三仁湯對肝纖維化模型大鼠血清炎癥因子及血小板衍生生長因子的影響※

隆衛(wèi)陽 李墨辭 吳同玉，2▲

肝纖維化的主要致病因素有病毒性肝炎（如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎）、非酒精性脂肪性肝病、飲酒、自身免疫性肝炎等。在各種病因的持續(xù)刺激下，肝細胞中以Ⅰ型膠原纖維為主導的細胞外基質在肝實質中過度沉積，導致肝纖維化[1]。肝纖維化可出現在大多數慢性肝病中，肝纖維化的過程中通過細胞因子加劇了機體的炎癥反應，從而肝內微循環(huán)失調，而肝纖維化長時間持續(xù)，有可能會發(fā)展成為肝硬化[2]。有研究[3]指出，肝纖維化與肝病進展相關，肝纖維化是影響肝病預后和肝細胞癌（HCC）風險的關鍵因素。

肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的病理過程，其中的關鍵環(huán)節(jié)是肝星狀細胞（HSC）的激活[4]。HSC的活化與促炎或促纖維化因子等密切相關[5]。梁文杰等[6]認為，Kupffer 細胞、肝細胞可直接激活HSC，釋放轉化生長因子（TGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等促纖維化因子，以及釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等炎性因子，參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程。目前，西醫(yī)治療肝纖維化雖可減輕肝臟炎癥，但效果欠佳，而中醫(yī)藥抗肝纖維化已取得不錯的成效[7]。

為進一步研究中藥的作用機制，筆者以化學性損傷（腹腔注射0.5%二甲基亞硝胺溶液1.6 mL/kg，每周連續(xù)2 d，共持續(xù)4 w）建立肝纖維化大鼠模型，并以具有明顯抑制肝纖維化作用的藥物秋水仙堿[8]作為對照，探討三仁湯對肝纖維化模型大鼠炎癥因子及血小板衍生生長因子的影響，以此為臨床應用三仁湯防治肝纖維化提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物由上海斯萊克動物有限責任公司提供，為無特定病原體的SPF 級Wistar 大鼠，6 w 齡，雄性，體質量（200±20） g，共48 只，許可證號為SCXK（瀘）2018-0006。實驗開始前已通過福建中醫(yī)藥大學倫理委員會審核，批準文號：FJTCM IACUC 2021010。所有大鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，許可證號為SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥品三仁湯藥物組成：杏仁15 g，白蔻仁6 g，薏苡仁18 g，法半夏15 g，滑石18 g，通草6 g，淡竹葉6 g，厚樸6 g。按現代藥理學方法，用8 倍中藥質量的蒸餾水浸泡中藥30 min，武火煮沸后文火再煎約40 min，連續(xù)2次后去滓合并。根據人與大鼠的劑量換算公式（大鼠以每只200 g 體質量計算），水浴加熱蒸發(fā)濃縮為4.1 g·kg-1、8.2 g·kg-1以及16.4 g·kg-1三個濃度，配好后于4 ℃冰箱保存。云南昊邦制藥有限公司生產的秋水仙堿片（國藥準字H5302798，批號：200614/1）。上海羅恩試劑科技有限公司生產的二甲基亞硝胺（DMN），RO 51263，規(guī)格：5 mL。

1.3 試劑蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（廠家：珠海貝索BASO；批號：BA4025）；MASSON 染色試劑盒（廠家：珠海貝索BASO；批號：BA4079）；IL-1β ELISA試劑盒（貨號：EK0393；批號：11517741011）；PDGFBB ELISA 試 劑 盒（ 貨 號：EK1698；批 號：123817921011）；IL-10 ELISA 試劑盒（貨號：EK0418；批號：13817591011）；TNF-α ELISA 試劑盒（貨號：EK0526；批號：24017791011）；IL-6 ELISA 試劑盒（貨號：EK0412；批號：1331790101）。ELISA 試劑盒生產廠家均為武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器恒溫箱（型號：DNP-9052，上海精宏試驗設備有限公司）；洗板機（型號：PW-812，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；高速離心機（型號：SH01D，上海知信實驗儀器技術有限公司）；漩渦混合器（批號：XH-C，江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司）；酶標儀（型號：Tecan Infinite F50，瑞士）；組織包埋機（型號：Leica EG1150H，德國）；半自動切片機（型號：Leica RM2245， 德國）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥適應性喂養(yǎng)1 w，確定無明顯異常后將大鼠隨機分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組（給藥劑量為1.0×10-4g·kg-1）以及三仁湯低、中、高劑量組（給藥劑量分別為4.1 g·kg-1、8.2 g·kg-1、16.4 g·kg-1），每組8只。

