基于COI 條形碼的市售蟬蛻及其混淆品DNA 分子鑒定研究

張歡歡，徐金娣，周 靜，賈聰玲，吳啟南，郭夢斐，沈紀晨，伍城穎，李松林*，毛 茜*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院/中國中醫(yī)科院江蘇分院 中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

蟬蛻為黑蚱CryptotympanapustulataFabricius，若蟲羽化時蛻下的皮殼，是我國重要的蟲類動物類藥材，在我國已有近兩千年的臨床應(yīng)用歷史[1-3]。具有疏散風(fēng)熱、利咽透疹、平喘等功效，臨床常用于風(fēng)熱感冒、咽痛音啞、咳喘等癥[4-6]。

蟬蛻不僅是醫(yī)院藥房常用的中藥材，也是眾多中藥制劑的重要原料，如蘇黃止咳膠囊、黃氏響聲丸、克感利咽口服液、開喉劍噴霧劑等經(jīng)典中成藥均以蟬蛻為原料。蟬蛻療效明確，臨床使用量逐年攀升。但蟬蛻為野生動物資源，隨著森林覆蓋面積的減少，其法定基原動物黑蚱的自然棲息地也日益縮減，使得蟬蛻藥材資源逐年減少，市場價格居高不下，各地藥材市場中也出現(xiàn)了較多蟬蛻混淆品和習(xí)用品。根據(jù)文獻報道和課題組前期對蟬蛻全國藥材市場的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)當前蟬蛻基原動物除《中國藥典》規(guī)定的黑蚱外，華南蚱蟬、鳴蟬、蟪蛄等多種蟬的皮殼也作為蟬蛻藥用[7]。不同品種蟬蛻外觀性狀多相似，難以根據(jù)主觀經(jīng)驗從性狀上進行準確辨別，且蟬蛻質(zhì)輕，易碎，經(jīng)采收、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)后，皮殼因擠壓常出現(xiàn)破碎，難以鑒別。因此，對蟬蛻藥材及其混淆品進行快速準確地鑒定，將對保障蟬蛻質(zhì)量和臨床療效有十分重要的應(yīng)用價值。

DNA 條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA 片段來進行物種鑒定的分子診斷技術(shù)，不依賴物種的形態(tài)特征和分類經(jīng)驗[8-12]。2013 年，陳士林研究團隊在前期大量研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以動物細胞色素C 氧化酶I（cytochrome oxidase I，COI）序列為核心的動物類藥材DNA 條形碼鑒定體系[13]。國家藥典委員會已經(jīng)將中藥材DNA 條形碼分子鑒定指南納入《中國藥典》增補本[14]，規(guī)定動物類藥材的DNA條形碼鑒定以COI 序列為主[13-14]。COI 在能夠保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增，其DNA 序列本身很少存在插入和缺失[15]。目前，物種鑒定手段在動物類藥材鑒定方面已有廣泛應(yīng)用[16-24]。但國內(nèi)尚未有運用COI 序列鑒定蟬蛻及其混淆品的報道。

本研究利用COI序列對蟬蛻及其混淆品進行鑒別研究，結(jié)合從Genbank 所得的序列分析藥材的正品與混淆品之間的遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹中物種的聚類情況，考察利用COI 序列鑒別蟬蛻與其混淆品的可行性，以期利用DNA 條形碼技術(shù)為準確鑒定蟬蛻基原提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

2020 年6 月～2023 年7 月，從全國各地收集蟬蛻商品藥材及其混淆品28 批，從江蘇徐州沛縣黑蚱野生撫育基地、河南、山東等地自采藥材17 批，由江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林教授依據(jù)《中國藥典》[1]、《中國蟬科志》[2]和《中國藥用動物志》[3]鑒定基原物種分別為黑蚱蟬蛻C.atrataFabricius.、震旦大馬蟬蛻MacrosemiapieliKato、南蚱蟬蛻C.holstiFabr.、陽明山螗蟬蛻TannasozanensisKato。另從江蘇徐州沛縣黑蚱養(yǎng)殖基地收集不同樹種蟬卵樣品5 份，用于基原確認及實驗陽性對照。憑證樣本和數(shù)字影像信息保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量和代謝組研究室，實驗材料信息見表1、2。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載了相關(guān)的COI 序列共22 條，信息見表3。

表1 市售蟬蛻藥材信息Table 1 Information of commercial Cicadae Periostracum

表2 自采蟬蛻藥材信息Table 2 Information of self-harvested Cicadae Periostracum

表3 GenBank 下載的COI 基因序列信息Table 3 Information of COI gene sequences downloaded from GenBank

