細菌生物膜的耐受性、耐藥性和治療策略研究新進展

周鐵麗 孫瑤

生物膜是嵌入細胞外聚合物基質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）中的微生物群落[1]，廣泛存在于自然環(huán)境中[2]。微生物能夠定植于人體，并在口腔、皮膚和腸道黏膜等部位聚集形成生物膜，對宿主的生理和健康產(chǎn)生重要的影響[3]。

微生物能夠在生物或非生物的表面形成生物膜，引起全身各部位的感染，常見有血管內(nèi)導管感染、假體關(guān)節(jié)感染和慢性傷口等，病原微生物在宿主體內(nèi)形成生物膜會導致難以根除的復發(fā)性和慢性感染[4-5]。表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌科細菌是引起生物膜相關(guān)性感染最常見的微生物，其中葡萄球菌是留置醫(yī)療器械相關(guān)感染的最常見病原菌[6-7]。生物膜具有高度的耐受性和耐藥性，使病原菌能夠逃避人體免疫防御，并抵抗抗菌藥物的清除作用，給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)[8]。本文對細菌生物膜的耐受性、耐藥性，以及治療策略研究的新進展和前景作一述評，為深化生物膜感染治療策略的研究和應用提供參考。

1 生物膜的組成和特性

生物膜是附著在生物或非生物表面上，被以多糖、蛋白質(zhì)和細胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）為主要成分的EPS 包裹的三維微生物群落[9]。經(jīng)典的表面附著生物膜形成是一個循環(huán)的過程，以5 個階段漸進性的方式發(fā)生，包括可逆附著、不可逆附著、生物膜成熟Ⅰ期、成熟Ⅱ期和分散[10]。浮游細菌最初通過細菌附屬結(jié)構(gòu)（如菌毛和鞭毛）附著于表面；隨后進入不可逆附著階段，伴隨著鞭毛反轉(zhuǎn)速率的降低、鞭毛基因表達的減少和生物膜基質(zhì)成分的產(chǎn)生，附著的細胞開始表現(xiàn)出藥物耐受性。生物膜成熟階段的特征是出現(xiàn)幾個細胞的細胞簇，并嵌入生物膜基質(zhì)中（成熟Ⅰ期），隨后完全成熟為微菌落（成熟Ⅱ期），最后是擴散階段。細菌生物膜形成各種酶，降解細胞外多糖的穩(wěn)定性，使得位于生物膜表面的細菌細胞釋放并在新表面上定植，從而導致感染的擴散[10]。生物膜形成過程中，從浮游生長到生物膜生長的轉(zhuǎn)變，受到了由第二信使環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）協(xié)調(diào)的生理、代謝和表型變化的調(diào)控。高水平的c-di-GMP 誘導生物膜形成，而低水平的c-di-GMP 導致生物膜解散[11]。

近年來，非附著生物膜聚集體相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注。研究顯示微生物聚集體在自然環(huán)境和感染中普遍存在[12]。聚集體引起的感染以慢性感染為主，例如囊性纖維化相關(guān)感染和慢性傷口感染等[13]，也見于急性感染中[14]。非附著聚集體胞外基質(zhì)的成分與表面附著生物膜高度相似，并且與表面附著的生物膜類似，與聚集體相比浮游細菌表現(xiàn)出更高的抗菌藥物耐受性和免疫逃避能力[15]。近年來，對非附著生物膜聚集體的關(guān)注日益增加，聚集體的形成機制、耐藥機制及其感染性疾病機制等尚待進一步闡明。

2 生物膜的耐受性和耐藥性

2.1 生物膜對抗菌藥物的耐受性 抗菌藥物的耐受性是指細菌在致命抗菌藥物濃度下的短暫存活能力，這可能是由于細菌減緩了基本的生存過程。生物膜與游離細胞相比需更高濃度和更長時間的抗菌藥物治療[16]。生物膜的耐藥性可高于浮游細菌10～1 000倍[17]。當前研究表明，多種機制參與了調(diào)控生物膜的高度耐藥性。

