白果肽的二肽基肽酶-Ⅳ抑制活性及其抑制機(jī)理研究

王翔,張彩虹,蔣建新,謝普軍*,黃立新*

1(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所,江蘇 南京,210042)

2(北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京,100083)

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種由胰島素抵抗或胰島素相對(duì)缺乏引起的慢性疾病,嚴(yán)重威脅著人們的生命安全[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球目前約有4.15億人患有Ⅱ型糖尿病,如不加控制,預(yù)計(jì)到2040年,其患者人數(shù)將達(dá)到6.42億[2]。研究表明,抑制二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)活性可有效治療T2DM。目前,臨床上常用的DPP-Ⅳ抑制劑,如沙格列汀、西他列汀和維格列汀等人工合成類藥物雖療效顯著,但長(zhǎng)期服用可能會(huì)引起頭痛、尿道和上呼吸道感染等不良反應(yīng)[3]。因此,尋找高效、低毒副作用的新型DPP-Ⅳ抑制劑成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。近年來(lái),食源性DPP-Ⅳ抑制肽因其天然、安全和高效等優(yōu)點(diǎn)在治療T2DM中備受關(guān)注。

白果,作為我國(guó)傳統(tǒng)食品,富含蛋白質(zhì)和多種活性成分[4],但由于加工技術(shù)的限制,目前對(duì)于白果的利用,僅停留在食品加工的初級(jí)階段,經(jīng)濟(jì)效益較低,導(dǎo)致每年大量的白果被丟棄,造成嚴(yán)重資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。為實(shí)現(xiàn)白果的高值化利用,課題組前期采用酶解法將白果中提取得到的蛋白質(zhì)水解為高附加值的多肽[5-6],并對(duì)其DPP-Ⅳ抑制活性進(jìn)行了初步的探索,發(fā)現(xiàn)白果肽具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性,其中,以白果肽(phenylalanine-alanine-proline-serine-tryptophan,FAPSW和methionine-proline-glycine-proline-proline,MPGPP)表現(xiàn)最優(yōu)。為進(jìn)一步量化其抑制活性,研究其構(gòu)效關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)以FAPSW和MPGPP為原料,通過(guò)體外抑制試驗(yàn)評(píng)估其DPP-Ⅳ抑制活性,并采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù),從分子和原子水平上闡明其抑制機(jī)理。該研究結(jié)果可為白果肽在功能食品領(lǐng)域的開發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ),同時(shí)為白果的高值化利用提供了有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FAPSW和MPGPP多肽由課題組前期鑒定所得[5],并通過(guò)Fmoc固相合成制備,其一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜如圖1所示。

a-FAPSW的一級(jí)質(zhì)譜圖;b-FAPSW的二級(jí)質(zhì)譜圖;c-MPGPP的一級(jí)質(zhì)譜圖;d-MPGPP的二級(jí)質(zhì)譜圖

西他列汀(純度≥97%),阿拉丁試劑有限公司;DPP-Ⅳ篩選試劑盒(MAK203),Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax?i3x熒光多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices公司;CPA225D分析天平,北京賽多利斯儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白果肽DPP-Ⅳ體外抑制實(shí)驗(yàn)

使用DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒測(cè)定FAPSW和MPGPP對(duì)DPP-Ⅳ的抑制活性。將50 μL DPP-Ⅳ溶液與25 μL不同質(zhì)量濃度的多肽(FAPSW和MPGPP)溶液加入到96孔板中,37 ℃孵育10 min。其中,MPGPP的質(zhì)量濃度為0.066、0.132、0.265、0.530、1.060 g/L,FAPSW的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、2.50、3.0、4.0 g/L。待孵育完成后,體系中加入25 μL DPP-Ⅳ反應(yīng)底物,于λ=360 nm激發(fā)波長(zhǎng)和λ=460 nm發(fā)射波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定其熒光強(qiáng)度,檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為30 min,時(shí)間間隔為1 min。西他列汀為陽(yáng)性對(duì)照。多肽對(duì)DPP-Ⅳ的抑制活性計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:F30和F0分別為樣品或空白(緩沖液代替樣品)在30 min時(shí)和0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度;A0和A1分別為空白和樣品的斜率;k為斜率。

