lncRNA RMRP 通過JAK/STAT 信號通路在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡中的作用研究

方秋滿,鄧青春,周小飛,黃從妹 （海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦科，海南 ?？?570311）

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。目前，由于治療技術的不斷進步，早期子宮內(nèi)膜癌患者的預后良好。然而，許多子宮內(nèi)膜癌患者在確診時已是晚期，而現(xiàn)有的治療措施對此類患者無效，導致5 年生存率較低[1]。因此，探索子宮內(nèi)膜癌的分子發(fā)病機制并尋找更有效的治療靶點，對改善子宮內(nèi)膜癌的治療效果具有重要意義。隨著分子生物學和基因診斷技術的快速發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，可作為腫瘤的特異性生物標志物[2]。研究證實，lncRNA 在子宮內(nèi)膜癌中存在差異表達，并參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的多種惡性過程[3-4]。近期有研究報道，線粒體處理RNA 的內(nèi)切酶復合物RNA 組分（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）參與調(diào)控乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤的進展[5-6]。然而，lncRNA RMRP 在子宮內(nèi)膜癌中的作用及機制尚不明確。有研究報道，在子宮內(nèi)膜癌中，Janus 激酶/信號轉導與轉錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路參與癌細胞的遷移、生長、凋亡及分化等進程[7]。因此，本研究分析lncRNA RMRP 在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞中的表達水平，探討其是否通過調(diào)控JAK/STAT 信號通路參與子宮內(nèi)膜癌的進展，并分析其相關分子機制，以期為子宮內(nèi)膜癌診斷和治療尋找新的生物標志物和潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

正常子宮內(nèi)膜細胞系HESC 細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A 細胞（中國科學院細胞研究所）；TRIzol?試劑（美國Invitrogen 公司）；PrimeScript?RT 試劑盒（日本Takara 公司）；CCK-8 試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；雙熒光素酶報告基因試劑盒（北京普洛麥格生物技術有限公司）；兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 單克隆抗體以及山羊抗兔IgG(H+L)二抗（美國Abcam 公司）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；流式細胞儀（美國BD 公司）；酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；引物設計和合成委托上海生工生物完成。

1.2 方法

1.2.1 臨床組織樣本收集 納入2021 年7 月至2022年3月在我院經(jīng)組織活檢和組織病理學分析確診為子宮內(nèi)膜癌的30例患者，在其接受手術治療時收集子宮內(nèi)膜癌組織標本，并在距離癌組織5 cm 處收集癌旁組織標本。納入標準：①符合《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南(第四版)》中子宮內(nèi)膜癌的相關診斷標準，經(jīng)子宮內(nèi)膜組織活檢和組織病理學分析確診；②初次確診；③生存期超過3 個月，且臨床資料完整。排除標準：①接受過抗癌治療，包括免疫抑制劑和/或性激素等相關治療；②合并其他惡性腫瘤；③合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥等子宮良性疾??；④合并重要臟器疾??；⑤合并糖尿病和/或其他感染性疾病。本研究方案已由我院倫理委員會批準（202106-03）。所有入選患者均簽署手術知情同意書。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 將正常子宮內(nèi)膜細胞系HESC 和子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A 分別培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素），置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HEC-1-A 細胞（4×105個/孔）接種至24 孔板中，待細胞融合度達到80%時，根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑說明書分別將空載體、pcDNA-RMRP、NC-siRNA、RMRP-siRNA、NC mimic、miR-580-3p mimic、pcDNA-RMRP+NC mimic、pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic、RMRP-siRNA+空載體、RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2、NC inhibitor 和miR-580-3p inhibitor 轉染至HEC-1-A 細胞中，分為空載體組、pcDNA-RMRP 組、NC-siRNA 組、RMRP-siRNA 組、NC mimic 組、miR-580-3p mimic 組、pcDNA-RMRP+NC mimic 組、pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic 組、RMRPsiRNA+空載體組、RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 組、NC inhibitor 組、miR-580-3p inhibitor 組，轉染48 h 后收集細胞。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖率 將各組轉染后的細胞以4×103個/孔的密度接種到96 孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)。孵育0 h、24 h、48 h和72 h 后，分別加入10 μL CCK-8 溶液，然后放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm 波長下的吸光度值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 使用胰蛋白酶消化各組轉染后的細胞，加入完全培養(yǎng)液重懸細胞，離心，棄上清。每個樣本中加入Binding Buffer 重懸，然后加入5 μL Annexin V-FITC，在4 ?C下避光染色15 min。然后加入5 μL PI，在4 ?C 下孵育5 min。流式細胞儀上機檢測，用FlowJo軟件分析細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR 檢測lncRNA RMRP、miR-580-3p 表達 使用TRIzol?試劑分離提取組織和細胞的RNA，然后在微量分光光度計NanoDrop 2000 上檢測RNA 濃度以及OD260/OD280，如果OD260/OD280為1.8~2.0，可繼續(xù)進行下一步實驗。使用PrimeScript?RT 試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。隨后使用SYBR Green 試劑盒在PCR 儀上進行PCR 擴增反應，反應條件為：95 °C 30 s，95 °C 5 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。lncRNA RMRP 上游引物(5′-3′)：GCTGAAGGCCTGTATCCTAG,下游引物(5′-3′)：GCTCAGCGGGATACGCTTC；GAPDH 上游引物(5′-3′)：ATTTTGGAGGGATCTCGCTC,下游引物(5′-3′)：CAACGGATTTGGTCGTATTG；miR-580-3p 上游引物(5′-3′)：AAAATTTCCAATTGGAACC,下游引物(5′-3′)：AAGCAGGGTCCGAGGT；U6 上游引物(5′-3′)：GCTTCGGCAGCACATATAC,下游引物(5′-3′)：ATTTGCGTGTCATCCTTGC。