2.1.1 基質(zhì) 抗菌藥物與生物膜基質(zhì)的相互作用受到兩者物理性質(zhì)的影響，包括抗菌藥物的分子大小和表面電荷。妥布霉素等陽離子抗菌藥物能與生物膜基質(zhì)中帶陰離子的eDNA 等成分發(fā)生反應，從而降低了抗菌藥物分子在生物膜中的擴散速率[18]，由于抗菌藥物在生物膜中擴散減慢，細菌細胞有更充分的時間來啟動適應性應激反應，進而增加耐受性[3]。據(jù)報道，萬古霉素、苯唑西林、頭孢噻肟和德拉沙星在葡萄球菌生物膜基質(zhì)中的滲透性受限，而環(huán)丙沙星和阿米卡星的滲透性受基質(zhì)影響較小[19]。銅綠假單胞菌過度產(chǎn)生藻酸鹽的黏液型菌株形成的生物膜與非黏液型菌株形成的生物膜相比，耐受性更強[20]。此外，基質(zhì)中所儲存的抗菌藥物修飾酶[21]或含有的絲狀噬菌體[22]等也可能減緩抗菌藥物的擴散。

2.1.2 生物膜的異質(zhì)性 生物膜由氣液界面上的活躍、快速生長的細胞亞群和深層的代謝不活躍、生長緩慢或不生長的細胞亞群構(gòu)成，與養(yǎng)分和氧氣的分布相對應。同時，宿主免疫反應造成的微環(huán)境，可能加劇細菌的無氧生存環(huán)境[23]。生長緩慢和缺氧可導致生物膜深層細菌對抗菌藥物的敏感性降低。研究顯示，低氧水平能夠降低妥布霉素和環(huán)丙沙星的殺菌作用[24]，而低代謝活性的細菌可能導致抗菌藥物靶標產(chǎn)生減少和靶標活性降低。根據(jù)抗菌藥物的作用機制，其活性受到細菌生長速度和生理狀態(tài)不同程度的影響。β-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素類分別作用于細胞壁和核糖體，對生長緩慢細胞效果較差；而慶大霉素、環(huán)丙沙星和利福平等對非生長細胞表現(xiàn)出較好的作用[3]。

2.1.3 適應性應激反應 生物膜中營養(yǎng)、氧氣缺乏和抗菌藥物的存在造成應激條件，觸發(fā)適應性應激反應，主要包括誘導SOS 反應、嚴緊反應和由RpoS 因子調(diào)控導致的一般應激反應，進而介導生物膜對抗菌藥物的耐受性。營養(yǎng)限制和抗菌藥物暴露，可以通過活性氧的形成誘導DNA 損傷[25]，SOS 反應是對DNA 損傷的應激反應，可通過誘變和基因組重排誘導生物膜形成和抗菌藥物耐藥性，在慢性細菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。嚴緊反應是一種高度保守的信號通路，通過激活鳥苷3'，5'-雙焦磷酸（ppGpp）產(chǎn)生，可確保細菌在營養(yǎng)限制條件下存活[27]。有研究顯示，嚴緊反應在生物膜中被激活，能促進其對抗菌藥物產(chǎn)生耐受性，例如銅綠假單胞菌可以通過激活嚴緊反應表達來促進對環(huán)丙沙星和慶大霉素產(chǎn)生耐受性[28]。RpoS 是一種全局調(diào)控因子，在生長靜止期控制多種基因，能夠促進細菌生物膜形成以及增強其對抗菌藥物的耐受性[29]。

