玉米紋枯病菌中新減毒病毒RsHV4的特征研究

王 鵬，李篤花，張紹輝，楊孟寧，安紅柳，方守國，鄧清超，郭靈芳，3，章松柏，

（1.長江大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中游作物綠色高效生產(chǎn)重點實驗室（部省共建），湖北 荊州 434025；2.長江大學 農(nóng)林病蟲害預警與調控湖北省工程技術研究中心，湖北 荊州 434025；3.長江大學 化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州 434023）

真菌病毒是一種可以侵染真菌和卵菌的病毒，存在于所有主要的植物病原真菌中[1-4]。真菌病毒根據(jù)核酸性質分為雙鏈RNA（dsRNA）病毒、正單鏈RNA（+ssRNA）病毒、負單鏈RNA（-ssRNA）病毒、逆轉錄單鏈RNA（ssRNA-RT）病毒以及單鏈環(huán)狀DNA（ssDNA）病毒。根據(jù)國際病毒分類學委員會（ICTV）的報告，正單鏈RNA（+ssRNA）真菌病毒分為Alphafexiviridae、Barnaviridae、Botourmiaviridae、Deltaflexiviridae、 Endornaviridae、 Fusariviridae、Gammaflexiviridae、 Hypoviridae、 Mitoviridae、Narnaviridae、Yadokariviridae、Hadakaviridae 12 個科以及未分類的病毒，其中減毒病毒科（Hypoviridae）包 含 下 面8 個 屬：Alphahypovirus、Betahypovirus、Gammahypovirus、Deltahypovirus、Epsilonhypovirus、Zetahypovirus、Thetahypovirus、Etahypovirus[5]。大 部分真菌病毒對寄主不造成影響或影響很小，少數(shù)真菌病毒能引起寄主致病力減弱或增強。引起寄主致病力減弱的真菌病毒有潛在的生防能力，為植物真菌性病害的防治提供了新的思路和材料。如在歐洲，使用減毒病毒Cryphonectria parasitica hypovirus 1（CHV1）成功防治了由栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）引起的板栗疫病[6]，這是最早應用真菌病毒防治植物真菌病害的案例；在我國，從核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）中分離得到的病毒Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence-associated DNA virus 1（SsHADV-1）可以保護油菜不受強毒力菌株核盤菌的危害[7]。此外，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中的Fusarium graminearum hypovirus 2（FgHV2）[8]、鏈 格 孢 菌（Alternaria alternata）中 的Alternaria alternata hypovirus 1（AaHV1）[9]、核盤菌中的Sclerotinia sclerotiorum hypovirus 1（SsHV1）和Sclerotinia sclerotiorum hypovirus 2（SsHV2）[10-11]以及黑 腐 皮 殼 菌（Valsa ceratosperma）中 的 Valsa ceratosperma hypovirus 1（VcHV1）[12]等 都 賦 予 了 寄主真菌弱毒特性，具有潛在的生防能力。

立枯絲核菌（R.solani）是一種土傳病害真菌，具有廣泛的植物寄主，包括玉米、水稻、小麥以及馬鈴薯等糧食作物，每年造成嚴重的經(jīng)濟損失，是最具破壞力的植物病原菌之一[13-16]。由于立枯絲核菌具有寄主范圍廣、死體營養(yǎng)性等特性，導致對其引起的病害防治效果差、防治策略缺乏[16]。因此，立枯絲核菌中的真菌病毒引起了大家的持續(xù)關注。1978 年在立枯絲核菌中首次發(fā)現(xiàn)真菌病毒[17]，目前已經(jīng)在該菌中鑒定出了100 多種真菌病毒[16，18-24]，但是大部分病毒僅有序列的報道，未提及其對寄主真菌生長的影響。鑒于此，從玉米紋枯病菌菌株ZYFG11 中鑒定一種新的真菌病毒，利用系統(tǒng)發(fā)育分析方法分析其分類地位，并通過試驗明確其弱毒作用，以期為玉米紋枯病的生物防治提供潛在資源和科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

前期在貴州省遵義市鳳岡縣進化鎮(zhèn)的玉米田中大量采集玉米紋枯病發(fā)病植株上菌核，消毒后將其接至PDA 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，然后再挑取新的菌核進行純化培養(yǎng)，通過這種方法獲得菌株ZYFG11，經(jīng)鑒定其為立枯絲核菌（R.solani）；JSJH6為實驗室保存的玉米紋枯病菌菌株。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：土豆200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g，加蒸餾水定容至1 L；液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：土豆200 g、蔗糖20 g，加蒸餾水定容至1 L；固體LB 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、氯化鈉20 g、酵母提取物10 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1 L；液體LB 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、氯化鈉20 g、酵母提取物10 g，加蒸餾水定容至1 L。上述培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min后使用。

