非酒精性脂肪性肝病病人血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18水平與氧化應(yīng)激指標(biāo)、肝纖維化程度的相關(guān)性

符鑫，劉悅，彭鑫，黃婷婷，廖雪霞，張曼

作者單位：1儋州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，海南 儋州571799；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化腫瘤外科，湖北 武漢430023

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在沒(méi)有已知因素（如飲酒或使用致脂肪藥物）誘導(dǎo)干細(xì)胞中脂質(zhì)積累的情況下出現(xiàn)的肝細(xì)胞中脂肪積累量超過(guò)5%［1］，與胰島素抵抗及遺傳易感因素密切相關(guān)，隨著時(shí)間的推移可演變成肝硬化甚至肝癌［2］。研究證實(shí)，肝纖維化和氧化應(yīng)激在NAFLD疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［1，3］。已知長(zhǎng)鏈非編碼RNA人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18（lncRNA HCG18）在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及遷移［4］，Xia等［5］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HCG18在NAFLD病人血清中表達(dá)升高，并與胰島素抵抗相關(guān)，對(duì)NAFLD具有較高的診斷價(jià)值。但關(guān)于lncRNA HCG18與NAFLD病人氧化應(yīng)激及肝纖維化程度的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)92例NAFLD病人與90例健康體檢志愿者進(jìn)行對(duì)比研究，探討血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)及肝纖維化程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以儋州市人民醫(yī)院2020年11月至2022年3月收治的92例NAFLD病人為NAFLD組，另選取同期健康體檢志愿者90例為對(duì)照組。NAFLD組中男性44例，女性48例，年齡范圍40～78歲，年齡（58.25±8.48）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（25.70±2.35）kg/m2；對(duì)照組中男性41例，女性49例；年齡范圍42～77歲，年齡（59.20±8.84）歲，BMI為（25.46±2.23）kg/m2。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）NAFLD組病人符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》中NAFLD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；（2）對(duì)照組體檢結(jié)果顯示肝功能正常；（3）認(rèn)知功能正常，依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并糖尿病病人；（2）合并其他肝病病人；（3）合并惡性腫瘤病人；（4）有過(guò)量飲酒史病人；（5）自身免疫病病人。兩組受試者對(duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽署書(shū)面同意書(shū)。本研究經(jīng)儋州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20220518）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 病人入院后，收集一般資料，包括性別、年齡、BMI；檢測(cè)病人生化指標(biāo)，包括血小板計(jì)數(shù)（PLT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.2 血液樣本收集 NAFLD組病人于入院次日清晨采集空腹靜脈血10 mL，對(duì)照組于體檢當(dāng)日空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血10 mL，離心分離血清，-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2.3 血清lncRNA HCG18水平測(cè)定 嚴(yán)格按照Trizol試劑盒（賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)15596026）說(shuō)明書(shū)操作，分別提取NAFLD組及對(duì)照組血清中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，貨號(hào)RRO47AA）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用qRT-PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)CFX384）檢測(cè)血清lncRNA HCG18相對(duì)表達(dá)水平（PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL、雙蒸水7μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix 10 μL），條件為95 ℃初始變性45 s；然后在95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，35個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法分析血清lncRNA HCG18表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參基因，引物由北京百瑞極生物科技有限公司提供，引物序列如下：lncRNA HCG18正向5'-ATCCTGCCAATAGATGCTGCTCAC-3'，反向5'-AGCCACCTTGGTCTCCAGTCTC-3'；GAPDH正向5'-TGACGTGCCGCCTGGAGAAAC-3'，反向5'-CCGGCATCGAAGGTGGAAGAG-3'。

1.2.4 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測(cè)血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平，試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.5 NAFLD肝纖維化（NFS）評(píng)分［7］NFS=-1.675+0.037×年齡（歲）+0.094×BMI+1.13×FPG受損/糖尿病（是=1，否=0）+0.99×AST/ALT（率）-0.013×PLT（×109/L）-0.66×ALB（g/dL）。NFS＜-1.455為排除晚期纖維化組（30例），-1.455～0.676為中間狀態(tài)組（46例），NFS＞0.676為晚期纖維化組（16例）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；三組間差異比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；性別等計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)比較；Pearson相關(guān)性分析血清lncRNA HCG18與GSH-Px、丙二醛、SOD的關(guān)系；Spearman相關(guān)性分析血清lncRNA HCG18與NFS評(píng)分的關(guān)系；受試者操作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)血清lncRNA HCG18表達(dá)水平對(duì)NAFLD的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料對(duì)比 兩組性別、年齡、BMI、ALB、TC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PLT、AST、ALT、GGT、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FINS、HOMA-IR比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 健康體檢志愿者90例與NAFLD 92例一般資料比較

