茵陳蒿湯對自身免疫性肝炎小鼠肝細胞鐵死亡的抑制作用及其機制分析

李竹蓉， 陳晨， 郭地， 呂思學， 武嘉文， 楊娜， 劉楊

山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院， 山西 晉中 030619

自身免疫性肝炎（AIH）是一種由自身抗體和自身反應性T淋巴細胞誘導的肝臟炎癥，其特點是循環(huán)自身抗體升高、高丙種球蛋白血癥和界面性肝炎，肝細胞免疫耐受性喪失，可進展為肝硬化甚至肝衰竭［1-4］。AIH主要發(fā)病人群為青少年及中老年女性。研究顯示該病的發(fā)病率逐年上升。AIH在全世界的年發(fā)病率為1.37/10萬人，其中亞洲人群的年發(fā)病率為1.31/10萬人［5］。目前AIH的病因和發(fā)病機制尚不明確［6］?，F(xiàn)行治療AIH的策略是單獨使用糖皮質激素或與硫唑嘌呤、免疫抑制劑組合。同時，為了保護肝臟、防止疾病的進展和肝功能的惡化，常規(guī)的治療策略還包括保肝降酶等。然而，長期使用這些藥物易使患者出現(xiàn)藥物依賴性、耐藥性及停藥后復發(fā)率較高等問題，因此，亟需尋找安全有效的治療方式［7］。

茵陳蒿湯出自醫(yī)圣張仲景所作《傷寒雜病論》，該方由茵陳、梔子、大黃三味藥組成，具有清熱利濕、利膽退黃的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，茵陳蒿湯用于治療AIH具有良好的臨床療效［8-9］。但有關茵陳蒿湯治療AIH的基礎實驗研究較少，其生物學機制尚未完全闡釋清楚。有研究表明，鐵死亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。鐵死亡是一種由鐵依賴的脂質過氧化誘導的調節(jié)性細胞死亡形式。過量的鐵會引發(fā)體內脂質過氧化，從而導致鐵死亡。胱氨酸-還原型谷胱甘肽（GSH）-谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是經(jīng)典的鐵死亡抑制系統(tǒng)。在正常生理條件下，胱氨酸通過抗轉運蛋白SLC7A11進入細胞參與GSH的合成。合成的GSH可以被GPX4消耗，進而將活性氧（ROS）轉化為脂質醇抑制鐵死亡，保護細胞免受氧化應激，維持膜脂質雙分子穩(wěn)態(tài)［10-11］。已有研究表明ROS誘導的氧化應激是多種肝臟疾病的潛在病理生理機制［12］。那么，茵陳蒿湯是否通過抑制鐵死亡及其介導的氧化應激來改善AIH肝損傷，目前尚未見相關報道。因刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導的免疫性肝損傷是一種典型且公認的AIH小鼠模型，其損傷過程非常類似于人類AIH的病理變化過程，故本文將采用Con A尾靜脈注射制備免疫性肝炎小鼠模型，聚焦肝細胞鐵死亡過程，探討茵陳蒿湯對AIH小鼠肝細胞的保護作用機制，為將茵陳蒿湯用于AIH的臨床治療提供科學依據(jù)［13］。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 A51119600全波長酶標儀（thermo scientific公司，美國），733BR4227顯影儀（bio-rad公司，美國），374-706969C熒光酶標儀（thermo scientific公司，美國），041BR301185、041BR328905電泳儀及轉膜儀（bio-rad公司，美國）等。

1.2 藥物與試劑 茵陳蒿湯用量參考李冀等［14］主編《方劑學》：茵陳蒿18 g、梔子12 g、大黃6 g。茵陳蒿湯中茵陳（產(chǎn)地陜西，批號211026009），梔子（產(chǎn)地江西，批號211001），大黃（產(chǎn)地甘肅，批號210201）購自北京同仁堂。

GSH、AST、ALT、ROS、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號分別為A006-2-1、C010-2-1、C009-2-1、A003-1、E004-1-1），小鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒（Bioswamp，貨號MU30038），小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（Bioswamp，貨號MU30030），Con A（索萊寶生物技術有限公司，貨號C8110），ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，貨號S0027），鐵離子檢測試劑盒（Elabscience，貨號E-BC-K772-M），GPX4單克隆抗體（Cell Signaling Technology，貨號52455S），溶質載體家族7成員11（SLC7A11）多克隆抗體（Cell Signaling Technology，貨號98051S），GAPDH抗體（Abways，貨號AB0037），HRP-羊抗兔IgG（Abbkine，貨號A21020）。