1.3 試驗試劑和引物

瓊脂粉購自索萊寶公司，HiScript?ⅡReverse Transcriptase 購自諾唯贊公司，T4 DNA ligase、T 載體連接試劑盒購自Takara 公司，2×TaqPCR StarMiX購自Genestar 公司，膠回收試劑盒購自OMEGA 公司，瓊脂糖購自上海貝晶生物公司；引物（表1）合成和克隆序列測序由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司完成。

表1 試驗所用引物及其序列Tab.1 The primers and their sequences

1.4 菌株ZYFG11中dsRNA提取與檢測

將菌株ZYFG11 在貼有玻璃紙的PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲，使用液氮將菌絲磨碎，利用纖維素吸附法[25]提取dsRNA，采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5 菌株ZYFG11中dsRNA序列克隆

1.5.1 cDNA 的 合 成 使 用HiScript?ⅡReverse Transcriptase合成cDNA，具體方法參考其說明書。

1.5.2 隨機引物克隆 使用隨機引物克隆的方法對未知病毒的序列進行克隆，先以OMEGA 凝膠回收試劑盒對dsRNA進行回收，以回收的dsRNA為模板，RACE3RT 為引物進行反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，使用RACE3引物進行PCR，回收PCR產(chǎn)物后，連接pMD19-T Vector（simple）轉化到大腸桿菌（DH5α）中，挑取陽性克隆進行測序，將測序序列在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對分析，獲得病毒基因組部分序列的相關信息。

1.5.3 末端序列的克隆 在T4 DNA ligase 的作用下使病毒基因序列連接上pRC3 接頭序列（與引物RACE3 互補），使用引物RACE3 和RsHV-R0 進行RT-PCR 得到了5'端序列，3'端序列則是通過使用引物RACE3-dT9和RsHV-F0（結合在3'端已知序列上）進行反轉錄，RsHV-F0 和RACE3 進行PCR獲得。

1.6 病毒的基因組分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

病毒基因序列由DNAstar 7.0 和DNAMAN 7.0軟件進行拼接和分析。使用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/網(wǎng)站工具和DNAMAN 7.0 預測開放閱讀框（ORF）和相應蛋白質序列。使用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor joining，NJ），以自展法（Bootstrap）檢測各分支置信度，1 000 次重復，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過SDTv 1.2 制作生成多序列比對矩陣圖。

1.7 真菌生長表型分析

選取帶毒菌株ZYFG11 和無毒菌株JSJH6（對照）進行培養(yǎng)。將2 種菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1～2 d，用滅過菌的1 mL 移液槍的槍頭分別切取菌落邊緣直徑為8 mm 的菌絲塊，移至PDA平板中，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，每隔4 h測量菌落生長直徑、菌核初始形成時間以及菌核的大小等，5個重復。

1.8 真菌致病力測定

在試驗田中種植20 株玉米，待長出葉子后備用。將木質牙簽截斷為1 cm 長，在含有15 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中滅菌，將牙簽放入ZYFG11 菌株生長的PDA 培養(yǎng)基中，在玉米抽雄初期，將長滿菌絲的牙簽接種至玉米基部第2 葉鞘內，含毒菌株和無毒菌株各接種5 株玉米，2 周后觀察記錄發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1 菌株ZYFG11和JSJH6的生長及形態(tài)

帶毒菌株ZYFG11 和對照無毒菌株JSJH6 的生長及菌核形成情況如圖1。2 個菌株的菌絲前期無色，較細，然后逐漸集結為團狀物，顏色由白色變?yōu)榈稚秃稚?，最終形成大小不一的圓形、橢圓形或不規(guī)則形菌核。顯微鏡下，2 個菌株的菌絲形態(tài)也相同，為有隔菌絲，分枝呈直角、近直角或銳角，分枝處有分隔或溢縮。不同的是，菌株ZYFG11 的菌絲較菌株JSJH6稀疏，形成的菌核數(shù)量也較少，說明菌株ZYFG11生長異常。

圖1 菌株ZYFG11和菌株JSJH6的生長情況及形態(tài)觀察Fig.1 Growth and morphological observation of ZYFG11 and JSJH6