2.1.4 持留細胞 持留細胞是一種不生長且代謝不活躍的細胞，可發(fā)生于抗菌藥物治療、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏和生物膜狀態(tài)下，能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊和抗菌藥物殺傷，是導致生物膜感染復發(fā)的重要原因[28]。盡管目前對持久細胞形成機制尚未達成共識，但廣泛的研究為深入了解持留細胞的形成和復蘇治療提供了可能。此外，小菌落變體（small colony variants，SCVs）似乎與細菌在宿主細胞和組織中的持續(xù)存在有關(guān)，包括慢性感染中分離的金黃色葡萄球菌SCVs[30]和醫(yī)療器械相關(guān)性感染中分離的凝固酶陰性葡萄球菌SCVs[31]等。

總的來說，生物膜對抗菌藥物耐受性是一個動態(tài)、受多種因素影響的過程。在高度多樣的生物膜感染中，不同的耐受機制包括基質(zhì)組成、異質(zhì)性的代謝活性、氧梯度以及對各種應激的適應性反應的激活。這些機制的作用因抗菌藥物治療、生物膜感染的類型和位置而異。

2.2 生物膜對免疫系統(tǒng)的耐受性 生物膜可通過阻礙細菌識別或減少炎癥反應使細菌能夠逃避人類宿主的免疫系統(tǒng)[32]。與單個細胞相比，生物膜群落體積增大可產(chǎn)生對白細胞吞噬作用的抵抗力[33]。EPS 可以通過在細菌表面屏蔽病原體相關(guān)分子模式來引發(fā)免疫逃避。例如，金黃色葡萄球菌通過凝固酶表達將纖維蛋白摻入其EPS 中，從而保護生物膜細菌免受免疫識別[34]。生物膜形成通常被認為是細菌對抗環(huán)境威脅的一種防御機制，包括抗菌藥物、噬菌體和人體免疫系統(tǒng)的白細胞。然而，近年來Vidakovic 等[35]研究發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在真核細胞表面形成生物膜包裹免疫細胞，以c-di-GMP 依賴的方式分泌溶血素來殺死免疫細胞，提示生物膜的形成不僅是一種保護特征，而且是一種侵襲特征。

2.3 生物膜對抗菌藥物的耐藥性 抗菌藥物耐藥性通常由遺傳學改變引起，如細菌耐藥基因突變或通過水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）獲得的抗菌藥物耐藥基因等。

2.3.1 生物膜中耐藥基因突變 生物膜由于營養(yǎng)物質(zhì)擴散受損以及表面細菌層的代謝活躍消耗氧氣，呈現(xiàn)出空間結(jié)構(gòu)異質(zhì)的環(huán)境。生物膜內(nèi)微生物細胞的特定生理狀態(tài)和抗菌藥物濃度梯度可以顯著促進耐藥性的發(fā)展[36]。此外，適應性應激反應可能提高細菌耐藥基因突變率促進耐藥的進化。例如，銅綠假單胞菌生物膜中的內(nèi)源氧化應激已被證明可以通過DNA 雙鏈斷裂的誘變修復來促進誘變[37]。此外，研究表明生物膜中抗菌藥物耐藥性的進化速度比浮游細菌的進化速度更快。與暴露于相同亞抑菌藥物濃度的浮游培養(yǎng)物相比，銅綠假單胞菌生物膜的生長模式促進了低水平突變抗性的發(fā)展[36，38]。然而，生物膜中的耐藥機制類型和動態(tài)取決于不同抗菌藥物施加的選擇壓力，以及由特定突變引起的適應成本[39]。

2.3.2 生物膜中的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移 抗菌藥物耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）可以通過HGT迅速傳遞，生物膜中的細胞相對接近且滯留時間較長，促進了核酸的交換和再循環(huán)，HGT 的發(fā)生頻率比在浮游培養(yǎng)物中更為常見[40]。HGT 通過直接細胞間接觸（接合）、接受DNA 的細胞攝取胞外DNA（轉(zhuǎn)化）或噬菌體介導的DNA 轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)導）等方式，將DNA 從供體細胞傳遞到受體細胞[40]。在生物膜中，缺氧或亞抑制抗菌藥物濃度的刺激效應能夠影響質(zhì)粒的傳遞速率[41-42]。此外，與浮游細菌相比，生物膜中接合質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加，可能促進AGRs 傳播[43]。據(jù)文獻報道，金黃色葡萄球菌生物膜中接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移率比浮游培養(yǎng)物中的接合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率高16 000 倍[44]。

