據HUANG等[13]的方法測定。稱取1.0 g果皮或果肉,加入3.0 mL預冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.8,含有2.0 mmol/L AsA、0.2 mmol/L EDTA和2.0 g/L的交聯聚乙烯吡咯烷酮)。在4 ℃和10 000×g下離心20 min,并收集清液以測定APX、GR、MDHAR和DHAR活性。

混合200 μL粗酶、2.0 mL 100 mmol/L PBS(含有1.0 mmol/L EDTA,pH 7.5)、500 μL 20 mmol/L H2O2和800 μL 3.0 mmol/L EDTA,以測定APX活性。GR的反應混合物由3.0 mL 100 mmol/L PBS(pH 7.5)、0.1 mL 5.0 mmol/L GSH氧化、0.2 mL粗酶液和30 μL 3.0 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)組成。

MDHAR反應溶液包括0.2 mL粗酶液、1.7 mL 50 mmol/L PBS(pH 7.5)、200 μL 2.0 mmol/L AsA和100 μL 4.0 mmol/L NADPH。用于DHAR的2 mL反應溶液由200 μL粗酶液、1.6 μL 0.1 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫化鉀緩沖液、100 μL 20 mmol/L谷氨酸和100 μL 8.0 mmol/L二十二碳六烯酸組成。

在290 nm和265 nm處每分鐘吸光度的0.01變化分別定義為一個單位(U)。APX和DHAR激活都被描述為U/g。測定340 nm處的吸光度,并將每分鐘0.01的變化定義為一個單位(U)。GR和MDHAR活性均被描述為U/g。

1.4 數據分析

試驗過程完全是隨機進行的。每個處理由3個重復組成,結果表示為平均值±標準誤差。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖,SPSS 20.0和LSD測試進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 NO對杏果實采后硬度、呼吸強度、TSS和TA含量的影響

在圖1-A中,杏果實在貯藏的前1 d內硬度保持不變,對照組果實的硬度隨著貯藏期延長迅速下降。然而,在整個貯藏期內,NO處理的杏果實硬度的減小速度比對照緩慢。貯藏6 d,對照組的硬度僅為NO處理的61.96%(P<0.05)。

A-硬度;B-呼吸強度;C-TSS含量;D-TA含量

圖1-B顯示杏果實在貯藏期間6 d內呼吸強度的變化。對照果實貯藏4 d時呼吸強度出現峰值,而NO處理杏果實5 d出現最大值,NO處理顯著延緩了杏果實呼吸強度峰值的出現。此后,呼吸強度隨著貯藏時間的延長而急劇下降。貯藏第4天時,NO處理的杏果實呼吸強度比對照降低30.92%(P<0.05)。

在貯藏期間對照組和處理組TA含量變化均呈先上升后下降趨勢(圖1-C);而NO處理的杏果實在整個貯藏期內保持了比對照組更高的TA含量。在第3天和第6天時,NO處理的杏果實TA含量分別比對照高22.4%和42.1%(P<0.05)。

如圖1-D所示,NO處理和對照組的杏果實TSS含量變化趨勢不一致。貯藏前4 d,NO處理組TSS含量低于對照。對照組的TSS含量在第4天達到峰值,比NO處理組高了14.56%;NO處理延緩了杏果實TSS含量峰值的出現,同期比對照組高12.69%。整個貯藏期間,NO處理顯著延緩了杏果實TSS含量的變化(P<0.05)。

2.2 NO處理對杏果實采后H2O2含量的影響

果皮中H2O2含量從貯藏第1天開始均存在顯著差異,除第2天外(圖2-A)。NO處理組顯著降低H2O2含量,并在第1天和第4天達到峰值,分別比對照組H2O2含量低11.30%和30.31%。在NO處理組中,果肉H2O2的含量被顯著抑制(圖2-B)。第6天時,NO處理組H2O2含量比初始值低47.63%(P<0.05)。

A-果皮;B-果肉

2.3 NO處理對杏果實采后AsA和DHA含量的影響

貯藏期間,杏果實果皮和果肉AsA含量變化模式一致,呈先增加隨后減少趨勢(圖3-A、圖3-B)。貯藏前期,2組果皮和果肉中AsA含量均無顯著差異,在第3天時出現最大值,且對照組AsA含量比NO處理組低37.81%和41.3%。整個貯藏期間,果皮中AsA含量是果肉的3.23倍(P<0.05)。

