IL-35下調(diào)CD36表達減少巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)積累緩解動脈粥樣硬化的機制研究*

李晟，茅光耀，葛若木，李凱園，朱莉

（1.大連醫(yī)科大學 研究生院，遼寧 大連 116044；2.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）是一種由脂質(zhì)引起的慢性炎癥、纖維增生性疾病[1]。動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是CHD的發(fā)病基礎(chǔ)，主要特征是血管內(nèi)脂質(zhì)的異常積聚和炎癥反應的形成[2-3]。研究表明，人類白細胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）、A類清道夫受體（scavenger receptor class A，SR-A）和凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1（low-density lipoprotein receptor-1，Lox-1）等清道夫受體介導巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）功能異常，會導致泡沫細胞異常積聚，與AS病變密切相關(guān)[4-6]。

白細胞介素-35（Interleukin-35，IL-35）是由CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞分泌的異二聚體細胞因子，由EB病毒誘導基因3和p35 2個亞單位組成[7-8]。IL-35具有抗AS活性，CHD患者血清IL-35水平顯著下降，并與Gensini積分和冠狀動脈病變血管數(shù)呈負相關(guān)[9-11]。外源性IL-35可增加ApoE-/-小鼠Treg細胞水平，縮小AS斑塊尺寸[12]。然而，IL-35對CD36、SR-A和Lox-1等清道夫受體表達的影響，以及脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用機制仍需進一步研究。本研究旨在分析CHD患者血清IL-35水平與血脂四項的相關(guān)性，分析IL-35對人髓系白血病單核細胞（human myeloid leukemia mononuclear cells，THP-1）源性巨噬細胞脂代謝的影響及對p38 MAPK信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2022年6月—2023年6月在泰州人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的疑似CHD患者。隨機選取154例，根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果分為CHD組（86例）和對照組（68例），收集性別、年齡、身高、吸煙史、血壓、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB），總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、血糖（Glucose，GLU）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等指標。排除標準：①存在心肌病和瓣膜性心臟?。虎诨加屑毙曰蚵詡魅静『妥陨砻庖咝约膊。虎奂谞钕俟δ芸哼M或減退；④肝腎功能不全，消化、血液系統(tǒng)疾??；⑤使用汀類藥物治療＞ 1周；⑥近期有手術(shù)或外傷史；⑦病歷資料不完整。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號：KY202311401），所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

THP-1細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），特異性抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司），膽固醇檢測試劑盒、油紅染色試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），NBD-膽固醇、IL-35、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）（美國R＆D公司），IL-35酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。熒光PCR儀（美國羅氏公司），酶標儀（美國BioTek公司）、熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 血液標本采集及IL-35測定

使用EDTA 2K抗凝管采集所有研究對象空腹狀態(tài)靜脈血，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液于-80℃冰箱備用。按照試劑盒說明書進行操作測定IL-35水平。設(shè)置空白孔、標準品孔和樣品孔，在450 nm波長處測定各孔的光密度（optical density，OD），用標準品濃度與OD值擬合直線方程，再將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度。

1.4 THP-1細胞制備及IL-35最適濃度的確定

THP-1細胞在含有10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周（37 ℃、5%二氧化碳CO2），100 nmol/L PMA處理THP-1細胞48 h，使其分化為巨噬細胞。取巨噬細胞分為4組：①對照組：5 μmol/L DMSO培養(yǎng)細胞7 d；②oxLDL組：5 μmol/L DMSO培養(yǎng)細胞7 d后，50 μg/mL oxLDL繼續(xù)培養(yǎng)48 h；③低劑量組：20 ng/mL IL-35培養(yǎng)7 d后，50 μg/mL oxLDL繼續(xù)培養(yǎng)48 h；④高劑量組：40 ng/mL IL-35培養(yǎng)7 d后，50 μg/mL oxLDL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

按照試劑盒說明書步驟對各組細胞進行油紅染色，測定各組細胞內(nèi)TC、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）和膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）水平。根據(jù)染色和測定結(jié)果確定IL-35最適實驗濃度。