膜囊泡可以攜帶不同類型的遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒DNA、染色體DNA、噬菌體DNA 或RNA[45]。DNA 封裝于膜囊泡中可以防止核酸外切酶的降解、冷凍失活和熱降解[46]。生物膜基質(zhì)中積累的膜囊泡可以在細菌之間轉(zhuǎn)移ARGs 或質(zhì)粒，促進HGT[47]。目前，有關(guān)膜囊泡介導耐藥基因轉(zhuǎn)移研究主要在浮游細菌方面，其在生物膜中ARGs 轉(zhuǎn)移中的作用仍需進一步開展。

3 生物膜的治療策略

生物膜由微生物和不同周圍組織基質(zhì)組成，可視為一種獨立于血流和間質(zhì)液的藥代動力學微環(huán)境，因此，它們表現(xiàn)出與周圍組織不同的抗菌藥物藥代動力學，抗菌藥物途徑較難通過全身給藥到達選擇，合適的局部用藥十分關(guān)鍵，迫切需要在臨床上開發(fā)針對生物膜的靶向藥物[48]。下文對現(xiàn)有抗生物膜藥物及對潛在的抗菌治療策略的展望。

3.1 常規(guī)抗生物膜藥物 生物膜通過前文提到的多種機制增強對常規(guī)抗菌藥物的耐藥性，使抗菌藥物對其的治療效果不佳。針對具有不同代謝活性的細菌細胞，將不同種類抗菌藥物進行聯(lián)合用藥，可能是對抗生物膜的有效手段。例如，利福平與環(huán)丙沙星、利奈唑胺、達托霉素或替加環(huán)素聯(lián)合用藥能夠有效清除屎腸球菌生物膜[49]。此外，研究顯示植物來源的非抗菌藥物香芹酚能夠恢復耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜對β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性[50]。此外，研究顯示聯(lián)合用藥能有效預防植入物上生物膜的形成。據(jù)報道米諾環(huán)素和利福平聯(lián)合可以有效預防心臟植入電生理裝置生物膜相關(guān)性感染[51]。

3.2 抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP） AMP 是一類小分子肽，通常由12～50 個氨基酸殘基組成[52]。與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，AMP 具有耐藥性出現(xiàn)較慢的優(yōu)勢，同時具備廣譜抗生物膜活性和有利調(diào)節(jié)宿主免疫反應的能力[53]。研究報道AMP bac（1-35）能夠破壞高黏液表型肺炎克雷伯菌形成的生物膜，暴露細菌并發(fā)揮高效抗菌活性[54]。此外，天然或合成的AMP 已被證明可防止微生物在表面定植，殺死生物膜中的細菌并破壞其結(jié)構(gòu)，在預防醫(yī)療器械相關(guān)感染方面具有潛力。例如，紅辣椒中提取的AMP 表現(xiàn)出抗黏附特性，能夠預防表皮葡萄球菌生物膜的形成[55]。AMP 具有多種有效的抗生物膜機制，有望在臨床中應用以清除生物膜，進一步的體內(nèi)研究將有助于更全面地了解其在復雜宿主環(huán)境中的活性和穩(wěn)定性。

3.3 納米粒子 納米材料具有獨特的理化性質(zhì)、較強的殺菌活性和特定的機制，可以通過物理損傷、氧化應激、熱損傷等方式抑制細菌生物膜的生長，在細菌性疾病的治療、提高抗菌藥物的治療效果和克服細菌耐藥性上顯示出廣闊的前景。研究人員通過將納米顆粒涂覆植入物材料表面，可以防止生物膜的形成[56]。生物膜的復雜防御系統(tǒng)使得抗菌藥物和新型小分子等遞送存在效率低下或失活等問題。納米技術(shù)作為一種新策略，可以靶向生物膜或其內(nèi)部成分，增強藥物的滲透性，使其保持較高的作用濃度[57]。此外，許多金屬納米材料，如磁性氧化鐵納米顆粒、銀納米顆粒和金納米顆粒等都顯示出良好的抗生物膜活性。近年來，多種類型有機納米顆粒顯示出顯著抗生物膜的活性和良好的生物相容性[58]，已成為抗生物膜研究的熱點。