1.2.6 Western blot 檢測JAK/STAT 信號通路蛋白表達 收集各組轉染后的細胞，加入RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，在冰上操作。隨后使用BCA 試劑盒檢測蛋白樣品濃度。制備SDS-PAGE 電泳分離膠及濃縮膠，將蛋白樣品加入到凝膠孔中，進行恒壓電泳，然后轉移到PVDF 膜上。轉膜結束后，將膜置于5%的脫脂牛奶封閉液中封閉1 h。然后加入一抗，在4 ℃冰箱過夜。PBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育90 min。最后用ECL 化學發(fā)光液顯影，用Image J 軟件檢測免疫印跡條帶的灰度值，計算目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。抗體工作液稀釋度如下：兔抗人一抗JAK2（1:2 000 稀釋）、p-JAK2（1:1 500 稀釋）、STAT3（1:2 000 稀釋）、p-STAT3（1:1 500 稀釋），山羊抗兔IgG(H+L)二抗（1:5 000稀釋）。

1.2.7 生物信息學分析 使用TargetScanHuman v7.2 網(wǎng)頁版（https://www. targetscan. org/vert_72/）對lncRNA RMRP 與miR-580-3p 的直接序列互作位點、miR-580-3p與JAK2 3′-UTR的直接序列互作位點進行分析和預測。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧謩e驗證 miR-580-3p 與lncRNA RMRP、JAK2 3′-UTR 之間的靶向序列直接互作關系。將RMRP、JAK2 野生型（WT）或突變型（MUT）3'-UTR序列分別插入pGL3 載體中，構建lncRNA RMRP-WT或lncRNA RMRP-MUT、JAK2-WT 或JAK2-MUT 報告基因載體。按照說明書的方法使用Lipofectamine 2000試劑將lncRNA RMRP-WT 或lncRNA RMRP-MUT、JAK2-WT 或JAK2-MUT 與NC mimic 或miR-580-3p mimic共轉染至細胞中。48 h后收集細胞，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，Studentt檢驗用于分析2組間的差異，單因素方差分析用于多組間比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA RMRP 在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞中的表達

RT-qPCR 實驗顯示，與癌旁組織比較，lncRNA RMRP在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達顯著升高（P<0.05），見圖1a。與HESC細胞比較，lncRNA RMRP在HEC-1-A細胞中的表達顯著升高（P<0.05），見圖1b。以上研究結果提示，lncRNA RMRP 可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。