1.5 NBD-膽固醇評估細胞內(nèi)膽固醇的攝取

實驗組用IL-35進行預處理，以未加藥組為對照組，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，加入5 μmol/L NBD-膽固醇后2、4、6、8和10 h在免疫熒光顯微鏡下進行拍攝，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)NBD-膽固醇呈深綠色。使用RIPA裂解細胞并收集裂解液，在469和537 nm波長處測定熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）定量評估兩組NBD-膽固醇的攝取情況。

1.6 Western blotting檢測CD36、SR-A、Lox-1、p38、p-p38蛋白的表達

IL-35組用IL-35預處理7 d；以未加藥組為對照組；實驗組用IL-35預處理7 d后加入50 μg/mL oxLDL共培養(yǎng)48 h；oxLDL組用5 μmol/L DMSO培養(yǎng)THP-1細胞7 d后，50 μg/mL oxLDL繼續(xù)培養(yǎng)48 h；P79350組加入P79350預處理24 h后按實驗組步驟處理。提取細胞蛋白，加入Loading Buffer，95 ℃金屬浴變性5 min。采用SDS-PAGE電泳將蛋白分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶密封2 h。4 ℃條件下一抗孵育過夜后與二抗在室溫下孵育2 h，用化學發(fā)光法檢測目的蛋白。使用Image J軟件分析蛋白相對表達量。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測CD36、SRA和Lox-1 mRNA的表達

細胞分組同1.6。提取THP-1細胞總RNA，取500 ng逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）反應體系：2 μL cDNA，正反向引物各1 μL（10 μm），SYBR green 10 μL，H2O 6 μL；反應條件：95 ℃預變性3 s，95 °C變性30 s，60 ℃退火1 min，共計40個循環(huán)，記錄Ct值。采用2-ΔΔCT法計算CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相對表達量。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與CHD組臨床資料比較

對照組與CHD組的年齡、吸煙史、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、TG、HDL-C、CK、CK-MB、CRP水平比較，經(jīng)χ2或t檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CHD組年齡、TG、CK、CK-MB、CRP水平均高于對照（P＜0.05），而HDL-C水平和BMI均低于對照組（P＜0.05）。對照組與CHD組的性別構(gòu)成、高血壓、高脂血癥、SBP、DBP、GLU、TC、LDL-C、LVEF比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 對照組與CHD組臨床資料比較

2.2 CHD組與對照組血清IL-35水平比較及與血脂四項的相關(guān)性

CHD組、對照組血清IL-35水平分別為（42.76±13.79）、（109.45±28.87）pg/mL，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=-17.805，P=0.000）；CHD組血清IL-35水平低于對照組。

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，CHD患者血清IL-35水平與TC、LDL-C、TG均呈負相關(guān)（rs=-0.321、-0.218和-0.215，P=0.003、0.044和0.047），與HDL-C呈正相關(guān)（rs=0.322，P=0.003）。

2.3 各組油紅染色結(jié)果和細胞內(nèi)膽固醇水平比較

油紅染色結(jié)果顯示對照組THP-1細胞內(nèi)無紅染，oxLDL組細胞內(nèi)脂滴增多，紅染加重。低劑量組與oxLDL組比較，細胞內(nèi)紅染面積無顯著變化。高劑量組與oxLDL組和低劑量組比較，細胞內(nèi)脂滴明顯減少，紅染減輕。見圖1。

圖1 各組THP-1細胞油紅染色 （×200）

對照組、oxLDL組、低劑量組、高劑量組THP-1細胞內(nèi)TC、FC、CE水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，oxLDL組TC、FC、CE均升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組TC、FC、CE均降低（P＜0.05）。40 ng/mL IL-35能有效減少泡沫細胞的形成和脂質(zhì)的積聚，故將此濃度作為后續(xù)實驗使用濃度。見表3。

表3 各組THP-1細胞內(nèi)TC、FC、CE水平比較（μmol/mgrot，±s）

表3 各組THP-1細胞內(nèi)TC、FC、CE水平比較（μmol/mgrot，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與oxLDL組比較，P＜0.05；③與低劑量組比較，P＜0.05。