2.2 菌株ZYFG11中病毒基因組序列的克隆及分析

提取菌株ZYFG11 中的dsRNA，通過隨機引物克隆技術獲取其多個隨機片段序列（圖2），借助BLASTn 對序列進行比對，結果顯示，其與減毒病毒科（Hypoviridae）θ-減毒病毒屬（Thetahypovirus）的病毒Sclerotium rolfsii hypovirus 1（polyprotein）相應片段有61.59%的同源性，可能為一新病毒，命名為立枯絲核菌減毒病毒4（Rhizoctonia solani hypovirus 4，RsHV4）。通過RT-PCR 的方法獲得病毒基因組的全序列，登錄GenBank，序列登錄號為OM802107。

圖2 病毒dsRNA的提取及隨機引物克隆Fig.2 Viral dsRNA extraction and random primer cloning

RsHV4 基因組核酸全長18 702 nt，GC 含量為50.4%，5'UTR 長630 nt，3'UTR 長1 414 nt，包 括32 nt的poly（A）尾。病毒基因組中含有1個16 623 nt的開放閱讀框，編碼1個含5 540個氨基酸的多聚蛋白，分子質量為622.4 ku（圖3）。

圖3 RsHV4的基因組結構Fig.3 Genomic structure of RsHV4

使用Motif 在線網(wǎng)站[MOTIF：Searching Protein Sequence Motifs（genome.jp）]預測，該病毒蛋白質包含1 個核糖核酸酶E（RNase E）區(qū)域（313—460 aa）、1個DEXH 解 旋 酶 結 構 域（824—968 aa）、1 個DEAD-box 解旋酶家族的C 端解旋酶結構域（1 059—1 149 aa）、1個具有保守WHH 的HNH 核酸酶（3 269—3 295 aa）、1 個病毒RNA 依賴的RNA 聚合酶（4 086—4 134 aa）以及1 個DEAD-box 解旋酶家族的N端解旋酶結構域（4 806—4 938 aa）（圖3）。

2.3 病毒RsHV4的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定RsHV4 的分類地位，以RsHV4 的多聚蛋白（Polyprotein）氨基酸序列進行BLASTp 比對，其編碼的蛋白質與該屬的Sclerotium rolfsii hypovirus 1 編碼的蛋白質的同源性最高，為59.46%；選取同源性高的序列，使用MEGA 7.0 軟件以鄰接法（NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，病毒RsHV4 與減毒病毒科（Hypoviridae）θ-減毒病毒屬（Thetahypovirus）病毒聚在一支，親緣關系最近，與減毒病毒科中其他的病毒成員聚在一大支，親緣關系較近（圖4）。使用SDTv 1.2 制作多序列比對矩陣，結果顯示，RsHV4 與減毒病毒科θ-減毒病毒屬病毒Sclerotium rolfsii hypovirus 1的相似性最高（圖5）。綜合系統(tǒng)發(fā)育分析和多序列比對結果，說明RsHV4 屬于減毒病毒科（Hypoviridae）θ-減毒病毒屬（Thetahypovirus）的一個新成員。

圖4 RsHV4編碼的多聚蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the amino acid sequence of the polyprotein encoded by RsHV4

圖5 RsHV4編碼的多聚蛋白氨基酸序列多序列比對矩陣圖Fig.5 Multiple sequence alignment matrix of the amino acid sequence of RsHV4-encoded polyprotein

2.4 病毒RsHV4對寄主立枯絲核菌的影響

2.4.1 菌落形態(tài)及生長速度 菌株ZYFG11和菌株JSJH6 在28 ℃培養(yǎng)5 d 后觀察菌落形態(tài)（圖1），兩者菌絲均較細、分隔距離較長，分枝處有溢縮，但相對于對照菌株JSJH6，帶毒菌株ZYFG11 的菌絲稀疏、菌核產(chǎn)生數(shù)量少且體積小。生長速度方面，菌株ZYFG11 的平均生長速度為0.41 cm/h，菌株JSJH6為0.50 cm/h（圖6），差 異 顯 著（P＜0.05）。說 明RsHV4 對菌株ZYFG11 的生長、菌落形態(tài)等產(chǎn)生一定影響。