1.3 實驗動物 8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠18只（19～25 g），購自斯貝福生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，動物使用許可證號：SYXK（晉）2020-0006。小鼠分籠飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃、濕度為55%環(huán)境中，自由飲水和飲食。

1.4 動物分組及給藥劑量 小鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為3組：正常組、模型組、治療組，每組6只。依據(jù)沈晗等［15］茵陳蒿湯煎煮工藝，依照人和動物體表系數(shù)折算法，計算所需的茵陳蒿湯藥量，選用70 kg成人用量換算，茵陳蒿湯藥量為4.68 g生藥/kg，得到終藥液濃度為0.47 g生藥/mL，灌胃體積10 mL/kg，1次/d，持續(xù)2周；模型組和正常組以等體積生理鹽水灌胃；模型組和治療組于末次給藥后2 h予Con A（15 mg/kg）行尾靜脈注射造模，正常組尾靜脈注射生理鹽水。

1.5 取材 Con A尾靜脈注射8 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。取血后處死小鼠。血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。分離出肝臟、脾臟，生理鹽水漂洗，用濾紙將肝、脾表面的生理鹽水拭干，稱重后部分組織于4%多聚甲醛內固定，其余部分-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 肝臟、脾臟指數(shù) 測量小鼠處死前體質量及肝臟和脾臟的濕重。按照以下公式計算：脾臟指數(shù)=脾臟質量（mg）/體質量（g）；肝臟指數(shù)=肝臟質量（mg）/體質量（g）。

1.6.2 血清轉氨酶、炎癥因子水平 檢測各實驗組小鼠血清ALT、AST、IFN-γ、TNF-α的含量。所有操作按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 肝組織病理學檢測 取肝組織右上葉放入4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（片厚5 μm）。常規(guī)HE染色、中性樹膠封片。光鏡下觀察肝組織壞死面積及淋巴細胞浸潤程度。

1.6.4 肝組織中鐵離子測定 準確稱取肝組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，稱取20 mg肝組織后加入180 μL試劑一勻漿后，15 000×g離心5 min，取上清，用鐵離子測定試劑盒，在593 nm波長處測定吸光度值，據(jù)說明書公式計算肝組織中鐵離子含量。

1.6.5 測量肝組織GSH、MDA含量 準確稱取組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍的生理鹽水制成組織勻漿，離心取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書進行相關操作，分別在405 nm、532 nm波長處檢測吸光度，計算肝組織內GSH、MDA含量。

1.6.6 測量肝組織中ROS含量 稱取0.1 g組織，在PBS中剪碎漂洗后加入胰酶消化，尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞，按1∶1 000的比例配制探針，加入探針混勻后37 ℃孵育45 min，PBS洗1遍，加入PBS重懸，使用熒光酶標儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處測定熒光度值，所有操作均按照說明書要求進行。

1.6.7 測量肝組織中ATP含量 稱取20 mg肝組織，按說明書要求加入150 μL ATP檢測裂解液勻漿。取上清加入ATP檢測工作液，使用熒光酶標儀測定化學發(fā)光水平，按照說明書公式計算肝組織內ATP水平。

1.6.8 Western Blot法檢測肝組織GPX4蛋白表達 根據(jù)裂解液說明書，按20 mg組織加入250 μL含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進行組織勻漿，離心取上清。SDS-PAGE凝膠電泳后轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加一抗GPX4（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，TBST清洗，室溫孵育二抗GAPDH（1∶50 000）2 h，TBST清洗，加入ECL試劑，用顯影儀成像。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，3組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 茵陳蒿湯對小鼠肝臟、脾臟指數(shù)及肝功能的影響與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯升高（P值均＜0.01），與模型組相比，治療組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低（P值均＜0.01）。模型組血清ALT和AST水平較正常組均顯著升高（P值均＜0.01），治療組小鼠血清ALT和AST水平較模型組均明顯降低（P值均＜0.01）（表1）。