CE 3.92±0.26 27.10±2.64①24.00±2.26①9.03±0.7①②③161.000 0.000組別對照組oxLDL組低劑量組高劑量組F 值P 值TC 5.42±0.16 35.94±2.5①32.00±3.08①13.71±0.61①②③158.100 0.000 FC 1.50±0.16 8.84±0.16①8.00±1.03①4.68±1.29①②③13.670 0.002

2.4 對照組與實驗組THP-1細胞對NBD-膽固醇的攝取

實驗組與對照組THP-1細胞內(nèi)NBD-膽固醇隨著時間增加逐漸增加。在各時間點，實驗組與對照組比較，細胞內(nèi)NBD-膽固醇含量均明顯減少。見圖2。

圖2 對照組與實驗組THP-1細胞對NBD-膽固醇的攝取 （×200）

對照組與實驗組THP-1細胞2、4、6、8和10 h的FI比較，經(jīng)重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點FI比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=726.726，P=0.000）；②實驗組與對照組FI比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.102，P=0.012），實驗組FI較低；③兩組FI變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=111.061，P=0.000）。見表4。

表4 對照組與實驗組THP-1細胞不同時間點FI比較 （±s）

表4 對照組與實驗組THP-1細胞不同時間點FI比較 （±s）

組別對照組實驗組2 h 1 536.7±143.3 967.7±83.0 4 h 3 207.0±149.3 2 035.0±88.3 6 h 4 665.0±127.9 3 421.3±100.1 8 h 5 048.3±310.2 3 791.0±182.7 10 h 5 092.7±152.9 3 863.3±232.7

2.5 各組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相對表達量比較

對照組、IL-35組、oxLDL組、實驗組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；oxLDL組和實驗組CD36、SR-A、Lox-1蛋白相對表達量均高于對照組和IL-35組（P＜0.05），實驗組CD36蛋白相對表達量低于oxLDL組（P＜0.05）。見表5和圖3。

圖3 各組THP-1細胞CD36、SR-A、Lox-1蛋白的表達量

表5 各組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相對表達量比較 （±s）

表5 各組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與IL-35組比較，P＜0.05；③與oxLDL組比較，P＜0.05。

Lox-1蛋白0.65±0.01 0.76±0.12 1.17±0.19①②1.01±0.09①②11.270 0.003組別對照組IL-35組oxLDL組實驗組F 值P 值CD36蛋白0.63±0.09 0.40±0.02①1.29±0.14①②1.08±0.09①②③113.800 0.000 SR-A蛋白0.40±0.02 0.50±0.03 1.18±0.13①②0.99±0.11①②56.840 0.000

2.6 各組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相對表達量比較

對照組、IL-35組、oxLDL組、實驗組THP-1細胞CD36、SR-A和Lox-1 mRNA相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；oxLDL組和實驗組CD36、SR-A Lox-1 mRNA相對表達量均高于對照組和IL-35組（P＜0.05），實驗組CD36 mRNA相對表達量低于oxLDL組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組THP-1細胞CD36、SR-A、Lox-1 mRNA相對表達量比較 （±s）

表6 各組THP-1細胞CD36、SR-A、Lox-1 mRNA相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與IL-35組比較，P＜0.05；③與oxLDL組比較，P＜0.05。

Lox-1 mRNA 1.00±0.05 0.93±0.05 3.27±0.21①②3.19±0.28①②159.800 0.000組別對照組IL-35組OxLDL組實驗組F 值P 值CD36 mRNA 1.00±0.04 0.81±0.07①1.88±0.09①②1.50±0.05①②③161.200 0.000 SR-A mRNA 1.04±0.39 0.89±0.35 3.02±0.65①②2.66±0.35①②17.270 0.000

2.7 各組THP-1細胞p-p38/p38蛋白相對表達量比較

對照組、IL-35組、oxLDL組、實驗組THP-1細胞p-p38/p38蛋白相對表達量分別為（0.23±0.06）、（0.23±0.07）、（1.48±0.2）、（0.91±0.11），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=74.000，P=0.000）；oxLDL組和實驗組p-p38/p38蛋白相對表達量均高于對照組和IL-35組（P＜0.05），實驗組p-p38/p38蛋白相對表達量低于oxLDL組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各THP-1細胞p-p38/p38蛋白的表達