1.3.2 分子對(duì)接

根據(jù)ASHOK等[7]描述的方法,采用分子對(duì)接研究多肽(FAPSW和MPGPP)與DPP-Ⅳ之間的相互作用。從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)下載DPP-Ⅳ晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:1wcy)(https://www.rcsb.org/structure/1wcy),通過(guò)Protein Preparation Wizard模塊對(duì)1wcy進(jìn)行去水加氫,補(bǔ)全缺失氨基酸殘基等處理,并利用OPLS4力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行能量最小化。FAPSW和MPGPP的三維結(jié)構(gòu)由pymol(Education version)生成,并通過(guò)LigPrep模塊對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和能量最小化處理,力場(chǎng)選擇為OPLS4。以1wcy自身配體附近的氨基酸殘基作為活性位點(diǎn),盒子中心坐標(biāo)為center_x=55.62,center_y=62.20,center_z=36.88,大小設(shè)置為size_x=10,size_y=10,size_z=10。采用SP-peptide模式(Glide application,Schrodinger)進(jìn)行對(duì)接。Docking score用于評(píng)估配體和受體之間的相互作用強(qiáng)弱。Docking score越低,表示受體與配體結(jié)合得越緊密。

1.3.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

基于SONG等[8]報(bào)道的方法,使用GROMACS 2022.2對(duì)上述多肽-DPP-Ⅳ復(fù)合物進(jìn)行非約束分子動(dòng)力學(xué)模擬以評(píng)估其穩(wěn)定性。采用Amber99sb-ildn力場(chǎng)和TIP3P水模型分別對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化和溶劑化。模擬體系采用周期性立方體盒子。體系中添加適量的Na+以平衡電荷,并采用最陡下降法對(duì)體系進(jìn)行能量最小化。進(jìn)行正式模擬前,在正則系綜和等溫等壓系綜下對(duì)體系進(jìn)行100 ps的預(yù)平衡。模擬溫度和壓力分別設(shè)置為310 K和1 bar。正式模擬的時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為90 ns。

采用分子力學(xué)/泊松-玻爾茲曼表面積(molecular mechanics/Poisson-Boltzmann surface area,MM/PBSA)法計(jì)算多肽與1wcy之間的結(jié)合自由能(ΔGbind),計(jì)算如公式(3)所示:

ΔGbind=ΔEVDW+ΔEelec+ΔGPB+ΔGSA-TΔSS

(3)

式中:ΔEVDW,ΔEelec,ΔGPB,ΔGSA和ΔSS分別為范德華能、靜電能、極性溶劑化能、非極性溶劑化能和構(gòu)象熵;T為溫度,K。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FAPSW和MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性

機(jī)體正常代謝過(guò)程中,食物攝入會(huì)引起胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的釋放,刺激胰腺β細(xì)胞釋放胰島素,從而維持機(jī)體內(nèi)正常血糖水平。DPP-Ⅳ作為一種多功能跨膜糖蛋白和絲氨酸蛋白酶,可迅速降解GLP-1,使機(jī)體血糖升高。抑制DPP-Ⅳ活性可提高GLP-1的水平,從而達(dá)到降血糖的功效[9]。如表1所示,FAPSW和MPGPP具有較好的DPP-Ⅳ抑制活性,其IC50分別為(2.540±0.126)、(0.158±0.009) g/L,雖弱于陽(yáng)性對(duì)照[西他列汀,IC50=(0.037±0.009) g/L],但強(qiáng)于一些已報(bào)道的DPP-Ⅳ抑制肽,如QGQELLPSDFK (IC50=3.89 g/L)[10]、SGVSLAALKKALAAAGYDVEK(IC50=84.19 g/L)和SAPRHGSLGFLPRK(IC50=23.44 g/L)[11]。另外,MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性要強(qiáng)于FAPSW,這可能與MPGPP中N端2號(hào)位上的氨基酸殘基P有關(guān)[12-13]。JIN等[14]研究表明,N端2號(hào)位上存在P的多肽,如LPQ(IC50=82.0 μmol/L)、LPVP(IC50=87.0 μmol/L)和LPY(IC50=87.15 μmol/L),其DPP-Ⅳ抑制活性要強(qiáng)于N端2號(hào)位上不存在P的多肽,如LDKVFR(IC50=128.71 μmol/L),這與本研究結(jié)果一致。