表1 茵陳蒿湯對小鼠肝/脾指數(shù)、血清ALT和AST水平的影響Table 1 Effect of Yinchenhao decoction on liver and spleen index， serum ALT and AST levels in mice

2.2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中ROS產(chǎn)生、Fe、MDA、GSH、ATP水平的影響 與正常組相比，模型組肝組織ROS產(chǎn)生量、Fe和MDA水平均顯著升高（P值均＜0.01），GSH和ATP水平顯著降低（P值均＜0.05）。與模型組相比，治療組肝組織ROS產(chǎn)生量、鐵離子和MDA水平顯著降低（P值均＜0.01），GSH和ATP水平顯著升高（P值均＜0.01）（表2）。

表2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中ROS產(chǎn)生、鐵離子、MDA、GSH、ATP水平的影響Table 2 Effects of Yinchenhao decoction on ROS production， Fe， MDA， GSH and ATP levels in liver tissue of mice

2.3 茵陳蒿湯對小鼠肝組織形態(tài)學的影響 HE染色結果顯示正常組肝組織完整，肝小葉清晰，肝細胞規(guī)則排列；在模型組中，出現(xiàn)大面積肝細胞變性、壞死，門管區(qū)炎細胞聚集等病理變化；茵陳蒿湯治療組肝組織病變的程度顯著改善，壞死面積較模型組明顯減少，肝小葉尚清晰（圖1）。

圖1 茵陳蒿湯對小鼠肝組織形態(tài)學的影響（HE染色）Figure 1 Effect of Yinchenhao decoction on liver morphology of mice （HE staining）

2.4 茵陳蒿湯對小鼠血清炎癥因子的影響 與正常組相比，模型組血清IFN-γ、TNF-α水平均升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，治療組IFN-γ、TNF-α水平明顯降低（P值均＜0.05）（表3）。

表3 茵陳蒿湯對Con A誘導肝損傷小鼠血清IFN-γ、TNF-α的影響Table 3 Effects of Yinchenhao decoction on serum IFN-γ and TNF-α production in mice with Con A induced liver injury

2.5 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達的影響 模型組GPX4和SLC7A11蛋白表達水平較正常組顯著降低（P值均＜0.01）；與模型組相比，治療組GPX4和SLC7A11蛋白表達水平均明顯升高（P值均＜0.01）（圖2）。

圖2 茵陳蒿湯對小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達的影響Figure 2 Effect of Yinchenhao decoction on GPX4 and SLC7A11 protein expression in liver tissue of mice

3 討論

AIH是一種慢性、難治性疾病，其發(fā)病與多種因素有關，AIH治療主要目標是通過控制肝臟炎癥反應，使血清ALT、AST、IgG水平恢復正常，肝組織內炎癥消失［16-18］。根據(jù)《自身免疫性肝炎診斷和治療指南（2021）》［19］，臨床目前仍主要采用潑尼松（龍）聯(lián)合硫唑嘌呤或者單用潑尼松（龍）的非特異性療法。該方案雖可顯著改善大多數(shù)中重度AIH患者的肝生化指標，但至少有10%～15%的患者對上述治療方案應答不佳，另有部分患者不能耐受藥物的不良反應（如股骨頭缺血性壞死、血細胞減少等）或停藥后復發(fā)，因此亟需尋求更佳的治療藥物。研究［20-21］發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可在病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病中使升高的ALT、AST、TNF-α恢復至正常水平，可以降低血脂、血糖，改善肝脂肪代謝，降低炎性反應，減輕肝損傷。研究［22-24］表明其減輕肝損傷主要表現(xiàn)在改善脂質代謝、平衡腸道菌群和調節(jié)線粒體功能，其醇提物在抗炎及抗氧化、降低MDA含量等方面效果顯著?，F(xiàn)代研究認為，茵陳蒿湯中的主要成分有槲皮素、β-谷甾醇、大黃素、山奈酚等，而槲皮素、β-谷甾醇、大黃酸等成分具有免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、降脂和保肝等作用，可誘導細胞自噬對肝細胞起到保護作用［25-27］。本次實驗發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清ALT和AST水平升高；同時，在AIH病理進展中起重要作用的炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ水平升高，提示Con A誘導的AIH實驗小鼠存在肝臟炎癥，而治療組ALT、AST及TNF-α、IFN-γ水平均明顯降低，提示茵陳蒿湯對Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷具有潛在的保護作用。