2.8 各組THP-1細胞CD36蛋白相對表達量比較

對照組、oxLDL組、實驗組、P79350組THP-1細胞CD36蛋白相對表達量分別為（0.63±0.09）、（1.29±0.14）、（1.08±0.00）、（1.17±0.11），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.090，P=0.000）；oxLDL組、實驗組、P79350組CD36蛋白相對表達量均高于對照組（P＜0.05），oxLDL組和P79350組CD36蛋白相對表達量均高于實驗組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組THP-1細胞CD36蛋白的表達

3 討論

AS是CHD患者最基本的病理變化，主要特點是動脈壁脂質(zhì)的積累和炎癥的發(fā)展。AS病變發(fā)展的早期階段被稱為“脂肪條紋”，其特征是泡沫細胞在細胞內(nèi)積聚脂質(zhì)[13-14]，研究表明，白細胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）家族因子與急性心肌梗死、主動脈夾層、心肌肥厚等多種心血管疾病密切相關(guān)[15-17]，在AS的發(fā)生、發(fā)展過程和泡沫細胞的形成中發(fā)揮重要作用[18]，IL-35為IL-12家族一員，可作為抗炎因子參與自身免疫性炎癥疾病，如狼瘡性腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生、發(fā)展[19-21]。最近研究顯示，IL-35高表達可以延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展，調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)蛋白基因或非編碼RNA的表達[22-24]。本研究首先通過分析CHD患者血清IL-35水平與血脂四項的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CHD患者血清IL-35水平與HDL-C呈正相關(guān)，與TC、TG，LDL-C均呈負相關(guān)。

本研究通過油紅染色和THP-1內(nèi)膽固醇檢測明確IL-35對泡沫細胞的形成有抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)40 ng/mL IL-35能有效抑制THP-1細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，故將40 ng/mL作為本實驗的使用濃度。脂質(zhì)的攝取是泡沫細胞形成的重要環(huán)節(jié)，THP-1細胞對脂質(zhì)的攝取主要由清道夫受體CD36、SR-A和Lox-1介導。本研究通過NBD-膽固醇攝取實驗來測定不同時間點實驗組與對照組細胞FI，結(jié)果顯示在相同時間點，實驗組細胞FI明顯低于對照組。Western blotting和qRT-PCR檢測與脂質(zhì)攝取相關(guān)的清道夫受體（CD36、SR-A和Lox-1）蛋白和mRNA的表達發(fā)現(xiàn)，IL-35顯著降低了oxLDL誘導的CD36蛋白和mRNA表達，而SR-A和Lox-1的表達無顯著變化，提示IL-35可能是通過下調(diào)清道夫受體CD36的表達來抑制THP-1細胞對脂質(zhì)的攝取。

p38 MAPK信號傳導在多種生物過程中起重要作用，例如炎癥、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞死亡、發(fā)育、分化和衰老[25-27]。既往研究表明p38 MAPK通路與AS、心臟重構(gòu)、心肌肥大和纖維化密切相關(guān)，是心血管疾病的治療靶點[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)oxLDL處理THP-1細胞48 h后，細胞p38總蛋白無顯著變化，而p-p38/p38表達上調(diào)，而經(jīng)IL-35預處理7 d后p-p38/p38表達下調(diào)，提示p38磷酸化水平被IL-35抑制。添加P79350作為p38 MPAK通路激動劑進行預處理后，P79350逆轉(zhuǎn)了IL-35對oxLDL誘導的細胞所表現(xiàn)出的作用，CD36的表達顯著升高。因此，推測IL-35可能使p38 MAPK信號通路失活，降低p38的磷酸化水平，從而抑制清道夫受體CD36的表達，最終抑制THP-1細胞對脂質(zhì)的攝取和泡沫細胞的形成。

綜上所述，本研究驗證了CHD患者血清IL-35水平與血脂四項有相關(guān)性。體外實驗驗證IL-35通過下調(diào)清道夫受體CD36的表達從而減少THP-1細胞對脂質(zhì)的積聚和泡沫細胞的形成，可能與IL-35下調(diào)p38 MAPK信號通路有關(guān)。本課題組僅在細胞水平驗證IL-35對THP-1細胞的影響，IL-35在動物模型上是否存在相同的機制，仍需進一步探索。