3.4 噬菌體 噬菌體能夠靶向殺菌，并具有較高的生物安全性，被認為是治療細菌感染的理想候選手段之一。盡管生物膜可以保護細菌免受惡劣的環(huán)境影響和噬菌體捕食，但噬菌體可以編碼解聚酶等EPS 降解酶，以對抗生物膜[59]。研究顯示噬菌體對于金黃色葡萄球菌生物膜引起的假體周圍關(guān)節(jié)感染具有很好的抗菌活性[59]。此外，有研究采用噬菌體和抗菌藥物聯(lián)合用藥，發(fā)現(xiàn)噬菌體聯(lián)合環(huán)丙沙星能夠有效清除銅綠假單胞菌生物膜[60]。噬菌體的使用也存在一定的局限性，例如細菌通過溶原性噬菌體將耐藥基因在整個生物膜群落里傳播，提高耐藥風險[61]。噬菌體在清除生物膜感染中展現(xiàn)的出色能力，人們認為噬菌體療法在細菌感染的治療中仍具有巨大的潛力。

3.5 其他抗生物膜策略 為了對抗生物膜的耐藥性，非抗菌藥物的抗生物膜活性開發(fā)是近年來研究熱點，包括群體感應抑制劑，例如mBTL 可在體內(nèi)外抑制銅綠假單胞菌的群體感應受體LasR 和RhlR 的合成，進而抑制生物膜的形成[62]；EPS 降解酶和其他酶類，如小分子抑制胞外多糖修飾酶能夠阻斷胞外多糖Pel 依賴的生物膜形成[63]；c-di-GMP 生物合成抑制劑，c-di-GMP 在絕大多數(shù)細菌的生物膜生命周期中起著關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮能夠通過調(diào)節(jié)c-di-GMP 濃度促進生物膜的分散[64]；其他還包括生物膜靶向抗體[65]、外排泵抑制劑[66]和來源于動植物的天然產(chǎn)物[67]等。上述抗生物膜成分通過不同的機制選擇性地發(fā)揮作用，對抗生物膜相關(guān)的難治性感染。

4 結(jié)論和展望

細菌生物膜與人類健康密切相關(guān)，生物膜相關(guān)人類感染性疾病表現(xiàn)出較高的耐受性和耐藥性，迫切需要開發(fā)新型高效的生物膜預防和治療策略。本文對生物膜的形成和特征，生物膜對宿主免疫和抗菌藥物的耐受性和耐藥機制以及對目前治療策略研究新進展進行闡述。然而，生物膜的復雜性使其治療和清除尤為困難。在未來，有必要利用多組學和生物信息學技術(shù)來分析各種微生物生物膜的形成機制和開發(fā)生物膜抑制劑，預防生物膜的形成；同時通過跨學科的合作開發(fā)新型醫(yī)療植入物表面材料，防止生物膜的定植和提高清除能力；鑒于生物膜中特殊的藥代動力學，有必要進一步優(yōu)化用藥策略，建立局部生物膜治療藥物遞送系統(tǒng)，以提高對生物膜的清除效能，并避免對周圍組織的不良反應。此外，需要進一步優(yōu)化體內(nèi)外生物膜研究模型，提高體外研究到體內(nèi)轉(zhuǎn)化應用的能力，以期通過以上方法能在未來能夠更有力地克服生物膜感染的挑戰(zhàn)。

（本文由浙江省醫(yī)學會推薦）