根據文獻[9]查詢與前期預實驗結果，造模方式采用每周一、二以1.6 mL·kg-1的劑量腹腔注射0.5%DMN 來建立大鼠肝纖維化模型，并自造模開始的同時，除空白組及模型組每日1 次給予灌服體積0.1 mL·kg-1的生理鹽水外，其余組別大鼠予相應藥物每日1次灌胃給藥干預，三仁湯低、中、高劑量組以及秋水仙堿組按上述體積灌服對應濃度藥物，以上造模及藥物干預持續(xù)時間均為4 w。若中途有大鼠出現形體消瘦伴有出血、體溫降低等明顯不適則停止干預，觀察大鼠后續(xù)情況，若情況不見好轉，可考慮處死以解除痛苦。

2.2 指標檢測干預4 w后，大鼠禁食不禁水12 h，第2 d 將大鼠稱重。用超純水配置20%烏拉坦，以0.06 mL·kg-1劑量腹腔注射麻醉，采集腹主動脈血，室溫放置下2 h后，4500 r/min離心15 min，吸取上層血清，用ELISA 法測定肝臟炎癥指標（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）以及PDGF-BB 水平。摘取大鼠肝臟后，稱重并記錄，后切取固定部位保存于EP 管中，進行HE染色、Masson染色：流水沖洗、梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、染色、脫水、透明、封片等操作。

2.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多樣本均數比較本用One-Way ANOVA檢驗，組間比較若方差齊用LSD檢驗，若方差不齊用Games-Howell檢驗。P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1 肝纖維化大鼠肝重、體質量、肝體比結果與正常組比較，模型組大鼠肝重、體質量、肝體比均明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。與模型組比較，三仁湯中、低劑量組及秋水仙堿組大鼠的肝重顯著升高（P＜0.001 或P＜0.01）；秋水仙堿組及三仁湯低、中、高劑量組大鼠的體質量與模型組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；秋水仙堿組及三仁湯中、低劑量組大鼠的肝體比與模型組比較，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。秋水仙堿組及三仁湯中、高劑量組大鼠的肝體比與正常組相當，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肝重、體質量、肝體比比較（± s）

表1 各組大鼠肝重、體質量、肝體比比較（± s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

肝體比（%）0.025±0.001△△△0.016±0.001***0.025±0.001△△△0.021±0.001*△0.023±0.001△△0.020±0.002組別正常組模型組秋水仙堿組三仁湯低劑量組三仁湯中劑量組三仁湯高劑量組肝重（g）7.941±0.142△△△3.479±0.100***5.351±0.387***△△△4.644±0.303***△△5.171±0.272***△△△4.249±0.411***體質量（g）314.813±7.956△△△213.660±1.701***214.833±5.807***221.586±4.220***225.660±3.871***210.400±6.739***

3.2 肝組織染色結果

3.2.1HE 染色結果 正常組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，結構形態(tài)正常，無肝細胞壞死、纖維增生以及炎性浸潤；模型組大鼠肝細胞索結構紊亂，肝竇界限模糊，大量炎癥細胞浸潤，肝細胞結構被破壞，并形成大量纖維結締組織；秋水仙堿組及三仁湯低、中、高劑量組大鼠肝臟炎癥浸潤較模型組呈現不同程度減少，肝細胞結構形態(tài)相對正常，肝細胞變性壞死減輕，肝纖維結締組織減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟HE染色（×200）

3.2.2 Masson 染色結果 正常組肝臟形態(tài)結構正常，未見有明顯纖維組織增生及肝小葉形成；模型組可見大量增生性膠原纖維，肝小葉結構被嚴重破壞，假小葉形成；秋水仙堿組與三仁湯低、中、高劑量組中，可見纖維性增生較模型組有所減少，纖維間隔較模型組縮小，而療效可見秋水仙堿組＞三仁湯低劑量組＞三仁湯中劑量組＞三仁湯高劑量組。見圖2。