表1 FAPSW、MPGPP和西他列汀的DPP-Ⅳ抑制活性

2.2 分子對(duì)接結(jié)果分析

為進(jìn)一步闡明FAPSW和MPGPP的抑制機(jī)理,采用分子對(duì)接從分子水平上揭示其與DPP-Ⅳ之間的相互作用。MPGPP與DPP-Ⅳ的Docking score為-8.168 kcal/mol,要小于FAPSW(-7.737 kcal/mol),表明MPGPP與DPP-Ⅳ之間的相互作用要強(qiáng)于FAPSW[15]。這與上述多肽的DPP-Ⅳ抑制活性結(jié)果是一致的。JIN等[16]研究表明,Docking score越低的多肽,其DPP-Ⅳ抑制活性更強(qiáng),如YLNF的(Docking score為-3.58 kcal/mol,IC50=146.90 μmol/L)DPP-Ⅳ抑制活性要強(qiáng)于TKLPAVF(Docking score為-2.27 kcal/mol,IC50=242.10 μmol/L),這與本研究結(jié)果一致。

DPP-Ⅳ中存在3個(gè)主要的活性口袋[16]:由催化三聯(lián)體Ser 630-Asp 708/Asn 710-His 740和疏水殘基(Tyr 547、Tyr 631、Trp 659、Tyr 662、Tyr 666、Val 711和Val 656)組成的疏水位點(diǎn)S1、由Glu 205、Glu 206和Arg 125構(gòu)成的電荷口袋S2以及由Val 207、Ser 209、Arg 358和Phe 357組成的活性位點(diǎn)S2′。另外,SAGAR等[17]和WU等[18]發(fā)現(xiàn)Tyr 547和Trp 629對(duì)DPP-Ⅳ活性也有重要影響。如圖2所示,FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ相互作用主要為靜電相互作用、氫鍵、疏水作用和范德華力。YANG等[19]研究表明,靜電相互作用和氫鍵在抑制DPP-Ⅳ活性中起重要作用。如圖2-b和圖2-d所示,FAPSW與Lys 554形成1個(gè)靜電相互作用(Pi-陽(yáng)離子),與S2中的Glu 205和Glu 206共形成2個(gè)靜電相互作用(鹽橋);而MPGPP與S2中的Glu 205和Glu 206分別形成1個(gè)靜電相互作用(鹽橋)。此外,FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ分別形成3個(gè)氫鍵和7個(gè)氫鍵。其中,FAPSW與Glu 205形成一個(gè)碳?xì)滏I,與Glu 206和Tyr 547共形成2個(gè)傳統(tǒng)氫鍵;MPGPP與S1中的Tyr 547、Tyr 631、Tyr 662、Asn 710和S2中的Arg 125共形成6個(gè)傳統(tǒng)氫鍵,與S1中的His 740形成1個(gè)碳?xì)滏I。HE等[20]研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)氫鍵個(gè)數(shù)與多肽的DPP-Ⅳ抑制活性呈正相關(guān),這可以解釋為什么MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性強(qiáng)于FAPSW。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)疏水相互作用也能影響DPP-Ⅳ活性。如圖2-b和圖2-d所示,FAPSW與Lys 554和S2′中的Phe 357分別形成1個(gè)疏水作用力,MPGPP與Lys 554和S1中的Tyr 662、Tyr 666和Tyr 547共形成5個(gè)疏水作用。

a-FAPSW與1wcy的對(duì)接模型;b-FAPSW與1wcy的二維相互作用示意圖;c-MPGPP與1wcy的對(duì)接模型;d-MPGPP與1wcy的二維相互作用示意圖