圖1 lncRNA RMRP在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞中的表達

2.2 過表達或敲低lncRNA RMRP 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響

與NC-siRNA 組比較，RMRP-siRNA 組細胞中l(wèi)ncRNA RMRP的表達顯著降低（P<0.05）；與空載體組比較，pcDNA-RMRP 組細胞中l(wèi)ncRNA RMRP 的表達顯著升高（P<0.05），見圖2a、b。CCK-8 和流式細胞術實驗結果顯示，與NC-siRNA 組比較，RMRP-siRNA 組細胞增殖率降低（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05）；與空載體組比較，pcDNA-RMRP 組細胞增殖率升高（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），見圖2c~f。以上研究結果表明，過表達lncRNA RMRP 可顯著促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，抑制細胞凋亡；敲低lncRNA RMRP可顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

圖2 過表達或敲低lncRNA RMRP對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響

2.3 lncRNA RMRP靶向并調(diào)控miR-580-3p的表達

通過生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)，lncRNA RMRP 可能含有miR-580-3p 的潛在結合位點（圖3a）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示，與NC mimic 組比較，miR-580-3p mimic 組lncRNA RMRP-WT 報告基因載體的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而lncRNA RMRP-MUT 報告基因載體的熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖3b。RT-qPCR 實驗結果顯示，與NC-siRNA 組相比，RMRP-siRNA 組miR-580-3p水平顯著升高（P<0.05），見圖3c；而與空載體組比較，pcDNA-RMRP 組miR-580-3p 水平顯著降低（P<0.05），見圖3d。以上研究結果表明，lncRNA RMRP 可靶向并負調(diào)控miR-580-3p的表達。

圖3 lncRNA RMRP靶向并調(diào)控miR-580-3p的表達

2.4 miR-580-3p靶向并調(diào)控JAK2的表達

通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-580-3p 與下游靶基因JAK2 的3′-UTR 可能含有潛在的結合位點（圖4a）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示，與NC mimic 組比較，miR-580-3p mimic 組JAK2-WT 報告基因載體的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而JAK2-MUT 報告基因載體的熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學差異（P>0.05），見圖4b。Western blot 實驗結果顯示，與NC mimic 組比較，miR-580-3p mimic 組細胞中JAK2 蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖4c；而與NC inhibitor組比較，miR-580-3p inhibitor 組細胞中JAK2 蛋白水平顯著升高（P<0.05），見圖4d。以上研究結果表明，miR-580-3p可靶向并負調(diào)控JAK2的表達。

圖4 miR-580-3p靶向并調(diào)控JAK2的表達

2.5 lncRNA RMRP 通過靶向miR-580-3p 調(diào)控JAK/STAT信號通路

Western blot 結果顯示，與空載體組比較，pcDNARMRP 組細胞中JAK2、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平變化則無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與pcDNARMRP+NC mimic 組比較，pcDNA-RMRP+miR-580-3p mimic 組細胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平變化則無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖5。以上研究結果表明，lncRNA RMRP 可能作為miR-580-3p的競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）激活JAK/STAT信號通路。

圖5 lncRNA RMRP通過靶向miR-580-3p調(diào)控JAK/STAT信號通路

2.6 lncRNA RMRP 通過JAK/STAT 信號通路對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響

Western blot 結果顯示，與NC-siRNA 組比較，RMRP-siRNA組細胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3蛋白水平顯著降低（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平變化無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與RMRP-siRNA+空載體組比較，RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 組細胞中JAK2、p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平顯著升高（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平變化無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；此外，與RMRPsiRNA+空載體組比較，RMRP-siRNA+pcDNA-JAK2 組細胞增殖率升高（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），見圖6。