鐵死亡是一種調節(jié)性的細胞死亡形式，其特征是鐵依賴性的脂質過氧化積累［28-29］。研究表明鐵死亡與Xc-系統(tǒng)的功能密切相關。Xc-系統(tǒng)是位于細胞膜上的一種氨基酸轉運蛋白，是由SLC7A11和SLC3A2兩個亞基組成的異二聚體，是細胞中重要抗氧化系統(tǒng)的一部分。胱氨酸和谷氨酸通過Xc-系統(tǒng)中的胱氨酸/谷氨酸抗轉運蛋白SLC7A11以1∶1的比例交換進出細胞，被吸收的胱氨酸在細胞中還原為半胱氨酸，參與GSH的合成［10］。GPX4是多種細胞類型中鐵死亡的關鍵調節(jié)酶，具有抗氧化防御作用，可以通過消耗GSH將脂質ROS轉化為脂質醇，從而保護細胞免受鐵死亡［11］。當Xc-系統(tǒng)失衡時，超負荷游離鐵累積可導致各種肝臟疾病，鐵過載通過芬頓反應誘導ROS產(chǎn)生增多，導致氧化損傷和細胞死亡，從而誘發(fā)鐵死亡［30］。肝臟是體內主要的儲鐵部位，當發(fā)生鐵死亡時，肝臟內游離的鐵離子增加會加重肝臟負荷，從而造成肝損傷。相關研究［31］表明，腎臟組織中由鐵死亡引起的細胞死亡與GPX4基因缺失有關。GPX4對于預防脂質過氧化和鐵死亡的有害影響至關重要，有研究［12］表明，鐵死亡是AIH發(fā)病機制的啟動劑或介質，并且AIH中鐵死亡的發(fā)生受GPX4的調節(jié)。而GPX4的合成受胱氨酸轉運蛋白SLC7A11的影響。通過建立免疫性肝炎小鼠模型，本研究發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平顯著降低，茵陳蒿湯治療組小鼠肝組織中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平顯著升高，這些結果表明茵陳蒿湯可以調控Con A對小鼠肝組織Xc-系統(tǒng)的抑制作用。

脂質ROS的積累是鐵死亡的重要標志物，Xc-系統(tǒng)受到抑制會導致胱氨酸的吸收減少從而影響GSH的合成，導致GPX4活性降低，細胞抗氧化能力下降，脂質ROS積累，高水平的ROS會對DNA、蛋白質和膜脂質造成氧化損傷，并促進脂質過氧化的發(fā)生，導致脂質過氧化的終產(chǎn)物MDA含量增加，最終發(fā)生氧化損傷和鐵死亡［32］。本研究顯示Con A顯著增強了肝細胞內的ROS、鐵離子的累積，并減少了GSH含量及SLC7A11和GPX4蛋白表達水平，提示Con A可能誘導肝組織發(fā)生鐵死亡。茵陳蒿湯顯著抑制了Con A誘導的肝臟內ROS產(chǎn)生的增加以及肝組織MDA含量的升高，使肝臟內GSH含量升高，表明茵陳蒿湯可能通過增強肝組織的抗氧化作用，從而抑制鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究結果顯示Con A注射后導致Xc-系統(tǒng)失衡，誘導小鼠肝組織發(fā)生鐵死亡。茵陳蒿湯通過增加Xc-系統(tǒng)中GPX4和SLC7A11蛋白表達水平抑制鐵死亡起到肝保護作用。因此，本研究結果表明茵陳蒿湯的肝保護作用機制與可能與增強GPX4和SLC7A11蛋白表達從而抑制鐵死亡相關，為茵陳蒿湯臨床治療AIH的中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。由于人與動物的代謝酶、藥物分布以及腸道吸收度等均有不同，中藥的藥代動力學在人體和動物之間可能存在一定差異，因此，本研究結果進行臨床轉化尚需進一步的研究工作。

倫理學聲明：本研究方案于2021年9月29日經(jīng)由山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：2019LL41。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：李竹蓉負責設計論文框架，起草論文及研究過程的實施；陳晨、郭地負責實驗操作，數(shù)據(jù)收集；呂思學、武嘉文負責統(tǒng)計學分析；楊娜、劉楊負責論文修改；劉楊負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。