圖2 大鼠肝組織Masson染色（×100）

3.3 三仁湯對大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、PDGF-BB的影響 與正常組比較，模型組IL-1β水平顯著升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與模型組比較，秋水仙堿組及三仁湯低、中劑量組的IL-1β 水平明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與正常組比較，模型組IL-6 水平顯著升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與模型組比較，秋水仙堿組及三仁湯低、中、高劑量組的IL-6水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組IL-10 水平顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；與模型組比較，三仁湯高劑量組的IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 三仁湯對肝纖維化大鼠IL-1β、IL-6、IL-10水平的影響（pg/mL，± s）

表2 三仁湯對肝纖維化大鼠IL-1β、IL-6、IL-10水平的影響（pg/mL，± s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別正常組模型組秋水仙堿組三仁湯低劑量組三仁湯中劑量組三仁湯高劑量組劑量（g·kg-1）--IL-10 109.47±31.69△68.70±4.86*91.00±5.84 93.53±7.69 86.53± 6.35 91.18±9.32△1.0×10-4 4.1 8.2 16.4 IL-1β 105.03±12.56△287.79±50.70*89.38±17.73△73.92±18.37△133.25±50.86△170.57±43.01 IL-6 291.04±46.79△2611.23±680.36*431.48±71.63△321.86±47.77△510.87±144.84△461.74±83.86△

與正常組比較，模型組的TNF-α、PDGF-BB 水平顯著升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001 或P＜0.05）。與模型組比較，三仁湯低劑量組的TNF-α 水平顯著降低，秋水仙堿組以及三仁湯低、中、高劑量組的PDGF-BB 水平亦顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001 或P＜0.01）。三仁湯低劑量組的TNF-α 水平以及三仁湯低、中、高劑量組的PDGF-BB水平均與正常組相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三仁湯對肝纖維化大鼠TNF-α、PDGF水平的影響（pg/mL，± s）

表3 三仁湯對肝纖維化大鼠TNF-α、PDGF水平的影響（pg/mL，± s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

PDGF-BB 4814.32±479.31△6208.82±382.29*3303.95±361.72*△△△4446.40±423.31△△4583.72±270.03△△4097.38±359.29△△△組別正常組模型組秋水仙堿組三仁湯低劑量組三仁湯中劑量組三仁湯高劑量組劑量（g·kg-1）--1.0×10-4 4.1 8.2 16.4 TNF-α 20.08±1.96△△△29.20±0.96***28.03±1.08**21.47±0.53△△25.64±1.69*31.85±2.23***

4 討論

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝病的一種常見的病理過程，是肝組織在受損后修復及愈合的過程中產生的，其表現為細胞外基質（ECM）的異常沉淀[10]。研究[11]表明，在纖維化過程中，不同免疫細胞和信號通路的激活，以及幾種炎癥介質的釋放，驅動肝星狀細胞（HSC）激活，引起細胞外基質（ECM）產生肌成纖維細胞，大量的ECM 積累會引起肝功能異常，如不及時干預最終可發(fā)展為肝硬化或肝癌。

血小板衍生生長因子（PDGF）由血小板、巨噬細胞、肌成纖維細胞和HSC 產生，是促進肝星狀細胞活化最強有絲分裂的一種生長因子。在其幾種亞型中，PDGF-BB 與HSC 活化關系最為密切。相關研究表明，慢性乙型病毒性肝炎患者血清中PDGF-BB 水平與疾病嚴重程度成正相關[12-14]。An S Y 等[15]研究發(fā)現，IL-6 和IL-1 是肝病中具有代表性的關鍵細胞因子，具有促炎和抗炎特性，其中IL-6 是與各種肝臟損傷相關的傷口愈合和組織再生過程中的主要調節(jié)因子，而IL-1細胞因子可激活肥大細胞（MCs）以分泌炎癥介質。IL-1 刺激肝臟產生炎癥反應，促進HSC 活化、增生，抑制ECM的降解，進一步啟動和加速HF的發(fā)生、發(fā)展[16]。趙鵬等[17]報道，IL-1β、IL-6 和TNF-α在非酒精性脂肪性肝病的初期會加重肝臟的脂質聚積，過度的脂質聚積可通過脂毒性引發(fā)肝細胞損傷，從而加重肝臟中炎性細胞的激活與浸潤，引發(fā)肝臟炎癥，之后通過促進肝臟星狀細胞的活化使疾病進一步發(fā)展為肝纖維化及肝硬化。Yao 等[18]研究得出，晚期纖維化患者IL-1β 和TNF-α 增加，并且IL-1β 還可以通過刺激人肝星形細胞（LX-2細胞）中結締組織生長因子和PDGF的表達來誘導促纖維化級聯(lián)反應。有研究指出，在急性炎癥和傷口愈合的早期階段，IL-10具有抗炎和抗纖維化作用，其可以通過自分泌或旁分泌機制抑制樹突狀細胞的抗原傳遞，抑制巨噬細胞活化和浸潤到損傷部位的病理性改變，并抑制或者減少促炎介質的釋放，從而達到對肝的保護作用[19，20]。亦有研究[21]發(fā)現IL-10 可以通過抑制細胞增殖，誘導細胞周期停滯，增加SA-β-Gal活性，增強衰老標志物蛋白p53 和p21 的表達來誘導活化HSC 的衰老，以減輕大鼠肝纖維化。