2.2 兩組血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 NAFLD組lncRNA HCG18、丙二醛水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.001）。見(jiàn)表2。

表2 健康體檢志愿者90例與非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

表2 健康體檢志愿者90例與非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

注：lncRNA HCG18為長(zhǎng)鏈非編碼RNA人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。

SOD/（U/mL）92.84±12.89 68.36±10.65 13.98＜0.001組別對(duì)照組NAFLD組t值P值例數(shù)90 92 lncRNA HCG18 1.01±0.24 1.37±0.29 9.11＜0.001 GSH-Px/（U/mL）98.25±13.92 72.39±11.26 13.79＜0.001丙二醛/（μmol/L）4.17±1.04 6.96±2.13 11.19＜0.001

2.3 不同肝纖維化程度組一般資料對(duì)比 三組年齡、BMI、PLT、AST、ALT、GGT、FINS、HOMA-IR比較差異顯著（P＜0.05）。排除晚期纖維化組、中間狀態(tài)組、晚期纖維化組年齡、BMI、AST、ALT、GGT、HOMA-IR依次顯著升高（P＜0.001），F(xiàn)INS依次顯著升高（P＜0.05），PLT依次顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例不同肝纖維化程度組一般資料對(duì)比

2.4 不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 排除晚期纖維化組、中間狀態(tài)組、晚期纖維化組lncRNA HCG18、丙二醛水平依次顯著升高（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平依次顯著降低（P＜0.001）。見(jiàn)表4。

表4 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

表4 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較/

注：lncRNA HCG18為長(zhǎng)鏈非編碼RNA人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18，GSH-Px為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。①與排除晚期纖維化組比較，P＜0.05。②與中間狀態(tài)組比較，P＜0.05。

SOD/（U/mL）81.45±12.52 66.52±10.25①49.13±8.29①②48.42＜0.001組別排除晚期纖維化組例數(shù)3 0中間狀態(tài)組46晚期纖維化組F值P值16 lncRNA HCG18 1.20±0.25 1.39±0.30①1.65±0.35①②12.36＜0.001 GSH-Px/（U/mL）81.56±13.58 71.74±10.52①57.06±9.05①②24.27＜0.001丙二醛/（μmol/L）5.64±1.88 7.12±2.16①8.99±2.51①②13.06＜0.001

2.5 NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與氧化應(yīng)激指標(biāo)、肝纖維化程度的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與丙二醛呈正相關(guān)（r=0.59，P＜0.001），與GSH-Px、SOD均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.57、-0.62，P＜0.001）；Spearman相關(guān)性分析顯示NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與NFS評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.69，P＜0.001）。

2.6 血清lncRNA HCG18對(duì)NAFLD診斷價(jià)值分析 ROC曲線結(jié)果顯示，血清lncRNA HCG18診斷NAFLD的曲線下面積（AUC）95%CI為0.85（0.79，0.90），截?cái)嘀禐?.24，靈敏度為72.8%，特異度為86.7%，約登指數(shù)為0.60。

3 討論

據(jù)估計(jì)，NAFLD患病人數(shù)約占全球人口的25%，已成為全球慢性肝病的常見(jiàn)病因［8-9］，中國(guó)NAFLD患病率高達(dá)25%，年增長(zhǎng)率高達(dá)0.60%，是NAFLD患病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家［10］。由于NAFLD的發(fā)病并無(wú)典型癥狀，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期［2］，容易有肝硬化、肝衰竭、肝細(xì)胞肝癌等肝臟相關(guān)疾病，嚴(yán)重者因此死亡。因此，尋找能夠早期診斷NAFLD的生物標(biāo)志物，能夠幫助臨床采取有效干預(yù)措施，改善病人預(yù)后，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