1.2 儀器

LEGEND MICRO21R 型高速離心機（美國Thermo 公司）；ABI PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）；DYY-6C 型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；IKA-HB10 型水浴鍋（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑

瓊脂糖凝膠粉（擎科生物有限公司，TSINGKE TSJ001）；染料（翌圣生物有限公司，Yea Red Nucleic Acid Gel Stain 10000X in water）；聚合酶（Vazyme，2×Rapid Taq Master Mix）；引物（生工生物工程有限公司合成）；5 000 bp DNA 相對分子質(zhì)量標準Marker（批號B500351，生工生物工程有限公司）；Zeup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（批號B518251，生工生物工程有限公司），血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（批號DP304，天根生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 蟬蛻基因組DNA 提取

取出蟬蛻樣品，依次用水、70%乙醇洗去附著的泥沙等雜質(zhì)，置于通風(fēng)櫥晾干后放入研缽，使用液氮快速進行研磨，使組織充分破碎呈粉末狀，后續(xù)提取DNA 步驟按照基因組DNA 提取試劑盒提取各樣品總DNA，提取過程中蟬卵樣品水浴1 h，蟬蛻樣品較難裂解，水浴時間適當延長至3～4 h。

2.2 COI 基因的PCR 擴增

依據(jù)《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》，采用 COI 通用引物（ LCOI490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 與 HCO2198: 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ） 和COI 序列藥典擴增程序（94 ℃、1 min；94 ℃、1 min，45 ℃、5 min，72 ℃、1.5 min，5 個循環(huán)；94 ℃、1 min，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1 min，35 個循環(huán)；72 ℃、5 min）進行PCR 擴增。20 μL PCR 體系中包括PCR Master Mix 10 μL，引物L(fēng)COI490 與HCO2198 各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 2 μL 以及無菌水6.4 μL。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳及測序

用電子天平稱取0.5 g 瓊脂糖粉，置于裝有50 mL 1×TAE 溶液的錐形瓶中，用微波爐加熱至完全溶解，冷卻片刻后加入5 μL 染料，搖晃至充分混勻，倒入膠槽等待其完全冷卻凝固。取3 μL PCR 擴增產(chǎn)物和DNA Marker 在1%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，電泳儀電壓設(shè)置160 V，時間25 min。在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存，以確定COI 目的序列被準確擴增。PCR 產(chǎn)物進行雙向測序，測序工作委托生工生物工程有限公司完成。本實驗所得序列均已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，登錄號見表4。

表4 黑蚱種內(nèi)變異位點情況Table 4 Intraspecific mutation sites in C.atrata

表4 樣品序列NCBI 登錄號Table 4 NCBI accession numbers of experimental sample sequences

2.4 序列數(shù)據(jù)的拼接及分析

利用DNAMAN 和SnapGene 軟件對測序所得序列及測序峰圖進行檢查，校正及拼接，然后在NCBI 中運用Blast 程序進行相似性檢索，以確定基因片段的準確性并進行物種鑒定，保留相同長度的同源序列用于后續(xù)遺傳分析。利用MEGA 11.0 和DnaSP6 軟件統(tǒng)計分析黑蚱種內(nèi)變異位點、堿基組成情況及蟬蛻相對于混淆品的標志性位點。將確定的序列以及GenBank 下載的22 個蟬科（Cicadidae）物種的序列用MEGA 11.0 軟件基于ClustalW 算法進行多序列比對，整理所得數(shù)據(jù)，分析序列類型，計算和分析種內(nèi)和種間的K2P 遺傳距離。選擇帶櫟角蟬Platycotisvittata作為發(fā)育樹的外類群，利用鄰接法（neighbor-joining method，NJ），選擇K2P 遺傳距離模型，同時采用Bootstrap 重復(fù)抽樣1 000 次用以檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度，對所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA 提取及PCR 擴增

首先對從徐州黑蚱養(yǎng)殖基地不同樹種上隨機采集的5種蟬卵樣品進行了DNA鑒定分析，蟬卵DNA提取質(zhì)量濃度較高，可達500～1 000 ng/μL，PCR 擴增均可成功擴增出目的條帶，不同樹種蟬卵均鑒定為黑蚱，確定了徐州養(yǎng)殖基地的蟬蛻原動物品種為藥典規(guī)定基原品種黑蚱，見圖1。

圖1 蟬卵樣品形態(tài)及PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Morphological diagram of cicada eggs and the results of PCR amplification