圖6 菌株ZYFG11的生長速率測定Fig.6 Growth rate assay of strain ZYFG11

2.4.2 菌核形成以及菌核形態(tài) 菌株ZYFG11 和JSJH6 于28 ℃培養(yǎng)10 d 后收集菌核，各挑取50 顆最大的菌核稱質量，分別為0.11 g和0.27 g（圖7A、B）。此外，如圖7C，菌株ZYFG11 菌核產(chǎn)生的時間較JSJH6慢，JSJH6在培養(yǎng)5 d后就有大量的菌核生成，而菌株ZYFG11 大量菌核生成的時間為7 d。這表明病毒RsHV4 導致菌株ZYFG11 菌核生成速度變慢、菌核的數(shù)量變少、質量和體積變小。

圖7 菌株ZYFG11菌核大小的測定Fig.7 Determination of sclerotium size of strain ZYFG11

2.4.3 致病力 將帶有ZYFG11 和JSJH6 菌絲的短牙簽分別接種在玉米葉片上，套上保鮮膜保濕保溫培養(yǎng)。結果如圖8 所示，A、B、C 分別為健康玉米植株、接種無毒菌株JSJH6 的植株、接種帶毒菌株ZYFG11 的植株，健康植株第2、第3 葉鞘均未發(fā)病，無病斑（圖8A），接種JSJH6 的植株第2、第3 葉鞘發(fā)病嚴重，病斑面積占100%（圖8B），接種ZYFG11 的植株第2 葉鞘發(fā)病較輕，病斑面積占30%，第3 葉鞘發(fā)病輕，病斑面積占10%（圖8C）。含毒菌株ZYFG11 接種的玉米植株產(chǎn)生病斑面積明顯小于無毒菌株JSJH6 接種引起的病斑面積，說明帶毒菌株ZYFG11的致病力顯著降低。

圖8 菌株ZYFG11的致病性檢測Fig.8 Pathogenicity assay of strain ZYFG11

3 結論與討論

本研究從玉米紋枯病菌（R.solani）菌株ZYFG11 中發(fā)現(xiàn)一種新的減毒病毒科病毒，命名為RsHV4。RsHV4 可以使菌株的菌絲生成減少、生長速度變慢，菌核的生成速度變慢、數(shù)量變少、體積和質量變小，明顯降低其對玉米的致病力，說明RsHV4 具有減毒活性。目前，在立枯絲核菌中已發(fā)現(xiàn)11 種減毒病毒科病毒，其中RsHV1、RsHV2 和RsHV3 被報道了基因組結構[22]，RsHV2 還被報道了病毒間基因的水平轉移[26]，另外7 種病毒僅有序列的登錄信息，這11 種減毒病毒是否有減毒活性未知。本研究報道的RsHV4 是立枯絲核菌中減毒病毒科的新成員，可以影響寄主的生長表型，降低寄主的致病力，是立枯絲核菌中第一個發(fā)現(xiàn)有減毒活性的減毒病毒科病毒，具有潛在的生防能力。

立枯絲核菌中普遍存在多種病毒混合侵染的情況，但是它們之間的關系和對寄主的影響并不清楚[27]。2023 年，筆者所在課題組在菌株ZYFG23 中發(fā)現(xiàn)RsHV4 和它的另外一個分離物RsHV4-ZYFG23（登錄號：ON077161，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）混合侵染。由于未能檢測到單獨攜帶RsHV4-ZYFG23 的菌株，因此無法確定該分離物對寄主的影響。值得關注的是，RsHV4 兩個分離物同時存在于一個菌株中，兩者之間的關系以及其生物學意義亟待研究。

立枯絲核菌主要以直接穿透葉鞘表皮的方式侵入寄主[28]，同時分泌胞壁降解酶和毒素等物質以分解、殺死植物細胞，獲取營養(yǎng)物質供自身生長發(fā)育[29-32]。紋枯病菌侵染植物時產(chǎn)生的代謝物質是重要的致病因子，致病過程是由酶、毒素或其他代謝產(chǎn)物協(xié)同完成的[33-36]。RsHV4 侵染寄主后，導致寄主真菌生長速率變慢、菌核變小、致病力減弱，可能是由于RsHV4影響了寄主代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生所致，但具體的作用機制還需進一步研究。

近些年來，隨著新一代測序技術的發(fā)展，越來越多的真菌病毒被發(fā)現(xiàn)。新病毒的發(fā)現(xiàn)有利于了解病毒的進化和分類，有些真菌病毒具有降低病原菌致病力的作用，在真菌病害防治上有著潛在的價值，可以作為潛在的生物防治資源進行開發(fā)利用。