在整個貯藏期間,果皮DHA含量顯示2個峰(圖3-C)。DHA含量的峰值出現在第2天和第4天,NO處理顯著增加了果皮中DHA的含量(P<0.05)。在第3天和第4天,NO處理果肉中DHA含量明顯增加,且是對照組的34.62%和22.65%(圖3-D)。然而,除第1 天外,NO處理明顯提高了杏果實不同組織中的DHA含量,NO處理組果皮果肉平均含量是對照組的1.93和1.81倍(P<0.05)。

A-果皮AsA;B-果肉AsA;C-果皮DHA含量;D-果肉DHA含量

2.4 NO處理對杏果實采后GSH和GSSG含量的影響

GSH含量的變化保持增加的趨勢(圖4-A、圖4-B)。除第1天外,NO處理顯著提高了杏果實不同組織的GSH含量。在第2～5天,果皮GSH含量變化最為顯著,且NO處理組GSH含量平均比對照組高1.21倍。NO處理的果肉中GSH含量在第2天出現最大值,比對照組增加了14.77%(P<0.05)。

貯藏期間,GSSG含量的變化趨勢與GSH相反(圖4-C、圖4-D)。除第4天和第6天外,NO處理降低了果皮的GSSG含量變化。同樣地,NO處理組果肉中GSSG含量在第5天顯著高于對照組,比對照組高39.83%(P<0.05)。無論是對照組還是NO處理組,GSSG含量第1天均為最大值,其中果皮GSSG含量是果肉的2.05倍(P<0.05)。以上結果表明,NO處理可以保持杏果實更高的氧化還原狀態(tài)。

A-果皮GSH;B-果肉GSH;C-果皮GSSG含量;D-果肉GSSG含量

2.5 NO處理對杏果實采后AsA-GSH循環(huán)DHAR和APX酶活性的影響

貯藏第2～6天內,杏果實果皮DHAR活性呈穩(wěn)定上升趨勢,隨后迅速下降(圖5-A)。NO處理促進了果皮中DHAR活性的提高,在貯藏第4天和第6天時,NO處理果實的DHAR活性分別比對照組高15.79%和9.91%(P<0.05)。對照組和NO處理的果肉DHAR活性在貯藏期的前3 d內均呈上升趨勢,之后下降直至貯藏結束(圖5-B),但NO處理的DHAR活性在整個貯藏期內均高于對照組。貯藏6 d后,NO處理組的DHAR活性比對照組高25.77%(P<0.05)。

A-果皮DHAR活性;B-果肉DHAR活性;C-果皮APX酶活性;D-果肉APX酶活性

APX活性呈現先上升后下降的變化趨勢(圖5-C、圖5-D),NO處理組維持了較高水平的APX活性。果皮中NO處理的APX活性在第4天達到峰值,是對照處理的1.45倍(P<0.05);果肉APX活性與果皮的變化相似,且NO處理組與對照組存在顯著性差異,NO處理延緩了果肉中APX活性峰值的出現,與對照組相比提高了37.02%(P<0.05)。

2.6 NO處理對杏果實采后AsA-GSH循環(huán)GR和MDHAR酶活性的影響

果皮的GR活性在第2～4天增加,隨后下降(圖6-A)。NO處理顯著提高了果皮的GR活性,并在第4天達到最大值,NO處理組比對照組高22.92%(P<0.05)。貯藏結束時,對照組果皮GR活性比NO處理組低29.51%(P<0.05);果肉中GR活性與果皮活性變化趨勢一致,除第1天外,NO處理顯著提高了果肉中GR的活性,且第3天達到峰值(圖6-B)。

整個貯藏期間,NO處理激活了果皮MDHAR活性(圖6-C)。NO處理組的果皮MDHAR活性在第2、3、5、6天與對照組相比分別增加了16.69%、14.12%、20.65%和14.50%。在果肉中,NO處理均顯著促進了MDHAR活性,與對照組相比分別增加了18.56%、27.67%、26.67%、13.75%、32.99%和26.43%(圖6-D)。整個貯藏期間,果皮MDHAR活性顯著高于果肉(P<0.05)。

A-果皮GR活性;B-果肉GR活性;C-果皮MDHAR活性;D-果肉MDHAR活性

3 討論

杏果實采后的成熟過程涉及一些生理反應,例如呼吸爆發(fā)、乙烯的積累和品質變化[14-15]。其中,硬度、呼吸速率以及TA、TSS含量作為衡量果實品質的重要因素,反映了貯藏期間果實采后的新鮮程度[16]。本研究發(fā)現,NO處理能顯著抑制杏果實采后呼吸強度、TA和TSS含量的變化,并保持了果實的硬度,延緩貯藏期間品質的下降(圖1)。近年來,外源NO在改善果實采后品質方面的研究越來越多。NO處理的桃果實在冷藏過程中TSS、TA含量均發(fā)生了變化[11]。樹莓果實在NO處理下表現出TSS和TA的最小損失,以及呼吸強度的緩慢增加,保持了貯藏品質[17],表明NO在采后處理中具有潛在的應用價值。