后續(xù)使用蟬蛻樣品進行實驗，以蟬卵樣品L3 作為陽性對照。蟬蛻DNA 提取結(jié)果顯示（圖2），提取的蟬蛻樣品DNA 質(zhì)量濃度大多在20～40 ng/μL，擴增后少部分樣品出現(xiàn)擴增失敗的現(xiàn)象，但總體上大多數(shù)樣品可成功擴出目的條帶，將擴增成功樣品送至生工公司測序，本實驗共獲得蟬蛻樣品DNA 序列45 條。

圖2 各樣品PCR 擴增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of each sample

3.2 黑蚱單倍型分析及標志性位點分析

黑蚱的34 條種內(nèi)序列，其序列長度為658 bp，所有位點中，A、G、C 和T 堿基平均含量分別為26%、16.7%、13.9%和43.4%，GC 含量為30.1%～30.8%，平均GC 含量為30.6%，A＋T 含量明顯高于G＋C 含量，表現(xiàn)為明顯的A＋T 堿基偏嗜，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征[25]。序列分為11 個單倍型（A1～A11），A3 為主要單倍型，有16 個樣品。序列共638 個保守位點，20 個突變位點（15 個簡約信息位點，5 個單突變位點），其轉(zhuǎn)換/顛換值為5.67，變異位點詳細情況見表4。黑蚱單倍型多樣性（Hd）為0.761 1，核苷酸多樣性（Pi）為0.008 51，意味著本實驗黑蚱種群是由多個地方種群混合而成的大而穩(wěn)定的群體（單倍型多樣性以0.5 為臨界值，核苷酸多樣性以0.005 為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高）[20]。

對黑蚱的11 個單倍型序列以及混淆品序列進行比對分析并篩選黑蚱序列的標志性位點，統(tǒng)計出黑蚱的標志性位點共有9 處，分別位于黑蚱序列的第136、157、169、312、322、352、424、514、532 bp 處，其中，在136 bp 與157 bp 處，黑蚱所有序列的堿基均為C，而混淆品序列的堿基均為T；在312 bp 處，黑蚱堿基為A，而混淆品序列堿基均為G。在這9 處位點中，黑蚱的所有單倍型序列一致并與所有混淆品序列不同，可考慮作為黑蚱的標志性位點與其他混偽品區(qū)分，詳細位點信息見表5。

表5 黑蚱標志性位點情況Table 5 Iconic sites in C.atrata

3.3 K2P 遺傳距離分析

基于K2P 雙參數(shù)模型的黑蚱種內(nèi)種間遺傳距離見表6，對不同種類蟬蛻樣本進行分析，顯示種內(nèi)遺傳距離0～0.018 4，平均0.006 1，種間遺傳距離0.077 7～2 383，平均0.190 5，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的31.18 倍，種內(nèi)最大遺傳距離遠小于種間最小遺傳距離，能形成一定的DNA 條形碼間隙。其中中華螓蟬和綠草蟬種間遺傳距離最大，為0.238 3，南蚱蟬和帶蚱蟬種間遺傳距離最小，為0.077 7，均大于Hebert 等[26]所推薦的物種鑒定最小種間距離0.020，顯示各自在分子水平已達到種級水平的分化。

表6 黑蚱及其混淆品種群內(nèi) (對角線值) 及種群間遺傳距離Table 6 Genetic distance within (diagonal value) and among populations of C.atrata and its adulterants

3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3，從NJ 樹圖可以看出，10 種蟬類主要形成3 個類群，類群Ⅰ包括黑蚱（GP-1）、南蚱蟬（GP-3）、帶蚱蟬（GP-5）和中華螓蟬（GP-8），黑蚱與南蚱蟬和帶蚱蟬親緣關(guān)系較近，聚為一支，且進化地位較高，位于進化樹上部，置信度為99%，其中南蚱蟬和帶蚱蟬以78%的置信度聚為一亞支。類群II 包括蒙古寒蟬（GP-9）、松寒蟬（GP-6）、震旦大馬蟬（GP-2）和陽明山螗蟬（GP-4），其中蒙古寒蟬與松寒蟬以高支持率（93%）聚為姐妹分支，顯示親緣關(guān)系較近。類群III 包括蟪蛄（GP-7）與綠草蟬（GP-10），其與黑蚱及其他幾種蟬類親緣關(guān)系較遠。物種之間可明顯分開，可以清晰地區(qū)分黑蚱及其混淆品和近緣種，說明該段序列能夠作為黑蚱分子鑒定的依據(jù)。

圖3 基于COI 序列構(gòu)建的蟬蛻及其混淆品的NJ 樹Fig.3 NJ tree of C.atrata and its adulterants based on COI gene sequence