YANG等[19]研究表明DPP-Ⅳ與抑制劑之間的范德華力可影響DPP-Ⅳ的空間構(gòu)型,從而影響其活性。如圖2-b所示,FAPSW與DPP-Ⅳ中的Arg 560、Arg 358、Ser 209、Trp 201、Asp 663、Tyr 662、Tyr 631、Trp 659、Val 656、Ser 630、Val 711、His 740、Asn 710、Tyr 666、Arg 125、Arg 669、Cys 551、Tyr 585、Ser 552和Gln 553存在范德華力作用;而MPGPP與DPP-Ⅳ中的Gln 553、Ser 552、Trp 629、Ser 630、Val 711、Val 656、Trp 659、Asp 663和Trp 201存在范德華力作用(圖2-d)。因此,FAPSW和MPGPP可通過(guò)范德華力改變DPP-Ⅳ的空間構(gòu)型,從而發(fā)揮其抑制作用。

2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果分析

為進(jìn)一步評(píng)估FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ結(jié)合后形成復(fù)合物的穩(wěn)定性,通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬分析其復(fù)合物的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation,RMSF)、回旋半徑(radius of gyration,Rg)、溶劑可及表面積(solvent accessible surface area,SASA)和結(jié)合自由能。

2.3.1 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSD分析

游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSD值如圖3所示。通常復(fù)合物的RMSD值越小,體系越穩(wěn)定,配體與受體結(jié)合的越緊密[21]。如圖3-a所示,1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSD值在40 ns后趨于穩(wěn)定,表明后續(xù)40～90 ns軌跡可用于下一步分析。FAPSW-1wcy與MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSD值(40～90 ns)分別為(0.243±0.021) nm和(0.221±0.001) nm,小于游離1wcy的RMSD值[(0.253±0.012) nm](圖3-b),表明FAPSW和MPGPP與1wcy結(jié)合后,其復(fù)合物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。SONG等[22]研究表明,YYLVR、YLLVR和YYLLVR結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)后,其復(fù)合物結(jié)構(gòu)的RMSD值要小于游離ACE的RMSD值,表明其復(fù)合物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。這與本研究結(jié)果一致。另外,MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSD值低于FAPSW-1wcy,表明MPGPP-1wcy的穩(wěn)定性要強(qiáng)于FAPSW-1wcy復(fù)合物。這可能是由于MPGPP與1wcy結(jié)合地更緊密。LIU等[23]報(bào)道了相似的結(jié)果,其研究發(fā)現(xiàn),相比于2,6-二羥基苯乙酮-黃嘌呤氧化酶和4-羥基苯乙醇-黃嘌呤氧化酶復(fù)合物,結(jié)合更緊密的4-羥基苯甲醛-黃嘌呤氧化酶復(fù)合物具有更小的RMSD值。

a-0～90 ns;b-40～90 ns

2.3.2 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSF分析

復(fù)合物中蛋白的RMSF能夠反映配體對(duì)受體空間結(jié)構(gòu)的影響。RMSF值越大,說(shuō)明配體對(duì)蛋白的擾動(dòng)越大,復(fù)合物結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。如圖4所示,復(fù)合物FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy的RMSF值分別為(0.121±0.006)和(0.116±0.006) nm,略低于游離1wcy的RMSF值[(0.130±0.008) nm],表明FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性要優(yōu)于游離1wcy。AMIRI等[24]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素結(jié)合α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶后,四環(huán)素-α-淀粉酶和四環(huán)素-α-葡萄糖苷酶復(fù)合物的RMSF值要小于游離α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶,表明其復(fù)合物的穩(wěn)定性要優(yōu)于游離α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶,這與本研究結(jié)果是一致的。此外,MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSF值要低于FAPSW-1wcy,表明MPGPP-1wcy復(fù)合物的穩(wěn)定性要強(qiáng)于FAPSW-1wcy。

圖4 游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的RMSF值

2.3.3 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的Rg分析

Rg常被用來(lái)描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密程度。在復(fù)合物體系中,其值越小,表明配體與蛋白結(jié)合得越緊密,復(fù)合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[25]。如圖5所示,復(fù)合物FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy的Rg值分別為(2.708±0.008)、(2.693±0.001) nm,小于游離1wcy的Rg值[(2.723±0.009) nm],表明FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定強(qiáng)于游離1wcy。這可能是由于FAPSW和MPGPP結(jié)合1wcy后,其復(fù)合物結(jié)構(gòu)更緊密。XU等[26]研究發(fā)現(xiàn),5-咖啡?？崴岷?-咖啡?？崴峤Y(jié)合脂肪酶后,其復(fù)合物的Rg值低于游離脂肪酶的Rg值。這與本研究結(jié)果是一致的。另外,MPGPP-1wcy復(fù)合物的Rg值小于FAPSW-1wcy,表明復(fù)合物MPGPP-1wcy的穩(wěn)定性要強(qiáng)于FAPSW-1wcy,這可以解釋為什么MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性強(qiáng)于FAPSW。