圖6 lncRNA RMRP通過JAK/STAT信號通路對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率持續(xù)上升。研究表明，lncRNA 可作為潛在的腫瘤標志物和治療的新靶點[8]。lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA 的形式在不同水平（表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控、轉錄后調(diào)控等）調(diào)控基因表達。隨著臨床和細胞實驗的深入研究，lncRNA 已被證明是一種具有多種生物學功能的非編碼RNA，其在細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9]。之前的研究已經(jīng)揭示了lncRNA 在子宮內(nèi)膜癌中的關鍵作用。例如，lncRNA TTN-AS1 通過靶向miR-376a-3p/PUM2 軸促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和轉移[10]。lncRNA RHPN1-AS1 通過激活ERK/MAPK 通路促進子宮內(nèi)膜癌進展[11]。RMRP 位于人染色體9p13.3上，由10 個不同的亞基和1 個RNA 分子組成，共有277 個nts，其廣泛參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。lncRNA RMRP 通過靶向miR-206 促進膀胱癌細胞侵襲、遷移和增殖[12]。lncRNA RMRP 通過miR-613/NFAT5 軸促進非小細胞肺癌細胞的侵襲、遷移和增殖[13]。然而，lncRNA RMRP 是否在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA RMRP 在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞中的表達均顯著升高；進一步功能實驗顯示，過表達lncRNA RMRP 可顯著促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，抑制細胞凋亡；反之，敲低lncRNA RMRP 可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，促進細胞凋亡。以上研究結果提示，lncRNA RMRP 與子宮內(nèi)膜癌的進展密切相關，可能成為診斷和治療子宮內(nèi)膜癌的潛在靶點。

ceRNA 假說揭示了一種全新的基因表達調(diào)控模式，lncRNA 可作為ceRNA 與miRNA 相互作用參與下游靶基因的調(diào)控，通過ceRNA 假說可以更好地理解基因調(diào)控網(wǎng)絡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。例如，lncRNA SNHG16 可作為ceRNA 調(diào)控miR-520/VEGF 軸促進肺癌細胞的遷移[14]?；谶@一理論，越來越多的研究表明，lncRNA RMRP 可以通過海綿化miRNA 來影響腫瘤的發(fā)生和進展，如miR-206、miR-1-3p、miR-613 等已被鑒定為各種類型癌癥中l(wèi)ncRNA RMRP 的作用靶點[15-17]。研究報道，lncRNA RMRP通過調(diào)控miR-580-3p/MICU1信號通路提高卵巢癌對紫杉醇的敏感性[18]。然而，lncRNA RMRP 是否海綿化miR-580-3p在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了lncRNA RMRP 與miR-580-3p 靶向結合；進一步實驗表明了miR-580-3p 的表達與lncRNA RMRP 的表達呈負相關。以上研究結果表明lncRNA RMRP可靶向并負調(diào)控miR-580-3p的表達。

JAK/STAT信號通路是經(jīng)典的致癌信號通路，可誘導癌細胞遷移、生長和分化[19]。各種配體（如細胞因子）與細胞表面受體的結合引起受體分子二聚化，從而使得與受體偶聯(lián)的JAK 相互接近，然后通過酪氨酸殘基上的相互磷酸化激活JAK，活化的JAKs 磷酸化STATs 的酪氨酸殘基并導致STATs 活化，參與腫瘤進展的調(diào)控[20]。研究表明，JAK/STAT 信號通路，尤其是JAK2 和STAT3，可通過提高c-myc 水平刺激細胞增殖[21]。JAK2/STAT3 信號通路作為經(jīng)典的致癌信號通路，在調(diào)控子宮內(nèi)膜癌進展中發(fā)揮著重要作用[22]。本研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示，JAK2 為miR-580-3p的潛在靶點；進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-580-3p可負向調(diào)控JAK2 的蛋白表達。本研究還揭示了lncRNA RMRP 對JAK/STAT 信號通路的調(diào)控作用，lncRNA RMRP 過表達后JAK2、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著升高，而miR-580-3p mimic 處理細胞后可逆轉lncRNA RMRP 對JAK/STAT 信號通路的調(diào)控作用；功能實驗進一步表明，lncRNA RMRP 敲低顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，而JAK2 過表達顯著逆轉了這一結果。雖然大量lncRNAs被認為是子宮內(nèi)膜癌的診斷和預后標志物以及治療靶點，但由于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制復雜，更多參與子宮內(nèi)膜癌的分子機制還有待進一步探索。

綜上所述，本研究表明敲低lncRNA RMRP 通過靶向miR-580-3p 和調(diào)控JAK/STAT 信號通路抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。這一研究結果闡明了lncRNA RMRP/miR-580-3p/JAK/STAT 軸與子宮內(nèi)膜癌進展的關系，提示了lncRNA RMRP 在子宮內(nèi)膜癌治療中的潛在價值，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的治療靶點和新思路。