果實衰老主要是由于過量的ROS引起的氧化損傷。植物已經發(fā)展出有效的機制來控制ROS水平,當這種平衡被破壞時,細胞內ROS水平將顯著增加,導致細胞結構的不可逆氧化損傷。在此同時,植物可以通過AsA-GSH循環(huán)解毒,并在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[18-19]。本試驗表明,NO處理維持了不同組織中H2O2含量的變化(圖2)。對照組果皮和果肉H2O2含量在貯藏后期下降可能是因較高抗氧化酶活性而受到抑制[20]。AsA和GSH在非酶促反應中充當ROS的清除劑,是決定果實抵御采后氧化應激能力的關鍵標志[21]。較高水平ROS清除劑可以減少ROS的積累,維持細胞抗氧化系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)。在本試驗中,NO處理促進了杏果實果皮和果肉中AsA和GSH的積累,降低了DHA和GSSG的含量(圖3、圖4),說明NO處理可以激活果皮和果肉中的AsA-GSH循環(huán),通過調節(jié)ROS水平,從而延緩杏果實的衰老。此外,NO的釋放還可以提高抗氧化酶活性,促進AsA-GSH循環(huán)之間的轉換,減少ROS積累所造成的氧化損傷[22]。先前的研究證明植物細胞中AsA-GSH循環(huán)可以通過清除過量的ROS延遲收獲后衰老[5,23-24]。上述結果有力地證實了NO處理可以通過增強氧化還原穩(wěn)態(tài)的轉變來提高杏果實的抗氧化能力。

AsA-GSH循環(huán)的另一部分是抗氧化酶。APX、GR、DHAR和MDHAR是參與這一循環(huán)的關鍵酶,為促進AsA-GSH循環(huán)的再生和維持植物體內還原物質平衡發(fā)揮著至關重要的作用[10,12]。APX通過將H2O2還原成H2O,維持了細胞內自由基的代謝平衡,并與GR協(xié)同將AsA氧化為DHA。在清除ROS的過程中,DHAR將GSH氧化為GSSG,GSH被GR回收,MDHAR和DHAR可分別將MDHA和DHA還原為AsA,較高的還原電位有利于維持植物正常的細胞功能和抗氧化應激[25-26]。本研究中,NO處理杏果實果皮和果肉APX、MDHAR以及DHAR活性顯著增加(圖5-A、圖5-B、圖6-A、圖6-B)。GR是AsA-GSH循環(huán)的一種潛在酶,以維持AsA-GSH循環(huán),在ROS防御系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用[6]。NO處理激活了杏果實中GR活性(圖6-C、圖6-D),這與桃果實的結果類似[22]。上述結果證實,AsA和GSH氧化還原狀態(tài)的變化與AsA-GSH循環(huán)中關鍵酶活性的變化規(guī)律一致。另外,果皮中AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶活性顯著高于果肉,可能是果皮對氧化損傷的防御能力高于果肉的原因,推測主要受果實組織結構、抗氧化物質和含水量的影響。外源褪黑激素處理后增強了櫻桃中AsA-GSH循環(huán)的抗氧化酶活性,維持了更好的ROS穩(wěn)態(tài),延遲了果實的衰老[10]。此外,經減壓處理的桃果實表現出較高的AsA-GSH循環(huán)中關鍵酶活性,減輕了0 ℃貯藏果實的冷害[27]。結果表明AsA-GSH是維持杏果實采后ROS穩(wěn)態(tài)和氧化還原狀態(tài)的重要機制。

綜上所述,30 μL/L NO較好地維持了杏果實采后的硬度以及呼吸速率、TSS、TA含量變化。NO處理通過激活了參與AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶的活性,從而提高了AsA和GSH的含量,降低了DHA和GSSG的含量。以上數據表明NO處理較大程度地增強了果皮和果肉中抗氧化酶的活性,從而提高了杏果實AsA-GSH循環(huán)清除ROS的能力,維持了細胞氧化還原平衡,提升了杏果實采后的貯藏品質。此外,AsA和GSH含量的變化與APX、MDHAR、DHAR和GR活性的變化具有相似的規(guī)律,證實了參與AsA-GSH循環(huán)的酶負責AsA和GSH的再生。