肝臟的慢性炎癥反應可導致異常的傷口愈合反應，形成纖維瘢痕，破壞肝臟結構。肝纖維化在一些階段是一個可逆的過程，去除纖維化反應因子有助于纖維化的消退[22]。去除致病因子時，臨床和實驗性肝纖維化會消退，這與消除這些活化的肌成纖維細胞和纖維瘢痕的再吸收有關[23]。因此，阻止或延緩肝纖維化的進一步發(fā)展，對臨床防治肝硬化或肝癌具有重要意義。對于肝纖維化，西藥治療雖然可以清除炎癥反應，有效降低膠原蛋白表達，調節(jié)人體細胞免疫分泌，減少HSC 的不斷增生與激活，但作用靶點單一，難以同時多環(huán)節(jié)起效，而中藥成分復雜，可多靶點起調控作用，在臨床抗肝纖維化治療中效果顯著[24，25]。

肝纖維化是現代醫(yī)學病理形態(tài)學概念，中醫(yī)將其歸屬于“癥積”“脅痛”“瘀血”“鼓脹”等疾病范疇[26]。肝纖維化病位在肝，病因病機主要為濕熱之邪入侵，蘊積肝膽，濕性膠著，纏綿難愈，導致肝膽疏泄不利，日久成瘀，繼而發(fā)病[27，28]。文彬[29]等認為濕熱內侵纏綿是導致肝纖維化形成的啟動因子和關鍵病機之一。李鮮教授[30]提出痰瘀熱毒凝結肝臟，日久而成肝纖維化者，可予三仁湯類方合下瘀血湯加減以清熱祛濕化痰開其路，使痰濕消，瘀血散。呂文良教授[31]也提出在治療慢性乙型肝炎時，應將清熱利濕、祛邪解毒貫穿疾病治療的始終。程志琴等[32]研究發(fā)現，加味三仁湯聯(lián)合恩替卡韋治療代償期乙肝肝硬化患者療效較好，可抑制肝纖維化和HBV-DNA 復制，提高患者免疫功能。趙玲等[33]認為應用化濕法治療慢性乙型肝炎的機理包括3 個方面：首先，抑制病毒復制；其次，護肝、促進損傷的肝細胞恢復；最后，調節(jié)機體的免疫功能。綜上可見，肝纖維化的防治當以疏肝理氣化濕、健脾運氣化濕之法調暢氣機，氣行則濕自化，瘀自散[34]。

本實驗提示三仁湯可能主要通過下調IL-1β、IL-6、TNF-α、PDGF-BB，上調IL-10，有效改善肝臟的炎癥反應，緩解肝損傷。觀察大鼠肝重、肝體比后可見，三仁湯低、中、高劑量組及秋水仙堿組均較模型組得到不同程度的改善。并且根據以上實驗觀察，總體來說三仁湯低、中、高劑量組對于肝纖維化大鼠的病理形態(tài)及炎癥水平均有一定的改善效果?？紤]此次實驗只進行了組織病理形態(tài)觀察及ELISA定量分析，而中藥成分復雜，可多靶點起調控作用，后續(xù)可在mRNA 及蛋白定性分析層面進一步觀察三仁湯不同濃度之間對相應炎癥指標水平影響的區(qū)別。

綜上所述，三仁湯低、中、高劑量及秋水仙堿均可以減少成纖維細胞增殖，減少膠原纖維沉積，其可能主要通過降低IL-1β、IL-6、TNF-α、PDGF-BB 表達水平，并上調IL-10 表達水平，從而減少炎癥反應，改善肝纖維化程度，在一定程度上可以延緩肝纖維化的進一步發(fā)展，但具體作用機制仍需要進一步全面系統(tǒng)的探析。