圖5 游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的Rg值

2.3.4 FAPSW與MPGPP結(jié)合1wcy的結(jié)合自由能分析

為進(jìn)一步從能量的角度分析FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的穩(wěn)定性,采用MM/PBSA計(jì)算FAPSW和MPGPP與1wcy之間的結(jié)合自由能。結(jié)合自由能越低,復(fù)合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。如表2所示,MPGPP的結(jié)合自由能(ΔGbind=-76.795 kJ/mol)小于FAPSW的結(jié)合自由能(ΔGbind=-54.015 kJ/mol),表明MPGPP-1wcy復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強(qiáng)于FAPSW-1wcy,這與上述多肽體外DPP-Ⅳ抑制活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。FAPSW-1wcy復(fù)合物中ΔEelec、ΔEVDW、ΔGPB、ΔGSA和TΔSS分別為-419.180、-216.139、598.872、-35.120、-17.552 kJ/mol,表明靜電相互作用在FAPSW與1wcy的結(jié)合中起主導(dǎo)作用;另外,在MPGPP-1wcy復(fù)合物中,ΔEelec、ΔEVDW、ΔGPB、ΔGSA和TΔSS分別為-241.819、-145.758、305.541、-23.902、-29.142 kJ/mol,同樣表明靜電相互作用在MPGPP與1wcy的結(jié)合中起主導(dǎo)作用。

表2 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復(fù)合物的結(jié)合自由能組成 單位:kJ/mol

2.3.5 結(jié)合自由能分解分析

為深入了解1wcy中各個(gè)氨基酸殘基與多肽(FAPSW和MPGPP)之間的相互作用機(jī)制,通過(guò)自由能分解分析其對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn),結(jié)果如圖6所示。在FAPSW結(jié)合1wcy中(圖6-a),1wcy對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基(結(jié)合自由能貢獻(xiàn)<-4 kJ/mol)分別為Arg 560(-11.054 kJ/mol)、Arg 429(-8.273 kJ/mol)、Phe 357(-8.117 kJ/mol)、Tyr 666(-7.999 kJ/mol)和Arg 471(-5.873 kJ/mol)。而對(duì)于MPGPP結(jié)合1wcy(如圖6-b所示),1wcy對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基為(結(jié)合自由能<-4 kJ/mol)為Phe 357(-11.930 kJ/mol)、Tyr 547(-7.531 kJ/mol)、Arg 560(-6.517 kJ/mol)、Lys 554(-5.997 kJ/mol)、Arg 429 (-5.343 kJ/mol)、Trp 629(-4.954 kJ/mol)和Arg 471(-4.270 kJ/mol)。

a-FAPSW-1wcy;b-MPGPP-1wcy

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明,FAPSW和MPGPP均表現(xiàn)出良好的DPP-Ⅳ抑制活性,且MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性IC50=(0.158±0.009) g/L強(qiáng)于FAPSW IC50=(2.540±0.126) g/L。分子對(duì)接結(jié)果表明,FAPSW和MPGPP通過(guò)靜電相互作用、氫鍵、疏水作用和范德華力與DPP-Ⅳ活性位點(diǎn)相結(jié)合,且傳統(tǒng)氫鍵在抑制DPP-Ⅳ活性中起重要作用。分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明,MPGPP-1wcy復(fù)合物的穩(wěn)定性要強(qiáng)于FAPSW-1wcy復(fù)合物,其結(jié)合自由能分別為-76.795、-54.015 kJ/mol。靜電相互作用在FAPSW和MPGPP與1wcy的結(jié)合中起主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果不僅豐富了降糖肽庫(kù),同時(shí)為銀杏白果源多肽(FAPSW和MPGPP)在功能食品領(lǐng)域的開發(fā)和利用提供科學(xué)參考。