4 討論

近年來蟬蛻的臨床應(yīng)用范圍日益擴大，但當前蟬蛻品種混亂，《中國藥典》中僅有性狀描述，難以準確鑒定。現(xiàn)有蟬蛻的鑒定研究局限于性狀、顯微鑒定，如牛躍華等[27]對浙江產(chǎn)蟬蛻和三種近緣種蟬蛻進行了性狀比較研究，并系統(tǒng)地總結(jié)了性狀特征。苑冬敏等[28]以動物藥殘留毛的顯微特征，如剛毛的直徑、長度、毛窩直徑等參數(shù)為依據(jù)，對中藥蟬蛻及其易混淆品進行了鑒別。郭利霄等[29]運用3D景深合成技術(shù)，從蟬蛻樣品喙的長短，上、下唇突出的程度及其上橫溝的顏色、足部主刺和側(cè)刺的數(shù)量等方面對50 批蟬蛻及其混淆品樣品進行鑒別。傳統(tǒng)性狀鑒定方法依賴主觀經(jīng)驗，對鑒定人的專業(yè)素質(zhì)要求較高，且培養(yǎng)周期長；顯微鑒定在近緣種動物藥材鑒定上存在一定局限性。因此，基于COI條形碼的DNA 分子鑒定技術(shù)以其準確、快速鑒定物種的特點，在眾多動物類藥材與其混偽品的鑒別研究中，如蛇蛻、梅花鹿皮、穿山甲、龜甲，展現(xiàn)出了優(yōu)良的鑒定能力。但國內(nèi)尚未有運用COI 序列鑒定蟬蛻與其混淆品的相關(guān)報道。

蟬蛻采收后需干燥保存，且藥材多附著泥沙等雜質(zhì)，存儲過程中表面易發(fā)生蟲蛀或霉變，導(dǎo)致提取的DNA 濃度較低，提取困難。獲取高質(zhì)量DNA是DNA 分子鑒定的基礎(chǔ)[30]。劉旭朝等[31]通過對動物藥材DNA 提取方法進行優(yōu)化，使用優(yōu)化的裂解液配方，實現(xiàn)了對蟬蛻等提取困難樣本DNA 的提取。但本研究發(fā)現(xiàn)，使用SDS 法自配試劑提取DNA有一定的局限性，比如在用乙醇洗滌DNA 沉淀時，由于蟬蛻DNA 含量較低，常常看不到沉淀產(chǎn)生或者沉淀較少，在吸去液體時容易造成DNA 損耗，使得提取DNA 效率很低。為得到優(yōu)良的DNA 模板，本研究反復(fù)實驗及優(yōu)化調(diào)整，發(fā)現(xiàn)提取DNA 時應(yīng)選擇無蟲蛀、無霉變的藥材；并對蟬蛻進行樣品前處理，依次用水、75%的乙醇清洗表面，盡量去除泥沙等雜質(zhì)；研磨應(yīng)迅速、充分，研磨的越細越有利于消化；取樣量適當（20～30 mg，不宜過多或過少）；水浴時間延長至3 h 及以上，使細胞充分裂解釋放DNA；將原有試劑盒中洗滌的操作重復(fù)1次，可更好去除蛋白質(zhì)。

本研究運用COI 通用引物，優(yōu)化DNA 提取過程，成功擴增出45 批蟬蛻正品及混淆品COI 條形碼序列。K2P 遺傳距離分析表明黑蚱種間平均遺傳距離是種內(nèi)的31.18 倍，種內(nèi)最大遺傳距離遠小于種間最小遺傳距離，能形成一定的DNA 條形碼間隙。NJ 樹結(jié)果表明黑蚱及其他幾種蟬類親緣關(guān)系較遠，物種之間可明顯分開，表明COI 序列針對黑蚱和混淆品的區(qū)分有效。由此可見，基于COI 序列的DNA 條形碼技術(shù)能高效、準確地鑒別中藥材蟬蛻及其混淆品，可有效保障蟬蛻藥材質(zhì)量及其臨床有效性。在NJ 樹結(jié)果分析中還發(fā)現(xiàn)，黑蚱聚為一類，其中大部分江蘇產(chǎn)地的黑蚱樣品序列在同一亞支，河南、山東等產(chǎn)地的黑蚱樣品序列分別聚在另一亞支，呈現(xiàn)了依產(chǎn)地聚類的趨勢，表明黑蚱的不同地理種群可能存在差異性。后續(xù)將繼續(xù)收集各產(chǎn)地的樣本，進一步對黑蚱的遺傳多樣性進行分析研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突