NAFLD發(fā)病較為復(fù)雜，目前已知其與胰島素抵抗有關(guān)［11］。NAFLD病人由于肝臟受損，ALT、AST、GGT進(jìn)入血液循環(huán)，病人體內(nèi)三者含量明顯升高，ALT、AST、GGT是診斷肝臟疾病的重要指標(biāo)，能夠反應(yīng)肝臟病變嚴(yán)重程度［12］。本研究中，NAFLD組HOMA-IR、ALT、AST、GGT顯著高于對(duì)照組，排除晚期纖維化組、中間狀態(tài)組、晚期纖維化組病人HOMA-IR、ALT、AST、GGT依次顯著升高。NAFLD病人體內(nèi)的過(guò)量氧與清除過(guò)量氧的抗氧化系統(tǒng)的失衡是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要原因。病人體內(nèi)過(guò)量氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物丙二醛增加［3］，由于過(guò)量氧自由基的存在，GSH-Px、SOD作為抗氧化酶發(fā)揮其抗氧化作用被大量消耗，機(jī)體抗氧化能力降低［13］。NAFLD的進(jìn)展過(guò)程中往往伴隨著肝纖維化，Angulo等［7］創(chuàng)建的NAFLD肝纖維化評(píng)分（NFS）系統(tǒng)能夠證明肝纖維化程度，并可用于判定NAFLD病人的預(yù)后［14］。

lncRNA HCG18是一種具有腫瘤促進(jìn)作用的lncRNA，在上皮性卵巢癌［15］、乳腺癌［16］中均呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)。在肝細(xì)胞癌病人癌組織中，lncRNA HCG18表達(dá)升高，并可通過(guò)靶向miR-214-3p加速腫瘤進(jìn)展［4］。本研究中，NAFLD組血清lncRNA HCG18表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，這與Xia等［5］學(xué)者的研究結(jié)果具有一致性，表明lncRNA HCG18參與肝功能障礙的進(jìn)展。lncRNA HCG18在NAFLD中可能是通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-197-3p，增加IL-18的表達(dá)參與NAFLD的病情進(jìn)展［5］，IL-18產(chǎn)生的IFN-γ能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)大鼠脂肪肝的發(fā)展［17］。排除晚期纖維化組、中間狀態(tài)組、晚期纖維化組血清lncRNA HCG18依次升高。推測(cè)NAFLD病人肝纖維化程度越嚴(yán)重，lncRNA HCG18水平越高，IL-18水平越高，對(duì)肝細(xì)胞的損傷程度越嚴(yán)重。

NAFLD組血清丙二醛水平明顯高于對(duì)照組，GSH-Px、SOD水平明顯低于對(duì)照組，這與王永斌等［18］、謝文秀等［19］的研究結(jié)果一致。排除晚期纖維化組、中間狀態(tài)組、晚期纖維化組丙二醛水平依次顯著升高，GSH-Px、SOD水平依次顯著降低。結(jié)果表明，纖維化程度越嚴(yán)重，lncRNA HCG18水平越高，機(jī)體氧-抗氧化系統(tǒng)失衡越嚴(yán)重，氧化應(yīng)激反應(yīng)越劇烈。Pearson相關(guān)性分析顯示，NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與丙二醛呈正相關(guān)，與GSH-Px、SOD均呈負(fù)相關(guān)；Spearman相關(guān)性分析顯示NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與NFS評(píng)分呈正相關(guān)，提示NAFLD病人血清lncRNA HCG18水平與氧化應(yīng)激指標(biāo)及肝纖維化程度關(guān)系密切。ROC曲線結(jié)果顯示，血清lncRNA HCG18對(duì)NAFLD具有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，NAFLD病人血清lncRNA HCG18表達(dá)水平升高，與氧化應(yīng)激指標(biāo)及肝纖維化程度存在一定的相關(guān)性，且對(duì)NAFLD具有一定的診斷價(jià)值，可作為NAFLD的生物標(biāo)志物。但本研究所納入樣本數(shù)量較少，且并未對(duì)lncRNA HCG18的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，同時(shí)由于所納入的受試對(duì)象存在個(gè)體差異，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可能存在一定的偏頗。同時(shí)僅對(duì)lncRNA HCG18一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，未結(jié)合其他相關(guān)指標(biāo)，也是本研究的不足之處，后續(xù)需擴(kuò)大樣本數(shù)量，結(jié)合其他相關(guān)指標(biāo)，開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究進(jìn)行更加深入的探討。